回乳抑增一號(hào)對(duì)乳腺增生大鼠激素受體及細(xì)胞增殖、凋亡的影響

孟軍華，安 靖，王 雄，陳永剛，張 宇，張恩景

［武漢市第三醫(yī)院（武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院） 藥學(xué)部，湖北 武漢430060]

乳腺增生癥多發(fā)生于30～50 歲女性，致病原因主要是內(nèi)分泌功能紊亂，雌、孕激素比例失調(diào)，使乳腺實(shí)質(zhì)增生過度和復(fù)舊不全［1]，中醫(yī)稱之為“乳癖”，臨床辨證多分為肝郁氣滯型、沖任失調(diào)型和痰瘀互結(jié)型［2]?；厝橐衷鲆惶?hào)是武漢市第三醫(yī)院治療乳腺增生的經(jīng)驗(yàn)方，具有回乳消脹、軟堅(jiān)散結(jié)、行氣活血之功效。前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)回乳抑增一號(hào)能顯著縮小乳腺增生大鼠的乳房直徑，調(diào)節(jié)各種性激素水平［3]；本研究通過觀察回乳抑增一號(hào)對(duì)乳腺增生大鼠乳腺組織雌激素受體α（ERα）、孕激素受體（PR）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控因子Bcl-2、Bax 表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討該方作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用健康清潔級(jí)雌性未孕SD 大鼠（SPF 級(jí)）56 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2008-0005，于SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.2 試劑與藥物 獸用苯甲酸雌二醇注射液（寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號(hào)B131204）；黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)140620）；乳癖散結(jié)膠囊（陜西白鹿制藥股份有限公司，批號(hào)150512）；他莫昔芬片（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)15050811）。Trizol Reagent（美國Invitrogen Life Technologies 公司，批號(hào)15596-026）；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國 Thermo 公司，批號(hào)＃ K1622）；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（瑞士Roche 公司，批號(hào)04913914001）；BSA（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)A8020）；VEGF Rabbit PAb（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)00080369）；Bcl-2 Rabbit mAb（上海賽信通生物試劑有限公司，批號(hào)＃2870）；CA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)G2026）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（批號(hào)G2003）、PCNA Rabbit pAb（批號(hào)GB11010）、HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（批號(hào)GB23303）、Bax Rabbit pAb（批號(hào)GB11007-1）、兩步法免疫組化試劑盒（批號(hào)G1210），均購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

回乳抑增一號(hào)組方藥材生麥芽、牡蠣、浙貝母、夏枯草、白芥子、山慈菇、昆布、郁金、玄參、丹參均由湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司提供，經(jīng)武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部中藥檢驗(yàn)室鑒定為正品，均符合2020 版《中國藥典》 規(guī)定。上述藥材經(jīng)過浸泡后重復(fù)煎煮2 次，濃縮至含生藥3.16 g/mL，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器 Neofuge15R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（香港Heal Force 公司）；Stepone plus 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）；FBZ2001-up-p 標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）；V300掃描儀（日本Epson 公司）；alphaEaseFC 灰度分析軟件（美國Alpha Innotech 公司）；JB-P5 包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；XSP-C204 顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；ECLIPSE TI-SR 正置熒光顯微鏡、DS-U3 成像系統(tǒng)（尼康儀器上海有限公司）。

1.4 造模與分組 雌性未孕SD 大鼠56 只，常規(guī)喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成正常組，模型組，中藥陽性對(duì)照組（乳癖散結(jié)組），西藥陽性對(duì)照組（他莫昔芬組），回乳抑增一號(hào)低、中、高劑量組，每組8只，造模方法參照文獻(xiàn)的外源性激素苯甲酸雌二醇及黃體酮聯(lián)合復(fù)制造模法［4]，正常組按每只0.1 mL生理鹽水于大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射，每天1 次，其余各組大鼠每天肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，連續(xù)25 d，再每天肌肉注射黃體酮注射液5 mg/kg，連續(xù)5 d。

1.5 給藥 造模完成后，正常組和模型組大鼠每天給予10 mL/kg 蒸餾水灌胃，乳癖散結(jié)組大鼠給予0.5 g/kg 混懸液，他莫昔芬組大鼠給予1.57 mg/kg混懸液，回乳抑增一號(hào)低、中、高劑量組大鼠分別按7.9、15.8、31.6 g/kg劑量灌服，每天1 次，連續(xù)30 d。

1.6 指標(biāo)觀察

1.6.1 乳腺組織病理學(xué) 造模完成后，每組各隨機(jī)抽取1 只大鼠，二氧化碳處死，對(duì)乳腺組織進(jìn)行病理學(xué)組織切片，HE 染色觀察。

1.6.2 熒光定量PCR 法檢測(cè)大鼠乳腺組織ERα、PR mRNA 表達(dá) 取大鼠乳腺組織，采用Trizol 法提取乳腺組織總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，定量PCR，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，40 個(gè)循環(huán)，PCR儀采集熒光信號(hào)。以β-actin 為內(nèi)參照基因進(jìn)行校準(zhǔn)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算表達(dá)量。引物信息見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6.3 大鼠乳腺組織PCNA、VEGF 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測(cè) RIPA 裂解法抽提乳腺組織總蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%牛奶封閉PVDF 膜1 h，一抗PCNA 多克隆抗體、VEGF 多克隆抗體稀釋1 000倍，4 ℃孵育抗體3 h，然后TBST 清洗3 次。將二抗HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG 用TBST 稀釋3 000 倍，室溫下孵育30 min 后，用TBST 在室溫下脫色搖床上洗3 次，每次5 min。然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop 整理去色，Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.6.4 免疫組化檢測(cè)Bcl-2、Bax 表達(dá) 取大鼠第2 對(duì)乳腺組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)制片，采用免疫組化法檢測(cè)。Image pro-plus 6.0 軟件分析免疫組化圖片，每張切片隨機(jī)挑選5 個(gè)200 倍視野拍照，拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，應(yīng)用IPP軟件測(cè)定陽性表達(dá)面積及積分光密度值，算出單位面積平均光密度值（IOD/unit area）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素ANOVA 分析。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠乳腺組織病理學(xué)觀察 正常組大鼠乳腺組織腺泡分布均勻，小葉少見，導(dǎo)管形態(tài)正常，未見擴(kuò)張；模型組大鼠病理特征明顯，乳腺小葉面積增大，乳腺導(dǎo)管增生，腺泡數(shù)量增多，腺腔中可見大量分泌物，說明造模成功，見圖1。

圖1 大鼠乳腺組織病理形態(tài)（HE，×40）Fig.1 Pathological morphologies of rat mammary gland tissues（HE，×40）

2.2 對(duì)大鼠乳腺組織ERα、PR mRNA 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組ERα、PR mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組ERα、PR mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠乳腺組織ERα、 PR mRNA 表達(dá)（，n=7）Tab.2 Expressions of ERα and PR mRNA in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

表2 各組大鼠乳腺組織ERα、 PR mRNA 表達(dá)（，n=7）Tab.2 Expressions of ERα and PR mRNA in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

2.3 對(duì)大鼠乳腺組織VEGF、PCNA 蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠乳腺組織PCNA、VEGF 蛋白表達(dá)量較正常組升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組均能下調(diào)PCNA、VEGF 蛋白表達(dá)（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠乳腺組織VEGF、PCNA 蛋白表達(dá)（，n=7）Fig.2 VEGF and PCNA protein expressions in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

2.4 對(duì)大鼠乳腺組織Bcl-2 和Bax 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組Bcl-2 表達(dá)升高（P＜0.01），Bax 表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組均能下調(diào)Bcl-2 表達(dá)（P＜0.01），上調(diào)Bax 表達(dá)（P＜0.01），見圖3～4、表3。

表3 各組大鼠乳腺組織Bal-2、Bax 表達(dá)（，n=7）Tab.3 Bcl-2 and Bax expressions in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

表3 各組大鼠乳腺組織Bal-2、Bax 表達(dá)（，n=7）Tab.3 Bcl-2 and Bax expressions in rat mammary gland tissues in various groups（，n=7）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

圖3 免疫組化法檢測(cè)各組大鼠乳腺組織中Bcl-2 表達(dá)（×200）Fig.3 Bcl-2 expressions in rat mammary gland tissues in various groups by immunohistochemistry（×200）

3 討論

乳腺增生是臨床上最常見的良性乳腺疾病，臨床表現(xiàn)是乳腺疼痛、結(jié)節(jié)狀態(tài)或腫塊，部分病人合并乳頭溢液，有一定的癌變危險(xiǎn)［1]。中醫(yī)藥治療乳腺增生在臨床的應(yīng)用日益廣泛，其作用機(jī)制是多靶點(diǎn)、多方位的發(fā)揮作用［5-7]。乳腺組織中雌激素含量增高，誘導(dǎo)體內(nèi)合成ER 與PR 增多，而ER、PR 的增加會(huì)提高乳腺上皮細(xì)胞對(duì)雌激素的敏感性，導(dǎo)致乳腺增生的發(fā)生［8]。ER 分為ERα、ERβ，在ERα 基因敲除小鼠中證實(shí)，ERα 影響乳腺上皮細(xì)胞的增值與分化，是參與到小鼠乳腺腺泡不良病變的必要因素［9-11]。

圖4 免疫組化法檢測(cè)各組大鼠乳腺組織中Bax 表達(dá)（×200）Fig.4 Bax expressions in rat mammary gland tissues in various groups by immunohistochemistry（×200）

雌激素能使細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶EPK1/2 磷酸化，增加VEGF 的表達(dá)，引起乳腺組織中血管增生，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖［12]。PCNA 的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，PCNA 指數(shù)已被列為評(píng)價(jià)細(xì)胞是否處于增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)之一［13]。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)細(xì)胞增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡。乳腺增生的發(fā)病、加重、甚至癌變的過程就是乳腺上皮細(xì)胞增殖過度以及凋亡減弱的結(jié)果［14]，細(xì)胞凋亡與凋亡因子密切相關(guān)，Bcl-2 和Bax 分別為抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白。

回乳抑增一號(hào)方中用活血、消痰、散結(jié)藥配伍共同起到治療乳腺增生作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)回乳抑增一號(hào)能顯著下調(diào)乳腺增生模型大鼠ERα、PR基因表達(dá)，阻斷其與雌激素結(jié)合而產(chǎn)生的生物效應(yīng)。與模型組比較，回乳抑增一號(hào)三個(gè)劑量組均能顯著下調(diào)乳腺增生大鼠ERα mRNA 水平，而中劑量組對(duì)ERα 的調(diào)節(jié)作用更接近正常組，與正常組比較，回乳抑增中劑量組與他莫昔芬組ERα mRNA水平與正常組無顯著差異，回乳抑增一號(hào)對(duì)ERα的調(diào)節(jié)作用與劑量有關(guān)，中劑量組作用優(yōu)于高劑量組，從復(fù)方中分析其原因，方中麥芽用量較大，高劑量組麥芽已遠(yuǎn)超常規(guī)用量，可能影響了ERα 的下調(diào)作用，需要進(jìn)一步研究麥芽劑量對(duì)乳腺ERα的影響。同時(shí)回乳抑增一號(hào)降低模型組大鼠乳腺組織VEGF、PCNA、Bcl-2 表達(dá)，上調(diào)Bax 表達(dá)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的增殖與凋亡產(chǎn)生影響，減緩乳腺增生大鼠的細(xì)胞增殖過程及激活細(xì)胞凋亡，綜合發(fā)揮治療乳腺增生的作用。