禾谷炭疽菌內(nèi)吞相關(guān)蛋白找尋及其生物信息學(xué)

覃 悅，韓長(zhǎng)志

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，昆明 650224； 2. 西南林業(yè)大學(xué)研究生院，昆明 650224； 3. 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(receptor-mediated endocytosis)是生物體中大多數(shù)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)物質(zhì)內(nèi)吞的重要途徑之一[1-2]，該作用是由直徑約100 nm小泡產(chǎn)生介導(dǎo)的，小泡具有由胞漿蛋白網(wǎng)格蛋白組成的形態(tài)特征性被膜[3]。在模式生物真菌研究中，內(nèi)吞與其細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育以及分化等各個(gè)過(guò)程密切相關(guān)。前人研究表明，模式真菌(釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉等)中含有NPFxD基序的蛋白參與內(nèi)吞靶向信號(hào)過(guò)程，該信號(hào)在實(shí)現(xiàn)含有特征化弗林蛋白酶樣蛋白酶Kex2p胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白過(guò)程發(fā)揮重要作用[4]。同時(shí)，真菌的包被網(wǎng)格蛋白囊泡(CCV)廣泛存在于細(xì)胞中，并形成質(zhì)膜的區(qū)域，該區(qū)域可濃縮具有不同受體的大細(xì)胞外分子，不同受體則負(fù)責(zé)配體的低密度脂蛋白、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和抗體等受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[5]，并通過(guò)CCV攝取的蛋白質(zhì)通常具有內(nèi)吞靶向信號(hào)，可直接摻入新囊泡中[6]。

表 1 禾谷炭疽菌中NPFxD基序蛋白的基本信息及獲取方法Table1 Basic information and method of obtaining NPFxD motif protein in C. graminicola

禾谷炭疽菌Colletotrichumgraminicola(Cesati)Wilson是一種半活體營(yíng)養(yǎng)病原菌，主要危害玉米、小麥等農(nóng)作物[7-9]，也可定殖并感染藍(lán)草、黑麥草和羊茅等禾本科植物上，嚴(yán)重危害著禾本科作物的健康生產(chǎn)，影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。隨著該菌全基因組序列的釋放[10]，前人對(duì)其分泌蛋白、G蛋白信號(hào)通路蛋白、MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)途徑蛋白[11]、RGS(G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白)[12]等進(jìn)行了預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步明確上述蛋白在該病菌致病過(guò)程中的功能解析奠定了理論基礎(chǔ)。然而，尚未見(jiàn)有關(guān)禾谷炭疽菌中存在具有NPFxD基序的蛋白情況及其生物信息學(xué)分析的研究報(bào)道，嚴(yán)重制約著植物病原絲狀真菌中內(nèi)吞相關(guān)蛋白的功能研究。

因此，基于前人報(bào)道，現(xiàn)利用模式生物構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans中具有NPFxD基序的蛋白氨基酸序列[13]，通過(guò)在禾谷炭疽菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp比對(duì)分析，同時(shí)，利用關(guān)鍵詞在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，明確C.graminicola中NPFxD基序蛋白序列，并對(duì)上述序列開(kāi)展跨膜結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析，以及結(jié)合其他植物病原絲狀真菌中的NPFxD基序蛋白同源的氨基酸序列，開(kāi)展遺傳關(guān)系分析，為進(jìn)一步開(kāi)展同屬于炭疽菌屬但其基因組序列尚未公布的核桃炭疽病菌相關(guān)內(nèi)吞蛋白研究提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 禾谷炭疽菌NPFxD蛋白序列獲取

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載禾谷炭疽菌的蛋白質(zhì)序列，利用EMBOSS fuzzpro[14]預(yù)測(cè)程序獲取該菌中具有NPFxD保守基序的蛋白質(zhì)序列，同時(shí)，利用“NPFxD”“NPFxD-mediated endocytosis”等關(guān)鍵詞對(duì)禾谷炭疽菌蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，此外，以A.nidulans中具有NPFxD基序的蛋白序列[13]為基礎(chǔ)，進(jìn)行Blastp比對(duì)分析，對(duì)上述所獲得序列進(jìn)行匯總、去重，最終明確禾谷炭疽菌中NPFxD基序蛋白以及相關(guān)信息(圖 1)。

圖 1 禾谷炭疽菌NPFxD基序蛋白獲取方法Fig.1 Method for obtaining NPFxD motif protein in C. graminicola

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 跨膜預(yù)測(cè)

利用在線跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站HMMTOP version 2.0[15]和TMHMM Server v. 2.0[16]對(duì)NPFxD基序蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用在線保守結(jié)構(gòu)域特征分析軟件SMART[17]對(duì)NPFxD基序蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 亞細(xì)胞定位分析

利用亞細(xì)胞定位分析軟件ProtComp v9.0[18]對(duì)NPFxD基序蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，并繪制定位情況。

1.2.4 理化性質(zhì)分析

利用理化性質(zhì)測(cè)定程序Protscale[19]對(duì)NPFxD基序蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5 轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽分析軟件TargetP 1.1 Server[20]對(duì)NPFxD基序蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)；同時(shí)，利用蛋白質(zhì)信號(hào)肽軟件SignalP 5.0 Server[16]對(duì)NPFxD基序蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件PHD[21]對(duì)NPFxD基序蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.7 遺傳關(guān)系進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在NCBI中在線進(jìn)行Blastp同源搜索獲取同源序列，并利用ClustalX[22]和MEGA X軟件[23]分別對(duì)其進(jìn)行多重比對(duì)分析以及構(gòu)建遺傳關(guān)系進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷炭疽菌NPFxD基序蛋白找尋及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

前人對(duì)構(gòu)巢曲霉開(kāi)展了NPFxD基序蛋白的搜索工作[24]，利用EMBOSS fuzzpro軟件對(duì)禾谷炭疽菌全部蛋白質(zhì)序列進(jìn)行掃描分析，結(jié)果獲得了33條含有NPFxD基序的蛋白序列，同時(shí)，利用“NPFxD-mediated endocytosis”以及“NPFxD”等關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，未獲得相關(guān)序列，此外，進(jìn)一步利用Blastp比對(duì)分析，獲得了621條同源序列(結(jié)果未顯示)，對(duì)上述蛋白序列進(jìn)行對(duì)比篩選、去除重復(fù)，結(jié)果表明，與A.nidulans同源的C.graminicola中含有NPFxD基序蛋白質(zhì)序列共6條，其蛋白ID分別為GLRG_06102、GLRG_02949、GLRG_02326、GLRG_07742、GLRG_06797、GLRG_08762，根據(jù)同源關(guān)系，將上述所獲得的的NPFxD蛋白分別命名為CgTPO1、CgMYO2、CgCRN3、CgNPF4、CgGBP5、CgTRM6(表 1)。

基于TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)域軟件分析，上述6個(gè)蛋白均不具有跨膜結(jié)構(gòu)域；同時(shí)，進(jìn)一步利用HMMTOP跨膜結(jié)構(gòu)域軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，除CgNPF4、CgGBP5未發(fā)現(xiàn)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域外，其他NPFxD基序蛋白均具有跨膜結(jié)構(gòu)域(表 2)。同時(shí)，利用SMART在線預(yù)測(cè)禾谷炭疽菌中6個(gè)NPFxD基序蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，上述NPFxD基序蛋白序列具有Inositol_P、MYSc、DUF100以及RRM、Methyltransf_4等保守結(jié)構(gòu)域，然而，并未存在同種保守結(jié)構(gòu)域(圖 2)，推測(cè)上述不同類型保守結(jié)構(gòu)域在實(shí)現(xiàn)禾谷炭疽菌內(nèi)吞作用過(guò)程中發(fā)揮著其他特殊作用。

表 2 跨膜情況預(yù)測(cè)Table2 Prediction of transmembrane

2.2 禾谷炭疽菌中NPFxD基序蛋白序列的亞細(xì)胞定位分析

結(jié)合S.cerevisiae、P.oryzae以及其他模式生物，特別是參考SNARE蛋白家族、Rab蛋白家族以及Dynamin家族蛋白等有關(guān)植物絲狀真菌內(nèi)吞信號(hào)的一般途徑，結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)域分析，繪制出C.graminicola中所含的NPFxD亞細(xì)胞定位情況(圖 3)。

圖 2 保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of conserved domains

Yup1、MoVam7、MoSyn8、FgRab51、FgRab52、FgRab7、MoRab7、MoDNM2、MoDNM3、Vps3、Vps8、FgVps39、FgVps41、MoNOX1、MoNOX2分別為 真菌Ustilago maydis、Pyricularia oryzae、P. oryzae、F.graminearum、P. oryzae、Aspergillus nidulans、F.graminearum、P. oryzae中已經(jīng)報(bào)道的蛋白圖 3 亞細(xì)胞定位分析Fig.3 Subcellular localization

2.3 禾谷炭疽菌NPFxD蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

對(duì)禾谷炭疽菌中的6個(gè)NPFxD基序蛋白開(kāi)展氨基酸殘基組成情況分析，結(jié)果表明，CgTPO1、CgGBP5中所含有的G(甘氨酸)氨基酸殘基所占比例較高，分別為11.10%、22.20%；而CgMYO2、CgCRN3、CgNPF4、CgTRM6中含有的A(丙氨酸)氨基酸殘基所占比例較高，分別為9.00%、11.40%、11.10%以及9.40%(表 3)；同時(shí)，對(duì)上述蛋白中含有較低比例的氨基酸殘基進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CgTPO1蛋白中所含有的H(組氨酸)最低，所占比例為1.00%，在CgTRM6蛋白中所含有的W(色氨酸)最低，所占比例為1.00%，在CgMYO2、CgCRN3、CgNPF4、CgGBP5蛋白中所含有的C(半胱氨酸)，所占比例分別為0.60%、0.30%、1.40%和0.20%(表 3)。

進(jìn)一步對(duì)上述NPFxD基序蛋白開(kāi)展理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，在分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、正負(fù)電荷殘基數(shù)以及原子總數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)等理化性質(zhì)方面均存在著較大的不同，盡管如此，上述NPFxD基序蛋白總平均親水性為親水性蛋白，半衰期均為30h，同時(shí)，上述蛋白穩(wěn)定性不盡相同，其中，CgTPO1、CgNPF4和CgGBP5蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，其余2個(gè)蛋白則屬于穩(wěn)定性蛋白(表 4)。

表 3 氨基酸殘基組成情況Table3 Amino acid residues composition

為了進(jìn)一步明確上述6個(gè)NPFxD基序蛋白中氨基酸殘基的親(疏)水性情況，利用疏水性預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同蛋白的最強(qiáng)親(疏)水性殘基及其位置情況、最強(qiáng)親(疏)水性殘基數(shù)值綜合情況均不盡相同，其中，CgTPO1和CgTRM6在最強(qiáng)親水性殘基均為T(蘇氨酸)，而其在最強(qiáng)疏水性殘基的組成上不同；CgTPO1和CgCRN3在最強(qiáng)疏水性殘基均為V(纈氨酸)，CgMYO2和CgTRM6則均為L(zhǎng)(亮氨酸)，上述蛋白在最強(qiáng)親水性殘基上不同(表 5)。

表 4 基本理化性質(zhì)分析Table4 The physicochemical properties

2.4 禾谷炭疽菌NPFxD蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)肽特征

經(jīng)過(guò)TargetP在線分析蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽情況，結(jié)果表明，C. graminicola中的NPFxD基序蛋白中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)定位情況及結(jié)果可靠性情況不盡相同，除CgCRN3和CgNPF4分別定位于線粒體和分泌途徑外，結(jié)合之前所開(kāi)展的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果不一致，同時(shí)，其他4個(gè)蛋白均未得到有效定位情況(表 6)，上述研究結(jié)果有待于進(jìn)一步通過(guò)生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行解析和驗(yàn)證。

由于TMHMM和HMMTOP預(yù)測(cè)程序?qū)τ诘鞍卓缒そY(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)與信號(hào)肽的預(yù)測(cè)之間存在著一定的重疊性，因此，本研究進(jìn)一步利用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件SignalP 5.0對(duì)上述蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明，上述6條蛋白序列中僅有1條序列(CgNPF4)具有明顯的信號(hào)肽，其信號(hào)肽切割位置在17～18 aa，最大切割率為0.949(表 7)。

表 5 親(疏)水性氨基酸殘基位置Table5 Hydrophobic and hydrophilic amino acid residue positions

表 6 潛在轉(zhuǎn)運(yùn)肽的可能性預(yù)測(cè)Table6 Possibility prediction of transit peptides

表 7 含有信號(hào)肽的可能性預(yù)測(cè)Table7 Probability prediction of signal peptide

2.5 禾谷炭疽菌NPFxD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

一般而言，蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)由其氨基酸組成情況決定，而其二級(jí)結(jié)構(gòu)則較好地反映其生化性質(zhì)。為了進(jìn)一步明確禾谷炭疽菌C.graminicola中的NPFxD基序蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)情況，更好地明確其功能情況，對(duì)上述6個(gè)蛋白開(kāi)展了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工作，結(jié)果表明，CgMYO2中所含的α螺旋所占比例較高，為45%；而CgCRN3所含有的β卷曲所占比例較高，為37%；相對(duì)而言，CgMYO2中所含有的β卷曲所占比例則較低，為9%，而CgGBP5中所含有的無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較高，為48%(圖 4)。

圖 4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Secondary structure analysis

2.6 遺傳關(guān)系

為了進(jìn)一步明確不同植物病原真菌中NPFxD基序蛋白的遺傳關(guān)系，以C.graminicola中的CgTPO1、CgMYO2、CgCRN3、CgNPF4、CgGBP5、CgTRM6氨基酸序列為基礎(chǔ)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，同時(shí)，利用ClustalX[22]和MEGA X軟件[23]分別對(duì)上述序列開(kāi)展多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等，結(jié)果表明，在所選擇的30個(gè)蛋白中，分別以C.graminicola中的6個(gè)NPFxD基序蛋白為核心蛋白聚類形成了四大類，同時(shí)，該菌中的NPFxD基序蛋白又與炭疽菌屬真菌(C.sublineola、C.incanum)中相關(guān)蛋白有著較近的親緣關(guān)系，此外，禾谷炭疽菌中的CgMYO2和CgTRM6彼此之間親緣關(guān)系最為緊密，其次為CgTPO1和CgNPF4(圖 5)。

Cc、Ch、ChI、Cf、Ci、Cn、Csh、Csi、Csp、Csu、Cta、Cto、Ctr、Co、CoM、Pg、Pp、Pl、Ps、Po、Sa、Tc、Mm分別為C.higginsianum、C. higginsianum IMI 349063、C. chlorophyti、C. fioriniae PJ7、C. incanum、C. nymphaeae SA-01、C. shisoi、C. sidae、C. spinosum、C. sublineola、C. tanaceti、C. tofieldiae、C. trifolii、C. orchidophilum、C. orbiculare MAFF 240422、P. grisea、P. pennisetigena、Purpureocillium lilacinum、Pyricularia sp. CBS 133598、P. oryzae、Scedosporium apiospermum、Tolypocladium capitatum、Madurella mycetomatis物種的縮寫圖 5 禾谷炭疽菌NPFxD蛋白與其他物種之間的遺傳關(guān)系Fig. 5 Genetic relationship between the NPFxD protein in C. graminicola and other species

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過(guò)關(guān)鍵詞搜索和Blastp比對(duì)分析，明確了C.graminicola中存在6個(gè)與構(gòu)巢曲霉具有高度同源性的NPFxD基序蛋白；并通過(guò)在線分析軟件SMART、SignalP等，對(duì)上述蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，明確上述蛋白在保守結(jié)構(gòu)域方面具有多種不同的保守域，且缺乏較為同一的保守域結(jié)構(gòu)；上述蛋白在信號(hào)肽、理化性質(zhì)、疏水性、亞細(xì)胞定位等方面也存在著明顯的差異性；進(jìn)一步利用上述NPFxD基序蛋白開(kāi)展遺傳關(guān)系分析，明確該菌中NPFxD基序蛋白與炭疽菌屬真菌中的蛋白具有較近的親緣關(guān)系。

3.2 討論

2012年，禾谷炭疽菌的全基因組序列釋放，為進(jìn)一步開(kāi)展其致病因子提供了重要的數(shù)據(jù)支撐[10]。前人基于全基因組序列數(shù)據(jù)，對(duì)該菌中的諸多致病基因開(kāi)展了基因敲除、蛋白生信分析、功能解析等方面的研究，一些如G蛋白偶聯(lián)受體GPCR[25]、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶PI-PLC[26]、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白Pth11[27]、細(xì)胞外膜蛋白CFEM[28]等涉及G蛋白信號(hào)效應(yīng)分子及其特征得到進(jìn)一步明確。上述研究為解析禾谷炭疽菌侵染禾本科植物過(guò)程中，蛋白亞細(xì)胞定位、功能發(fā)揮等方面的深入研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。然而，作為真菌中重要的細(xì)胞活動(dòng)之一——內(nèi)吞，尚缺乏在植物病原絲狀真菌中的解析工作，特別是對(duì)于禾谷炭疽菌中NPFxD基序蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。前人對(duì)于模式真菌中內(nèi)吞作用的研究工作已經(jīng)明確，具有NPFxD基序的蛋白可用于其他正常受體的內(nèi)化過(guò)程，對(duì)于缺乏泛素化位點(diǎn)的受體尤為重要[29]。內(nèi)吞作用可以大量出現(xiàn)在絲狀真菌菌絲尖端，并且菌絲尖端的快速延伸可能需要有效的內(nèi)吞作用[30]。

中外學(xué)者對(duì)內(nèi)吞在模式真菌及植物病原絲狀真菌的菌絲生長(zhǎng)中作用已明確，例如，構(gòu)巢曲霉中存在著諸多內(nèi)吞相關(guān)蛋白，稻瘟菌中內(nèi)吞調(diào)控蛋白可以有效抑制寄主免疫反應(yīng)[31]。結(jié)合前人關(guān)于植物病原絲狀真菌特別是稻瘟病菌中內(nèi)吞機(jī)制調(diào)控蛋白的研究，有理由推測(cè)禾谷炭疽菌在菌絲生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中也很可能與內(nèi)吞機(jī)制調(diào)控有關(guān)。就禾谷炭疽菌與禾本科植物互作而言，當(dāng)禾本科植物通過(guò)各種信號(hào)途徑激活自身防衛(wèi)反應(yīng)后，可以有效地阻止病原真菌在其體內(nèi)的進(jìn)一步擴(kuò)散和傳播；同樣，當(dāng)禾谷炭疽菌中相關(guān)蛋白感應(yīng)到植物的防衛(wèi)反應(yīng)時(shí)，也必將進(jìn)一步采取和調(diào)整相應(yīng)的攻擊方法，如分泌毒素、角質(zhì)酶、果膠酶和纖維素酶等致病因子，進(jìn)一步破壞寄主植物的免疫反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)其與植物之間的此消彼長(zhǎng)“軍備競(jìng)賽”關(guān)系。在上述過(guò)程中，內(nèi)吞作用在禾谷炭疽菌侵染植物以及不同營(yíng)養(yǎng)階段中的地位和作用是什么？其內(nèi)吞作用與植物中解毒物質(zhì)分泌之間的關(guān)系如何？是否還存在其他不同基序的內(nèi)吞蛋白？研究中所獲得NPFxD基序蛋白在保守結(jié)構(gòu)域方面具有其他結(jié)構(gòu)發(fā)揮何種功能？上述問(wèn)題均有待于進(jìn)一步通過(guò)生物學(xué)試驗(yàn)開(kāi)展研究和探討，從而較好地明確禾谷炭疽菌中的內(nèi)吞作用機(jī)制，為進(jìn)一步防控該病菌提供重要的解決思路。