左歸飲“異病同治”早發(fā)性卵巢功能不全、閉經(jīng)、絕經(jīng)綜合征的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究①

陳 衎,唐金艷,馬曉蓉,韓 璐

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,烏魯木齊 830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院婦科,烏魯木齊 830000）

左歸飲由熟地黃、枸杞子、山萸肉、山藥、茯苓、炙甘草6味組成，為純甘壯水之劑，主治真陰不足所致諸癥，臨床上婦科常用其治療早發(fā)性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency，POI)、絕經(jīng)綜合征（Menopause syndrome，MPS)和閉經(jīng)(Amenorrhea)等[1]。中醫(yī)“異病同治”是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的重要組成部分之一，是指不同疾病在其發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)相同病機，故著眼于這一病機，對不同的疾病，采取同一方法治療[2]。由于POI、MPS、閉經(jīng)患者均存在腎陰虛證，具有補陰填精功效的左歸飲在“異病同治”理論基礎(chǔ)上具有一定依據(jù)[3]，但其“異病同治”的具體作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘及分析的一種方法，基于現(xiàn)代生物信息技術(shù)，通過對藥物、活性成分、作用靶點、疾病間的相互關(guān)系，發(fā)掘及闡述中藥治療相關(guān)疾病的潛在作用機制，從客觀角度幫助我們進行中醫(yī)藥的研究[4]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，基于中醫(yī)“異病同治”的理念，探究左歸飲“異病同治”的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 方法

1.1 左歸飲活性成分及靶點蛋白的預(yù)測利用TC?MSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫，分別搜索熟地黃、枸杞子、山萸肉、山藥、茯苓、炙甘草的主要化學(xué)成分，對比藥物動力學(xué)參數(shù)（ADME），將其標準設(shè)定為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，初步挑選左歸飲的潛在藥物活性化合物，選取具有明確作用靶點的活性成分作為左歸飲候選活性化合物，提取蛋白質(zhì)靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）規(guī)范靶點蛋白名稱。

1.2 疾病相關(guān)靶點的預(yù)測在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中 以“Premature ovarian insufficiency”、“Menopause syndrome”、“Amenorrhea”分別檢索POI、MPS、閉經(jīng)3種疾病的相關(guān)靶點基因，獲得POI、MPS、閉經(jīng)3種疾病的治療靶點。

1.3 左歸飲及疾病的共有靶點構(gòu)建為明確左歸飲活性成分靶點與POI、MPS、閉經(jīng)疾病靶點間的緊密關(guān)系，將已獲得的左歸飲活性成分靶點與3種疾病的作用靶點經(jīng)由Venn在線工具（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分別取其交集，繪制韋恩圖，獲得四者交集靶點及左歸飲治療各病的交集靶點，將四者交集靶點作為左歸飲“異病同治”的共同作用靶點。

1.4 構(gòu)建左歸飲與疾病交集基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)將“異病同治”靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），取最小相互作用閾值“Highest confidence＞0.9”，并隱藏游離點，并通過Cy?toscape3.7.0軟件進行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

1.5 “異病同治”靶點的富集分析為闡明左歸飲治療POI、MPS、閉經(jīng)3種疾病靶點所涉及的細胞組分（CC）、分子功能（MF）、生物過程（BP）和信號通路中的作用，利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），將左歸飲“異病同治”靶點進行GO分析和KEGG分析，將GO及KEGG分析結(jié)果的P值由小到大排序（P值越小表明富集結(jié)果顯著性越高）,并將分析結(jié)果排名前十的GO條目通過微生信在線作圖平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化展示。

1.6 構(gòu)建左歸飲“異病同治”活性成分-靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖將左歸飲“異病同治”靶點經(jīng)KEGG通路富集分析后的前15條關(guān)鍵通路與左歸飲的活性成分、作用靶點相對應(yīng)，通過Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，直觀地展現(xiàn)左歸飲對這3種疾病的“異病同治”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，預(yù)測出該網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，闡述左歸飲治療POI、MPS、閉經(jīng)的潛在作用機制。

2 結(jié)果

2.1 左歸飲有效活性成分及作用靶點蛋白的篩選結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索獲得熟地黃活性成分2個，山藥活性成分16個、枸杞子活性成分45個、甘草92個、茯苓15個、山茱萸20個，合并去重并刪除無明確靶點的活性成分后獲得左歸飲活性成分127個，見表1。通過TCMSP查詢127個活性成分作用的靶點信息，合并去重后最終預(yù)測出左歸飲的相關(guān)靶點262個。

表1 左歸飲組成藥物共有的活性物質(zhì)

2.2 疾病靶點的收集結(jié)果通過GeneCards數(shù)據(jù)庫分別檢索POI、MPS、閉經(jīng)的相關(guān)疾病基因，得到POI靶點基因4 873個，MPS靶點基因3 408個，閉經(jīng)靶點基因1 412個，將其與左歸飲化合物對應(yīng)靶點取交集，獲得左歸飲治療POI靶點205個，治療MPS靶點基因178個，治療閉經(jīng)靶點基因70個，將左歸飲治療三者的治療靶點取交集，獲得左歸飲“異病同治”共有靶點66個，見圖1。

圖1 左歸飲治療POI、MPS、閉經(jīng)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析結(jié)果將左歸飲“異病同治”靶點經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖，隱藏游離點后得到共有靶點59個。通過Cytoscape3.7.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖含節(jié)點59個，節(jié)點度值越高，顏色越藍，圖像越大，經(jīng)軟件分析可得平均節(jié)點度值為6.203，選取節(jié)點度值最多的前20個靶點基因作為左歸飲“異病同治”的核心候選基因，并基于STRING數(shù)據(jù)庫選取左歸飲治療POI、MPS、閉經(jīng)的節(jié)點度值排名前20的靶點基因作為左歸飲治療3種疾病的核心候選基因，見表2。

圖2 左歸飲“異病同治”基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

左歸飲“異病同治”核心靶點有TP53、STAT3、TNF、AKT1、IL6等，其中左歸飲治療閉經(jīng)與左歸飲“異病同治”基因的前二十完全相符，說明左歸飲治療POI、MPS基因幾乎包含左歸飲治療閉經(jīng)的靶點基因，提示POI、MPS與閉經(jīng)之間在病因、癥狀、治療上具有一定的趨同性，并為閉經(jīng)是POI、MPS伴隨癥狀提供一定支持，且“異病同治”排名靠前的基因：AKT1、TP53、IL6在左歸飲治療POI疾病靶點中分別位于第1位、第4位、第2位，在左歸飲治療MPS疾病靶點中分別位于第1位、第3位、第2位，說明左歸飲發(fā)揮“異病同治”主要功效的核心基因為TP53、AKT1和IL6，且左歸飲治療POI、MPS的核心基因數(shù)相同的有19個，其節(jié)點度值排名大致相同，提示左歸飲治療POI與MPS的作用靶點大致相同，兩者在疾病病因、臨床治療趨同性高，這也與指南所說明的兩者在疾病病因、臨床表現(xiàn)、治療方法上的相對一致性相符，見表2。

表2 左歸飲治療POI、MPS、閉經(jīng)靶點及“異病同治”靶點的預(yù)測結(jié)果（排名前20靶點基因）

2.4 “異病同治”靶點的GO分析左歸飲“異病同治”的GO富集分析涉及相關(guān)條目525個，其中BP 413個，CC 45個，MF 67個，選取各自富集程度前10的相關(guān)條目，左歸飲“異病同治”GO富集分析主要涉及藥物反應(yīng)、基因表達的正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞缺氧反應(yīng)、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇受體活性等，其反應(yīng)主要集中在細胞外液，見表3。對所選GO分析繪制柱形圖，GO分析圖橫坐標分別為GO-BP、GO-CC，GO-MF排名前10條目，縱坐標為該對應(yīng)條目對應(yīng)的P值，條形圖越高說明P值越小，富集程度越高，見圖3。

表3 GO富集分析BP、CC、MF前10條目

圖3 左歸飲“異病同治”靶點GO分析圖

2.5 “異病同治”靶點的KEGG分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對左歸飲“異病同治”靶點進行KEGG分析，導(dǎo)出分析結(jié)果，從而得到86條KEGG信號通路，將其中P值最小的前15條信號通路作為左歸飲“異病同治”的主要信號通路，見表4。制作富集氣泡圖，圖中P值代表該信號通路的富集程度，P值越小，則富集程度越大，顏色越紅，反之P值越大則富集程度越小，顏色越綠。氣泡的大小代表所富集的基因個數(shù)。參與左歸飲“異病同治”治療作用的信號通路主要有HIF-1信號通路、乙型肝炎（Hepatitis B）信號通路、FoxO信號通路、癌癥（Cancer）信號通路等。由此可見，左歸飲是通過多靶點，多通路來進行“異病同治”效果，見圖4。

2.6 左歸飲“異病同治”活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果將前面得到的左歸飲“異病同治”活性成分、潛在作用靶點及KEGG篩選出來的前15條信號通路一一對應(yīng)，制作左歸飲“異病同治”活性成分-靶點-信號通路圖，左歸飲“異病同治”通過多種活性成分作用于多個靶點，經(jīng)不同信號通路發(fā)揮治療作用。主要活性成分包含槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、柚皮素（MOL004328）、刺芒柄花素（MOL000392）、甘草查爾酮A（MOL000497）、薯蕷皂素（MOL000546）等，故推測這些物質(zhì)是左歸飲“異病同治”作用的主要活性成分。主要靶點為TP53、STAT3、TNF、AKT1、IL6等，涉及的主要信號通路有HIF-1信號通路、Hepatitis B信號通路、Cancer信號通路、FoxO信號通路等，見圖5。

表4 KEGG富集分析前15信號通路

圖4 KEGG富集分析前15信號通路富集氣泡圖

圖5 左歸飲“異病同治”活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

POI、閉經(jīng)、MPS都是婦科常見且難治的內(nèi)分泌疾病，嚴重影響了女性的生活質(zhì)量及身心健康，且病因都涉及到腎虛[5-7]，癥狀及治療方式也相互交叉[8-10]。POI患者癥狀與MPS癥狀大致相同，都有因雌激素下降所導(dǎo)致的月經(jīng)異常、潮熱盜汗、骨質(zhì)疏松等表現(xiàn)，而POI患者后期會導(dǎo)致閉經(jīng)的發(fā)生，且MPS終末期也會有閉經(jīng)的癥狀，而長時間的閉經(jīng)也會增加POI的發(fā)病率，同時也是MPS的最終轉(zhuǎn)歸。三者的關(guān)系不僅穿插于女性整個生命周期，并與卵巢功能失衡有關(guān)，且在病因病機、伴隨并發(fā)癥、治療方案等層面有著一定的趨同性[11-12]。左歸丸是中醫(yī)經(jīng)典的補陰填精方劑，臨床上常作為基礎(chǔ)方治療腎陰虛證，具有調(diào)節(jié)卵巢功能、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老等作用[13]。中醫(yī)從整體出發(fā)，予以辨證論治，是以“異病同治”之基礎(chǔ)，且中藥通過君臣佐使相互配伍，從多靶點、多信號通路實現(xiàn)藥物之間的協(xié)同治療作用，是其“異病同治”之手段。由于中藥之間“異病同治”的具體作用機制尚不明確，故采用基于現(xiàn)代生物技術(shù)的數(shù)據(jù)挖掘方法-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，來發(fā)現(xiàn)藥物、活性成分、作用靶點、疾病間的相互關(guān)系，來進一步挖掘及闡述中藥及中藥復(fù)方治療相關(guān)疾病的潛在作用機制。

本研究通過對左歸飲活性物質(zhì)的篩選，共篩選出其活性成分127個，主要為類固醇化合物：槲皮素、山柰酚、柚皮素、刺芒柄花素、甘草查爾酮A,薯蕷皂素等，此類化合物對卵巢功能具有一定調(diào)節(jié)作用，可以一定程度治療POI、MPS和閉經(jīng)[14-16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中藥所含類固醇化合物具有擬雌激素樣作用，通過外源性補充此類藥物，可以緩解機體低雌激素狀態(tài)，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能，維持腎-天癸-沖任-胞宮軸功能的平衡，緩解卵巢衰老，從而促進卵巢功能的恢復(fù)[17]，并干預(yù)機體骨質(zhì)代謝，對治療雌激素過低導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松有一定的作用[18]，這也與西醫(yī)HRT治療因激素紊亂或缺乏所致POI、MPS、閉經(jīng)有著一定的趨同性，并可緩解因激素紊亂或缺乏所導(dǎo)致的如生殖器萎縮[19]、心腦血管疾病[20]、阿爾茲海默病[21]等一系列并發(fā)癥。上述活性成分共涉及相關(guān)靶點262個，主要有TP53、AKT1、STAT3、TNF、IL6等，目前已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TP53、AKT1、STAT3、TNF、IL6等靶點參與細胞生長的調(diào)控[22-25]，其正常表達時可調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞的增值分化，維持卵巢正常生理功能，為各級卵泡生長發(fā)育提供合適環(huán)境，延緩卵巢衰老過程，當其異常表達時，會引起局部氧化應(yīng)激異常，誘導(dǎo)顆粒細胞自噬及凋亡，引起卵泡閉鎖，導(dǎo)致卵巢功能受損，加速其衰老進程，導(dǎo)致卵巢的病理性改變，從而造成POI[26-27]，或造成MPS的提前發(fā)生[28]，引起閉經(jīng)，同時，也對骨質(zhì)疏松疾病的發(fā)生有著直接關(guān)系[29]。故此，我們可以猜測左歸飲是通過調(diào)節(jié)以上靶點起到“異病同治”的作用。

經(jīng)KEGG信號通路分析富集到左歸飲“異病同治”涉及的信號通路主要有HIF-1信號通路、Hepati?tis B信號通路、FoxO信號通路、Cancer信號通路等，其中HIF-1信號通路、Fox O信號通路在POI、MPS、閉經(jīng)三病的研究中均有報道，且與三者發(fā)生機制、治療作用研究聯(lián)系緊密。HIF-1是組織細胞缺氧狀態(tài)下廣泛存在的一種轉(zhuǎn)錄因子,在機體氧化應(yīng)激過程中起著關(guān)鍵作用。HIF-1信號通路可以特異性表達于卵巢顆粒細胞，且與雌激素受體的表達呈正相關(guān)，而雌激素受體主要存在于卵囊泡膜細胞，這表明HIF-1信號通路可能直接作用于卵巢[30]，并通過糾正局部組織缺氧狀態(tài)，改善局部氧化應(yīng)激水平，減少卵泡閉鎖，促進卵泡的發(fā)育及黃體功能的調(diào)節(jié)[31]，維持卵巢功能，防止卵巢早衰[32]，并參與骨質(zhì)疏松發(fā)病過程，抑制其過度表達可以降低相關(guān)骨代謝水平，緩解POI、MPS伴隨的骨質(zhì)疏松癥狀[33]，同時，可以降低FSH水平，提高E2含量，恢復(fù)各級卵泡數(shù)[34]，在一定程度上改善POI、MPS伴隨的月經(jīng)紊亂及閉經(jīng)。Fox O是PI3K-AKT信號通路下游靶點之一，參與卵巢顆粒細胞增值、生長分化、凋亡衰老等一系列生命過程的調(diào)控，并與女性生殖功能及月經(jīng)相關(guān)密切[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，當PI3K-AKT信號通路過度激活時，會引起Fox O的異常表達，使其喪失轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致各級卵泡減少和卵巢萎縮，引發(fā)POI[36]。當Fox O正常表達時，可以有效緩解雌激素過低導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥狀[37]，并能調(diào)節(jié)月經(jīng)，對POI、MPS、閉經(jīng)三病具有一定程度上的治療效果。

本文著眼于中醫(yī)“異病同治”相關(guān)理論，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法，將現(xiàn)代生物學(xué)信息技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論相結(jié)合，直觀體現(xiàn)了左歸飲“異病同治”作用是通過多成分、多靶點的方式發(fā)揮其功效，初步探討了壽左歸飲“異病同治”的復(fù)雜作用機制。該研究發(fā)現(xiàn)，左歸飲主要通過提高機體抗氧化能力，抑制細胞凋亡等發(fā)揮“異病同治”作用，并激發(fā)與卵巢發(fā)育有關(guān)相關(guān)蛋白的表達，發(fā)揮擬雌激素樣作用，刺激原始卵泡和卵母細胞的生長發(fā)育，從而延緩卵巢衰老，維持其正常生理功能，從而對POI、MPS及閉經(jīng)起到一定治療作用。雖然本研究為左歸飲“異病同治”提供了一定的方向及數(shù)據(jù)支持，但缺乏相關(guān)研究，對于各靶點、信號通路之間關(guān)系的闡述不夠充分。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有其缺陷所在，以此所預(yù)測的核心靶點主要集中在枸杞子、甘草中，并未集中在君藥熟地，可能與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用指標選取及相關(guān)數(shù)據(jù)庫長期未更新有關(guān)，且中藥復(fù)方之間化學(xué)成分的復(fù)雜作用機制尚不明確，故此研究具有一定的局限性，需要學(xué)者們進一步的研究發(fā)現(xiàn)。