結(jié)核分枝桿菌Rv0357c蛋白的生物信息學(xué)分析與鑒定

唐王剛，梅傳忠，高佳慧，司 雨，連超群

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，蚌埠 233030)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)因結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染所致，位列全球第九大死因[1]?！?019年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2018年全球新增TB病例約為1 000萬(wàn)，且因TB死亡的人數(shù)達(dá)到145.1萬(wàn)[2]。近年來(lái)Mtb耐藥株的出現(xiàn)，使得TB的控制更加困難[3-4]。其中，耐多藥的(Multidrug-resistant，MDR)TB 和廣泛耐藥的(Extensively drug-resistant，XDR)TB因治療困難，更應(yīng)引起重視[1]。MDR-Mtb菌株可以同時(shí)對(duì)異煙肼(INH)和利福平(RIF)耐藥，而XDR-Mtb菌株除了對(duì)INH和RIF耐藥以外，尚對(duì)至少1種氟喹諾酮和至少1種二線注射類藥物也耐藥[1]。MDR-Mtb和XDR-Mtb的出現(xiàn)，迫使需要尋找新的藥物來(lái)治療Mtb感染。世界衛(wèi)生組織已將Mtb感染列為世界衛(wèi)生緊急事件，并呼吁老病新治[5]。

嘌呤代謝是生命體最基本的細(xì)胞過(guò)程，對(duì)所有生命體都至關(guān)重要[5]。嘌呤核苷酸及其衍生物可以參與諸多細(xì)胞過(guò)程，如能量?jī)?chǔ)存、核酸和核苷類輔酶的合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)合成[6]。腺苷酸琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthetase，AdSS，EC 6.3.4.4)催化嘌呤代謝中AMP從頭生物合成的第一步關(guān)鍵反應(yīng)，即催化GTP、L-Asp和IMP生成腺苷酸琥珀酸[7-8]。在脊椎動(dòng)物中，AdSS同時(shí)也參與嘌呤核苷酸循環(huán)(Purine nucleotide cycle)[9]。原核生物僅有1個(gè)AdSS，而脊椎動(dòng)物有至少2種同工酶(Isozymes)，它們?cè)趐I、動(dòng)力學(xué)特性、調(diào)節(jié)和組織分布上均有所差異[10]。其中酸性同工酶(非骨骼肌型AdSS2，pI約6.0)在大多數(shù)組織中低表達(dá)，主要參與AMP的從頭合成[11]；而堿性同工酶(骨骼肌型AdSS1，pI約9.0)在心肌和骨骼肌中含量豐富，主要參與骨骼肌的能量代謝[11]。在特性上，細(xì)菌的AdSS類似于真核生物的酸性同工酶[10]，其中研究最為清楚的是大腸桿菌(Escherichiacoli)AdSS[12]。值得一提的是，已有研究表明AdSS可以視為許多人類病原菌的理想藥物靶點(diǎn)，如幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)[12]和惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)[13]。

在GenBank中，Mtb H37Rv菌株(毒性菌株)有一個(gè)推測(cè)的AdSS，即Rv0357c蛋白(NP_214871.1)，其編碼基因(purA基因)全長(zhǎng)1 299 bp(Gene ID：886484)。然而，至今無(wú)任何直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明Rv0357c具有AdSS活性。研究通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-Rv0357c，在E.coli中成功表達(dá)了Rv0357c融合蛋白，通過(guò)包涵體溶解、蛋白純化與復(fù)性，證實(shí)復(fù)性后的Rv0357c融合蛋白具有AdSS活性，此外也對(duì)Rv0357c進(jìn)行了比較全面的生物信息學(xué)分析，有望為Rv0357c進(jìn)一步功能鑒定和開(kāi)發(fā)新型抗TB藥物靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)購(gòu)自上海Sangon公司；改造的pET-28b(+)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。Mtb H37Rv基因組由蚌埠醫(yī)學(xué)院湯必奎教授饋贈(zèng)。質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；T4 DNA Ligase購(gòu)自Invitrogen公司；PrimeSTAR HS DNA polymerase和Co2+-NTA樹(shù)脂購(gòu)自TaKaRa公司；IMP和GTP購(gòu)自Sigma公司；一抗Anti-6×His rabbit polyclonal antibody和二抗HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG購(gòu)自BBI公司；DNA Marker、蛋白Marker和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自上海Sangon公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

使用ProtParam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)分析Rv0357c蛋白的理化性質(zhì)。利用SPOMA軟件和SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)Rv0357c的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。氨基酸序列比對(duì)使用T-Coffee軟件[14]，序列比對(duì)的作圖采用ESPript 3.0軟件(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)[15]。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)作圖采用UCSF Chimera 1.14軟件[16]。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

設(shè)計(jì)基因特異性引物(上游5′-TCCGAATTCCATATGCCGGCGATCGTCCTCATCG-3′和下游5′-TTACATCCGCTCGAGGTGCACTGACGCATCTGTCACG-3′，下劃線處分別為NdeI和XhoI酶切位點(diǎn))，以Mtb基因組為模板，PCR擴(kuò)增purA基因。將擴(kuò)增的purA基因用FastDigestNdeI和FastDigestXhoI進(jìn)行雙酶切，并與同樣雙酶切的pET-28b(+)進(jìn)行DNA連接。將連接體系轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在30 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上篩選抗性克隆。先進(jìn)行雙酶切鑒定，再進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒被命名為pET-Rv0357c。

1.2.3 蛋白表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-Rv0357c轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)表達(dá)菌株后，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基(含30 μg/mL Kan)中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)(37 ℃、220 r/min)，次日按1∶ 100的比例將過(guò)夜菌液轉(zhuǎn)接到200 mL LB液體培養(yǎng)基(含30 μg/mL Kan)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，直至菌液OD600為0.5～0.6，此時(shí)加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L，隨后在20 ℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20 h，從而表達(dá)N端帶有His標(biāo)簽的Rv0357c蛋白(以下稱為Rv0357c融合蛋白)。次日，離心收集菌體。

1.2.4 包涵體溶解與蛋白純化

1.2.5 蛋白質(zhì)復(fù)性

Rv0357c融合蛋白質(zhì)的復(fù)性使用透析法。0.5 mg/mL純化的Rv0357c融合蛋白質(zhì)(約1 mL)對(duì)500 mL含不同尿素濃度(6、4、2和0 mol/L)的Refolding buffer(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，10%體積分?jǐn)?shù)的 glycerol，0.01%體積分?jǐn)?shù)的 Triton X-100，pH 7.5)依次進(jìn)行4 ℃過(guò)夜透析。透析結(jié)束后，12 000 r/min離心20 min去除不溶性的蛋白，上清液即為復(fù)性成功的蛋白質(zhì)。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)

將Rv0357c重組蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至0.45 μm孔徑的PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后，用5% BSA-TBST封閉液室溫封閉1 h，一抗(1∶ 2 000倍稀釋)4 ℃搖床孵育過(guò)夜，二抗(1∶ 2 000倍稀釋)室溫孵育1 h。用辣根過(guò)氧化物酶DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.2.7 酶活性測(cè)試

1 mL酶促反應(yīng)體系在25 ℃、20 mmol/L HEPES-NaOH緩沖液(pH 7.75)中進(jìn)行，緩沖液含60 μmol/L GTP，0.15 mmol/L IMP，2 mmol/L L-Asp和10 mmol/L MgCl2。酶促反應(yīng)的啟動(dòng)通過(guò)添加重折疊的Rv0357c融合蛋白。酶促反應(yīng)的速率通過(guò)監(jiān)測(cè)280 nm處吸光度的增加來(lái)計(jì)算腺苷酸琥珀酸[毫摩爾消光系數(shù)為11.7 L/(mmol·cm)[12]]。一個(gè)AdSS活力單位(Activity unit，U)被定義為25 ℃下每分鐘生成1 μmoL腺苷酸琥珀酸所需要的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 基本理化性質(zhì)

采用ProtParam工具分析Rv0357c的理化性質(zhì)，結(jié)果表明：Rv0357c有432個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量約為46.7 ku，理論等電點(diǎn)為6.28(屬于酸性蛋白)，不穩(wěn)定指數(shù)為26.10(屬于穩(wěn)定蛋白)，脂肪系數(shù)是96.34，總平均親水性(GRAVY)是-0.137(屬于親水性蛋白)。

2.1.2 空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用SPOMA預(yù)測(cè)Rv0357c的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角的含量分別為41.67%、31.48%、16.67%和10.19%。使用SWISS-MODEL軟件模擬Rv0357c的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：自動(dòng)選取的模板為炭疽桿菌(Bacillusanthracis)AdSS復(fù)合AMP的晶體結(jié)構(gòu)(PDB code: 4M9D)，該蛋白與Rv0357c的序列一致性為49.42%。模擬的Rv0357c結(jié)構(gòu)是同源二聚體蛋白(2個(gè)亞基用不同顏色呈現(xiàn))，兩個(gè)活性中心各結(jié)合一個(gè)AMP分子，二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組成與SPOMA預(yù)測(cè)結(jié)果基本相符(圖1)。

圖1 使用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)的Rv0357c的空間結(jié)構(gòu)

2.1.3 與同源蛋白的序列比對(duì)

氨基酸序列比對(duì)表明Rv0357c與E.coliAdSS(EcAdSS)序列一致性達(dá)到49.6%，而與惡性瘧原蟲(chóng)AdSS(PfAdSS)、人骨骼型AdSS(hAdSS1)和人非骨骼肌型AdSS(hAdSS2)的序列一致性相對(duì)較低，分別為37.3%、39.1%和39.4%。并且，與所有以前鑒定的AdSSs一樣，Rv0357c含有GTP結(jié)合蛋白中的2個(gè)保守基序(motifs)[11, 17]，即N端富含Gly的磷酸結(jié)合loop基序(GXXXXGK)和鳥(niǎo)嘌呤特異性結(jié)合基序[(N/T/Q)KXD]，見(jiàn)圖2，這2個(gè)基序與蛋白能同時(shí)結(jié)合鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤核苷酸有關(guān)[11]。此外，推測(cè)的Rv0357c活性位點(diǎn)(圖2中▲所示的殘基)非常保守，與EcAdSS活性位點(diǎn)殘基僅1處位點(diǎn)不同，即Gly143，等價(jià)的位點(diǎn)在EcAdSS中是Ser。

▲表示構(gòu)成活性位點(diǎn)的殘基

2.2 重組質(zhì)粒pET-Rv0357c的構(gòu)建和鑒定

以Mtb H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增purA基因。擴(kuò)增得到約1 300 bp的DNA條帶，與預(yù)期大小(1 343 bp)一致[圖3(a)]。將此基因片段經(jīng)膠回收、雙酶切和DNA連接后，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α細(xì)胞。將重組子抽提質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定[圖3(b)]，結(jié)果顯示：所提取的3個(gè)質(zhì)粒均含有目的片段(泳道1～3)。進(jìn)一步DNA測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒pET-Rv0357c構(gòu)建成功。

(a)Rv0357c編碼基因(purA)的擴(kuò)增；(b)重組質(zhì)粒pET-Rv0357c雙酶切鑒定(白色向下箭頭指示雙酶切后的目的條帶)

2.3 Rv0357c融合蛋白的表達(dá)和鑒定分析

將重組質(zhì)粒pET-Rv0357c轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE分析(圖4)表明與未誘導(dǎo)的菌體相比(泳道1)，誘導(dǎo)的菌體在約48 ku處可見(jiàn)目的條帶(泳道2)，與預(yù)期大小(47.8 ku)相吻合。并且表達(dá)的Rv0357c融合蛋白均在裂解沉淀中(泳道3)，暗示完全以包涵體的形式表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度，均對(duì)提高Rv0357c融合蛋白的可溶性表達(dá)無(wú)改善(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)表達(dá)的Rv0357c融合蛋白進(jìn)一步鑒定，使用Anti-6×His rabbit polyclonal antibody對(duì)包涵體中的蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，在分子質(zhì)量約為47.8 ku處可見(jiàn)一明顯的免疫反應(yīng)條帶，說(shuō)明表達(dá)的Rv0357c融合蛋白帶有His標(biāo)簽(圖5)。

M: protein Marker; 1: 未誘導(dǎo)的E. coli BL21(DE3)/pET-Rv0357c總蛋白; 2: 加IPTG誘導(dǎo)的E. coli BL21(DE3)/pET-Rv0357c總蛋白; 3: 加IPTG誘導(dǎo)的E. coli BL21(DE3)/pET-Rv0357c裂解沉淀(包涵體); 4: 純化的變性Rv0357c融合蛋白；5：重折疊的Rv0357c融合蛋白

圖5 Rv0357c融合蛋白的Western Blot鑒定

2.4 Rv0357c融合蛋白的純化和復(fù)性

由于Rv0357c融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，因此蛋白純化在變性條件(8 mol/L尿素)下進(jìn)行。SDS-PAGE分析(圖4)表明，通過(guò)Co2+親和層析，可以獲得高純度的變性Rv0357c融合蛋白(泳道4)。隨后通過(guò)透析法復(fù)性，可以成功對(duì)Rv0357c融合蛋白進(jìn)行重折疊(泳道5)。并且使用0.5 mg/mL的蛋白進(jìn)行復(fù)性時(shí)，其復(fù)性率約為63%。

2.5 Rv0357c融合活性檢測(cè)

生物信息學(xué)分析推測(cè)Rv0357c是AdSS蛋白，為此我們對(duì)成功復(fù)性的Rv0357c融合蛋白進(jìn)行了AdSS活性測(cè)試。結(jié)果表明Rv0357c融合蛋白確實(shí)有AdSS活性，測(cè)得的比活力為0.016 1 U/mg。

3 結(jié)論

Rv0357c是一個(gè)穩(wěn)定的酸性親水蛋白，與EcAdSS有較高的序列同源性，而與人hAdSS1和hAdSS2序列同源性低于40%，且氨基酸序列中含有2個(gè)保守基序以及保守的AdSS活性位點(diǎn)，是潛在的AdSS蛋白。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-Rv0357c，發(fā)現(xiàn)Rv0357c融合蛋白在E.coli中以包涵體形式表達(dá)，亞基分子質(zhì)量約47.8 ku。包涵體經(jīng)溶解、純化和重折疊，可以得到可溶性的Rv0357c融合蛋白(復(fù)性率約為63%)，進(jìn)一步酶活性測(cè)定證實(shí)Rv0357c融合蛋白有AdSS活性，比活力為0.016 1 U/mg。