Ghrelin對(duì)心衰心肌纖維化的影響及機(jī)制研究

楊春艷,閆曉雨,賀玉泉，楊 萍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 心內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春130033)

心力衰竭(HF)簡(jiǎn)稱心衰，是各種心血管疾病的終末階段，具有發(fā)病率高、再入院率高、死亡率高的特點(diǎn)[1]。心肌重構(gòu)是心衰進(jìn)展的重要因素，而心肌纖維化是促進(jìn)心肌重構(gòu)的關(guān)鍵因素[2-3]。因此，如何成功調(diào)控心肌纖維化過程，消除心肌纖維化的誘因、抑制或阻斷心肌纖維化的信號(hào)傳通通路有望成為治療心力衰竭的新靶點(diǎn)。Ghrelin是由日本科學(xué)家Kojima等于1999年從大鼠胃中提純出的含28個(gè)氨基酸的活性多肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHS-R)的內(nèi)源性配體，具有多種生物學(xué)活性[4]。Ghrelin及其受體廣泛存在于心血管系統(tǒng)[5]，提示Ghrelin在心肌可能具有旁分泌或自分泌功能，從而發(fā)揮相應(yīng)的心血管效應(yīng)。以往的研究表明，Ghrelin對(duì)心力衰竭具有一定的治療作用，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步揭示。本研究旨在探討對(duì)心梗后心衰心肌纖維化的影響及其可能機(jī)制，為Ghrelin應(yīng)用于臨床治療心力衰竭提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.1 動(dòng)物本研究應(yīng)用的是由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的體重200-220 g的雌性Wistar大鼠，合格證號(hào)：SCXK-(吉)2003-0001。

1.2 主要試劑?；疓hrelin購自于中肽生物科技有限公司，HE染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，Masson染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，PCR試劑購自上海生物工程技術(shù)有限公司，免疫組化試劑購自于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 大鼠心衰模型制備及分組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組40只和假手術(shù)組(SO組)10只，模型動(dòng)物行左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)，方法如下：乙醚吸入麻醉，備皮，局部消毒，先用10號(hào)縫線在開胸部位做一荷包，迅速開胸暴露心臟，模型組用0號(hào)線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。術(shù)后迅速收攏荷包關(guān)閉胸腔，手術(shù)部位涂敷0.2%呋喃西林軟膏，并常規(guī)給予腹腔注射青霉素(20萬U/kg)7天。術(shù)后4周模型組存活大鼠20只，隨機(jī)分為模型組(MI 組：皮下注射與Ghrelin等體積的0.9%生理鹽水，2次/日)；模型-Ghrelin組(MI-Ghrelin 組：皮下注射Ghrelin 0.2 mg/kg，2次/日)。假手術(shù)組皮下注射與Ghrelin等體積的0.9%生理鹽水，2次/日。所有實(shí)驗(yàn)大鼠藥物干預(yù)4周后終止飼養(yǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 心臟超聲檢測(cè)給藥結(jié)束后，乙醚吸入麻醉后于左胸上至鎖骨下至肋骨下緣處備皮，對(duì)大鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 HE染色切取非梗死區(qū)心室肌組織約2 mm厚，用4%多聚甲醛固定72 h，之后常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm厚)，二甲苯脫蠟，下行梯度酒精水化，按試劑盒說明書進(jìn)行蘇木素及伊紅染色，于顯微鏡下觀察染色程度。待染色結(jié)束后，上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.6 Masson染色石蠟切片脫蠟及水化方法同上，按試劑盒說明書進(jìn)行蘇木素及麗春紅染色，磷鉬酸處理約3 min，固綠染色液染色，分化，于顯微鏡下觀察染色程度。待染色結(jié)束后，上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，染色結(jié)束后于暗室光鏡下觀察，肌肉為紅色，膠原蛋白呈綠色。

1.7 免疫組織化學(xué)染色石蠟切片脫蠟及水化方法同上，按試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色。大致方法如下：3%H2O2孵育，PBS浸泡，山羊血清封閉，加一抗(1∶500倍稀釋)4℃ 過夜，PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記二抗，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，PBS沖洗，DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.8 RT-PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原及Act A的mRNA表達(dá)提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：Trizols提取各組H9c2細(xì)胞的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，然后取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,合成cDNA后擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。所有引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成,序列見表1。

表1 RT-PCR引物合成表

2 結(jié)果

2.1 心功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)心臟超聲檢查結(jié)果顯示：MI組大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)值較SO組明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；MI-Ghrelin組大鼠EF較MI組明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)，見圖1。

圖1 心臟超聲檢查

2.2 心肌組織形態(tài)學(xué)檢查為明確心肌組織形態(tài)學(xué)改變，行HE染色檢查。結(jié)果如下：SO組可見心肌纖維排列整齊，心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰；MI組心肌纖維部分?jǐn)嗔眩±w維形態(tài)極不規(guī)則，排列紊亂，可見大量纖維組織增生。Ghrelin治療組與MI組比較，可見斷裂心肌纖維減少，肌纖維排列較整齊，炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化程度明顯減輕，見圖2。

圖2 HE染色法檢測(cè)大鼠心肌組織病理學(xué)改變(×200)

2.3 心肌纖維化水平檢測(cè)為明確Ghrelin改善心梗后心衰大鼠心功能的機(jī)制，應(yīng)用Masson染色檢測(cè)各組大鼠心肌纖維化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MI組大鼠心肌纖維化程度較SO組明顯增加；給予Ghrelin干預(yù)后，心衰大鼠心肌心肌纖維化程度較模型組明顯降低。見圖3。

圖3 HE染色法檢測(cè)大鼠心肌組織病理學(xué)改變(×200)

進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)；給予Ghrelin治療后，Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)明顯減少，有顯著性差異(P<0.01)。上述結(jié)果提示：Ghrelin可能通過抑制心梗后心肌纖維化，進(jìn)而改善心梗后心功能。

2.4 心肌組織Act A及其受體ActRIIA表達(dá)水平檢測(cè)為進(jìn)一步探討Ghrelin抑制心肌纖維化的機(jī)制，研究還檢測(cè)了各組大鼠心肌組織Act A及其受體ActRIIA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織Act A及ActRIIA 表達(dá)明顯增加；而給予Ghrelin治療后Act A及ActRIIA 表達(dá)明顯減少。見圖4至圖6。上述結(jié)果提示：Ghrelin可能通過下調(diào)Act A及其受體ActRIIA表達(dá)，減少或部分阻斷Act A的作用，進(jìn)而抑制心肌纖維化，改善心功能。

圖4 RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型及Ⅲ型膠原 mRNA表達(dá)

圖5 RT-PCR檢測(cè)Act A mRNA表達(dá)

圖6 免疫組化染色檢測(cè)ActRIIA表達(dá)(×200)

3 討論

目前，現(xiàn)有的抗心衰藥物尚不能從根本上改善心衰預(yù)后，延緩心衰進(jìn)展，因此尋找新的改善心衰癥狀、阻止或延緩心衰病理進(jìn)程、延長(zhǎng)患者生存率的有效藥物為當(dāng)務(wù)之急。Ghrelin是由日本科學(xué)家Kojima等于1999年從大鼠胃中提純出的含28個(gè)氨基酸的活性多肽，除刺激生長(zhǎng)激素分泌、調(diào)節(jié)攝食及促進(jìn)新陳代謝外，尚具有許多心血管保護(hù)作用，尤其是其抗心衰作用越來越獲得人們的關(guān)注[6-7]。然而，Ghrelin發(fā)揮抗心衰作用的相關(guān)分子機(jī)制尚未完全明確。因此，我們構(gòu)建心梗后心衰大鼠模型，旨在探討Ghrelin對(duì)心梗后心肌纖維化的影響及其可能機(jī)制。

膠原是心肌纖維化的重要組成物質(zhì)，與心肌纖維化程度密切相關(guān)。心臟成纖維細(xì)胞約占心肌總細(xì)胞的2/3，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，在心臟重塑過程中起著關(guān)鍵作用。在心肌纖維化過程中，心臟成纖維細(xì)胞在受到各種信號(hào)因子的刺激下分化成為肌樣成纖維細(xì)胞，可以高度增殖、收縮、遷移并合成及分泌膠原[8]。在心臟疾病的早期，膠原的合成及沉積能加強(qiáng)局部的收縮力，形成瘢痕防止心臟破裂并改善心功能[9]；然而在心臟疾病的后期，過度的膠原沉積則會(huì)引起心肌僵硬度增加、順應(yīng)性下降，心臟收縮舒張能力下降，最終導(dǎo)致心力衰竭[10]。為進(jìn)一步明確Ghrelin對(duì)心肌纖維化的影響，本研究采用Masson染色檢測(cè)心肌纖維化程度，并用RT-PCR法檢測(cè)Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MI組心肌纖維化程度重，Ⅰ型及Ⅲ型膠原 mRNA表達(dá)水平明顯增加；而Ghrelin組心肌纖維化程度明顯減輕，Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)明顯減少。進(jìn)一步證實(shí)Ghrelin可通過下調(diào)Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)抑制心肌纖維化，進(jìn)而改善心功能。

激活素A(Activin A，Act A)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β超家族成員，具有廣泛的解剖學(xué)分布及生物學(xué)功能，包括：組織修復(fù)、細(xì)胞增殖、凋亡、胚胎發(fā)生及炎癥[11]。以往的研究表明：心衰時(shí)Act A異常表達(dá)，與心肌重構(gòu)密切相關(guān)。早在2004年Yndestad等就發(fā)現(xiàn)心力衰竭(心功能分級(jí)Ⅱ-Ⅳ級(jí))患者血清Act A水平升高，并與心衰嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。Hu等2018年的研究發(fā)現(xiàn)Act A抑制可減輕心衰大鼠心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)[13]。本研究亦發(fā)現(xiàn)Act A與心肌纖維化密切相關(guān)，Act A可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原蛋白表達(dá)[14]。本研究應(yīng)用PCR檢測(cè)Act A mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ghrelin可明顯抑制心梗后心衰大鼠心肌組織mRNA表達(dá)。上述結(jié)果提示：Ghrelin可能通過下調(diào)Act A抑制心梗后心衰心肌纖維化。

激活素通過其受體發(fā)揮生物學(xué)作用，激活素受體(ActR)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶型受體。包括ActRⅠ和ActRⅡ，ActRⅠ分ⅠA與ⅠB，ActRⅡ有ⅡA(ActRⅡA)和ⅡB(ActRⅡB)型。激活素首先與細(xì)胞外的Ⅱ型受體(ActRII)結(jié)合，再招募Ⅰ型受體(ActRI)，并使后者活化，傳導(dǎo)信號(hào)入細(xì)胞內(nèi)[15]。為探討Ghrlein對(duì)Act A信號(hào)通路的影響，本研究還應(yīng)用免疫組化染色法檢測(cè)了ActRⅡA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MI組ActRⅡA表達(dá)水平明顯增加；而Ghrelin組ActRⅡA表達(dá)明顯減少。上述結(jié)果提示，Ghrelin既可下調(diào)Act A表達(dá)，又通過抑制其受體ActRⅡA表達(dá)部分阻斷Act A的作用通路，發(fā)揮抗心肌纖維化作用。

綜上所述，我們目前的研究不僅明確了Ghrelin 可抑制心梗后心衰心肌纖維化，更重要的是，明確了Ghrelin 抑制心梗后心衰心肌纖維化的可能機(jī)制，Ghrelin可通過下調(diào)Act A及其受體ActRIIA，進(jìn)而影響心肌纖維化相關(guān)分子Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達(dá)，進(jìn)而延緩或抑制心肌纖維化進(jìn)展，改善心功能。