秦皇島地區(qū)20 000例孕婦無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測結(jié)果分布及因素分析

張麗紅，張麗珍，錢榮華，劉海燕，白力偉

(秦皇島市婦幼保健院 婦產(chǎn)科，河北 秦皇島066000)

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)是利用高通量測序技術(shù)檢測及生物信息分析對孕婦外周血漿中母體、胚胎游離DNA片段進(jìn)行測序計算，分析胎兒染色體是否存在非整倍體變異現(xiàn)象[1-2]。出生缺陷是重要的人類健康問題，包括唐氏綜合征、先天性心臟病、神經(jīng)管缺陷，因此產(chǎn)前篩查、診斷是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。影像學(xué)、血清生化學(xué)等檢查被廣泛應(yīng)用于臨床篩查，然而侵入性產(chǎn)檢、假陽性率較高等問題可能對孕婦造成一定傷害性風(fēng)險和心理性問題[3-4]。2011年NIPT技術(shù)開始在臨床中推廣，該方法在孕周達(dá)到10周以上時即可采血進(jìn)行，不僅提前了診斷時間，而且容易被孕婦接受[5]。在我國每年有約90-100萬出生缺陷兒，屬于出生缺陷高發(fā)國家，因此防治遺傳病，控制出生缺陷是重中之重，產(chǎn)前檢查是該領(lǐng)域研究的熱點[6-7]?；谏鲜銮闆r，本研究擬對秦皇島地區(qū)2萬名孕婦的產(chǎn)前情況進(jìn)行分析，采集其外周血進(jìn)行NIPT檢查，分析本地區(qū)NIPT不同人群分布情況，探討NIPT技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧秦皇島市婦幼保健院產(chǎn)科門診收集的2017年6月至2019年12月選擇NIPT產(chǎn)前篩查的孕婦，共2萬例。年齡18-46歲，平均年齡(33.24±2.08)歲；孕周12-24周，BMI<28 kg/m2。所有入選者均對研究知情、同意并簽署同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)、同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕周<12周；近期接受過干細(xì)胞治療、接受過免疫治療，近期異體輸血或進(jìn)行移植手術(shù)；夫婦一方存在染色體異常者；孕婦患有惡性腫瘤者；胎兒在超聲檢查時提示存在結(jié)構(gòu)性異常者。對入選者進(jìn)行分類指征統(tǒng)計，若NIPT檢測結(jié)果為陽性，則進(jìn)行羊水穿刺診斷。

1.2 研究方法

1.2.1采樣及樣品處理 采集孕婦6 ml靜脈血，置于EDTA抗凝管中，混勻、4℃保存。樣本采集8 h內(nèi)進(jìn)行離心處理，4℃、1 600 g離心(低速離心以防止紅細(xì)胞破裂)、10 min，取上清液分裝1.5 ml為1份。將同份2管抗凝全血上層血漿置于1.5 ml無菌EP管內(nèi)0.9-1 ml；將同份2管抗凝全血白膜層移至1.5 ml無菌EP管中，收集沉淀白膜層，在-80℃環(huán)境下凍存。將上述所得全血血漿在4℃環(huán)境下，采用18 000 g離心(高速離心以去除血漿中殘存的細(xì)胞，4℃環(huán)境下可以避免因離心溫度升高所致的細(xì)胞破壞和游離DNA的釋放)，10 min。冰盒上取上清液800 μl分別轉(zhuǎn)入2個新的1.5 ml的無菌EP管中，各400 μl，貼血漿編號、條碼、封口、密封，2管為1個標(biāo)本的血漿量，保存于-80℃冰箱中凍存。操作時避免吸取離心管管底殘留細(xì)胞。

1.2.2采取過柱法提取血漿游離DNA 將400 μl血漿和10 μl蛋白酶K混合后加入400 μl的裂解液，短離、混勻；在56℃水浴下10 min，在第5 min時緩慢上下顛倒EP管1次，以免DNA降解和更長時間的孵育，室溫冷卻5 min，短暫離心；加入400 μl冰凍無水乙醇，點觸式震蕩15 s，注意為避免后續(xù)操作中堵塞純化柱，需要多震蕩，短暫離心；每管吸取650 μl樣本置于吸附柱內(nèi)，室溫下離心，18 000 g，1 min，棄廢液，對余下的樣本加至試劑盒內(nèi)。轉(zhuǎn)入提取柱內(nèi)，8 000 rpm離心30 s，棄濾液并加入500 μl清洗液，8 000 rpm、離心、30 s；棄濾液，加入500 μl清洗液，8 000 rpm離心，30 s；棄濾液，12 000 rpm離心，2 min，將提取柱置于1.5 ml收集管上晾干3 min，加入47 μl洗脫液5 min溶解；12 000 rpm離心、2 min，1.5 ml收集管回收DNA。

1.2.3文庫建立及測序 將血漿提取游離DNA進(jìn)行缺口補(bǔ)平及相應(yīng)部分5’端磷酸化、3’端去磷酸化后使用連接酶、標(biāo)簽、接頭，構(gòu)建可測序的標(biāo)準(zhǔn)文庫。文庫定量通過PCR擴(kuò)展、與標(biāo)準(zhǔn)品比對。判斷合格文庫標(biāo)準(zhǔn)：R2>99%、Slope>-3.6、effect>90%、Tm<81、NTC無擴(kuò)增、雙峰、無髖峰、dimer。在質(zhì)檢合格文庫均一化后，變性、稀釋、中和，加入測序孔中進(jìn)行高通量測序。采用BioelevtronSeq4000測序儀，對每個基因芯片中的反應(yīng)孔讀取一段短序列，即read根據(jù)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)分析進(jìn)行測序。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 將孕婦樣本DNA序列數(shù)據(jù)與人的參考基因組進(jìn)行比對，計算各染色體的Z值，統(tǒng)計染色體非整倍體異常情況。低風(fēng)險：Z值≤3.0且≥-3.0；三體高風(fēng)險：Z值>3.0；單體高風(fēng)險：Z值<-3.0。若孕婦樣本結(jié)果為單體高風(fēng)險、三體高風(fēng)險，即需要進(jìn)行羊水穿刺診斷。

1.2.5羊水穿刺 在超聲引導(dǎo)下抽取，將最初抽取到的孕婦1-2 ml羊水棄掉，取羊水20 ml，分別置于2個10 ml的無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)；離心1 000 r/min、10 min，棄上清液，保留2.5-3.0 ml細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)基中，在37℃、5%的二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)6-7天，觀察細(xì)胞生長情況，取培養(yǎng)瓶上清液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)顯微鏡下可見多個克隆、有較多中期分裂細(xì)胞，對培養(yǎng)瓶進(jìn)行羊水染色體收集、制片，G帶(必要時加C帶)染色，分析30個中等長度、分散好的中期分裂相，當(dāng)有嵌合體或異常核型出現(xiàn)時增加計數(shù)到100個分裂象并增加分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以“例”表示，比較采取卡方檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 孕婦NIPT檢測分類指證統(tǒng)計情況

從表1的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，高齡孕婦檢測占23.77%(4 754/20 000)，自愿檢測占50.99%(10 199/20 000)，二胎檢測占12.60%(2 520/20 000)，NT增厚占3.08%(615/20 000)，錯過其他篩查時機(jī)占3.55%(710/20 000)，血清學(xué)篩查高風(fēng)險占10.51%(2 101/20 000)，其他情況包括科普宣傳時參加NIPT檢測的、定期產(chǎn)檢隨機(jī)參加者，以及其他參與情況等，占1.89%(377/20 000)。

表1 孕婦NIPT檢測分類情況(例)

2.2 孕婦進(jìn)行NIPT篩查的檢出情況

從表2可以看出，檢出率較高的分類主要集中在血清學(xué)篩查高風(fēng)險、高齡妊娠、錯過其他篩查時機(jī)，其次是自愿檢測。

表2 產(chǎn)前分類檢出陽性情況[篩出例數(shù)(檢出率%)]

2.3 孕婦產(chǎn)前NIPT結(jié)果的符合情況

本研究由NIPT篩選出常染色體非整倍數(shù)共208例(T21+T18+T13)，性染色體異常共188例；染色體總異常陽性率為1.98%(396/20000)；T21占0.82%，T18占0.13%，T13占0.09%，45,XO-Turner綜合征占0.66%，47，XYY-超雄綜合征占0.06%，47，XXX-超雌綜合征占0.22%。最終確診患者306例，染色體總異常發(fā)生率為1.53%(306/20000),符合率為77.27%。從表3可以看出，T21與47，XYY-超雄綜合征的符合率較高。

表3 產(chǎn)前NIPT檢查與羊水穿刺結(jié)果比較

3 討論

染色體非整倍體疾病是指染色體數(shù)目異常的配子相結(jié)合形成的非整倍體合子，表現(xiàn)為細(xì)胞中某些染色體數(shù)目減少或增加，有異于常人的46條染色體，是胎兒最常見的染色體畸形，是胎兒發(fā)生缺陷性疾病的最常見病因之一[8-9]。人類最常見的3種染色體非整倍體疾病包括21-三體綜合征、18-三體綜合征(又名愛德華氏綜合征)和13-三體綜合征(又名帕陶氏綜合征)，其中以21-三體綜合征(又名唐氏綜合征)最為常見，在新生兒發(fā)病率約為1/800[10-12]。由于目前醫(yī)療水平對于出生缺陷性疾病無特效治法，因此產(chǎn)前篩查，適時終止妊娠是提高人口素質(zhì)、降低圍產(chǎn)兒死亡率的有效措施。傳統(tǒng)的產(chǎn)前檢查包括血清學(xué)篩查、超聲等無創(chuàng)性手段，以及羊膜腔穿刺、臍靜脈穿刺、絨毛膜取樣等侵入性診療手段；然而前者存在較高的假陽性，后者雖準(zhǔn)確性較高但具有宮內(nèi)感染、流產(chǎn)等風(fēng)險，對于胎兒正常發(fā)育具有不利影響[13-15]。NIPT屬于無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查，包括數(shù)字PCR、基因芯片、NGS、單分子DNA成像等檢測方法，其中臨床最常用的NGS檢測法又可分為靶向測序和全基因組大規(guī)模平行測序兩類[16-17]。據(jù)多項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NIPT無流產(chǎn)風(fēng)險，創(chuàng)傷性較小，且準(zhǔn)確性較高。

本次研究通過回顧本院2017年-2019年間開展NIPT篩查技術(shù)的情況發(fā)現(xiàn)，主動自愿檢測人數(shù)比例高達(dá)50.99%，說明NIPT這種無創(chuàng)性檢測容易被孕婦及其家屬接受，易于在人群中開展。同時，從篩查人群的分類統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，高齡孕婦、二胎孕婦等特殊人群的主動檢測率分別為23.77%和12.60%，具有較高的主動性。傳統(tǒng)的孕中期血清學(xué)篩查主要針對唐氏綜合征、愛德華氏綜合征和神經(jīng)管缺陷，然而其單指標(biāo)的異常往往還提示具有其他不良妊娠風(fēng)險的可能，從本次篩查結(jié)果來看血清學(xué)篩查高風(fēng)險孕婦在NIPT檢查中存在有帕陶氏綜合征，以及45,XO-Turner綜合征、47，XYY-超雄綜合征、47，XXX-超雌綜合征等性染色體異常者，說明血清學(xué)結(jié)果不能覆蓋NIPT檢測結(jié)果，而NIPT不僅可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢查的假陽性現(xiàn)象，而且可以更加明確核型。張莉等[18]對孕中期2 811例孕婦在血清學(xué)篩查基礎(chǔ)上進(jìn)行NIPT檢查，認(rèn)為NIPT可作為血清學(xué)篩查的序貫手段，以提高檢出率、降低母嬰損害。從本次NIPT開展情況來看，該方法對于常見的染色體非整倍體疾病的檢出率均較高，且在羊水穿刺這一產(chǎn)前金標(biāo)準(zhǔn)的核對下，其符合率在唐氏綜合征和47，XYY-超雄綜合征的表現(xiàn)也較好。羊膜腔穿刺采集羊水來進(jìn)行核型分析，是目前臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，然而產(chǎn)前診斷手術(shù)具有1%-3%的流產(chǎn)風(fēng)險，且會給孕婦帶來焦慮、恐懼等不良心理，依從性較差。

NIPT對孕婦外周血中cffDNA，通過高通量測序及生物信息分析來預(yù)測胎兒染色體疾病，而cffDNA并非直接的胎兒DNA物質(zhì)，是源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，因此若存在影響cffDNA的因素必然會產(chǎn)生不同的檢測結(jié)果[19-20]。從本次結(jié)果的符合率來看，帕陶氏綜合征、45,XO-Turner綜合征均較低，說明NIPT存在假陰性、假陽性現(xiàn)象。分析其原因可能是：孕婦本身染色體具有異常、染色嵌合體等造成受檢血漿非整倍體cffDNA含量改變；或胎盤為嵌合體而胎兒染色體核型并非異常，這就是研究中發(fā)生假陽性的原因；或NIPT在生物學(xué)原因的干擾下產(chǎn)生假陽性，如帕陶氏綜合征的鳥嘌呤脫氧核糖核酸、胞嘧啶脫氧核糖核酸含量均低，即會造成NIPT測序時發(fā)生較高的偏差；或孕婦個體發(fā)生了性染色體嵌合，繼而影響NIPT對胎兒不同類別性染色體異常的陽性預(yù)測值，由于孕婦臨床的多樣性、復(fù)雜性，使得NIPT對于性染色體檢測中假陽性偏高，這可能是本次觀察中NIPT除了對于47，XYY-超雄綜合征符合率較高，其他性染色體異常符合率均較低的原因。李秀娟等[21]對3 164例高齡孕婦進(jìn)行NIPT檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NIPT對于胎兒性染色體異常的符合率差異較大，特別是45,XO-Turner綜合征符合率僅為55.56%，這與本次觀察情況一致。

綜上所述，NIPT在胎兒非整倍體染色體篩查中具有重要的應(yīng)用價值，降低了產(chǎn)前診斷風(fēng)險、提高了孕婦依從性。從實踐結(jié)果來看，NIPT受各種因素影響存在假陽性、假陰性，因此NIPT檢測現(xiàn)階段可作為一種篩查途徑，不能將NIPT高風(fēng)險作為引產(chǎn)指證。在今后的研究中，隨著測序深度的增加，信息分析的進(jìn)一步全面等，NIPT的準(zhǔn)確性將得到提升，篩查范圍也將進(jìn)一步拓展。