改進(jìn)的QuEChERS-UPLC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中13種全氟化合物

王 瑩，杜思宇，張 紅，張玉慧，李 玲，王顏紅，*，李國(guó)琛，*

(1.中國(guó)科學(xué)院，沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽110016;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京100029)

全氟化合物(perfluorinated compounds，PFCs)是化合物分子中與碳原子連接的氫原子全部被氟原子取代并帶有不同功能團(tuán)的一類人工合成有機(jī)化合物［1］。PFCs主要包括全氟烷基羧酸類(PFCAs)、全氟烷基磺酸類(PFSAs)、全氟烷基磺酰胺類(PFOSAs)、全氟調(diào)聚醇(FTOHs)、全氟磷酸及其酯等，其中全氟烷基辛酸(PFOA)和全氟烷基磺酸(PFOS)是兩種最受關(guān)注的八碳鏈PFCs［2］。全氟化合物的C－F共價(jià)鍵具有極高的化學(xué)鍵能，不易被水解、光解或生物降解，可在環(huán)境中持久性存在、可長(zhǎng)距離傳輸、可沿生物鏈積累放大［3］，是國(guó)際上備受關(guān)注的新型有機(jī)污染物。近年來，在全球生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)［4－6］、生物體［7－8］、人體［9－11］、食品［2，12］等多種介質(zhì)中均有檢出。鑒于PFCs廣泛存在性以及具有神經(jīng)毒性［6，13］、生殖毒性［14］和免疫毒性［15］等毒性效應(yīng)，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者開始關(guān)注PFCs對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)，并普遍認(rèn)為膳食暴露是人類攝入PFCs的重要途徑［6，16］。人類膳食中水產(chǎn)品、乳及乳制品、肉及肉制品、果蔬等均有不同程度PFCs污染［2，17］。盡管人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到PFCs可能帶來的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于食品中PFCs的限量標(biāo)準(zhǔn)仍是空白。基于PFCs易與蛋白質(zhì)結(jié)合而累積于生物體組織器官的富集特性［18］，膳食占比較大的動(dòng)物源性食品，特別是肝臟、腎臟、肌肉等蛋白質(zhì)含量較高的器官組織中富集現(xiàn)象普遍但含量較低(通常在μg/kg級(jí)別)［3，19－20］。因此，快速、準(zhǔn)確、靈敏的動(dòng)物源性產(chǎn)品中多種類PFCs含量的檢測(cè)方法可以為人群暴露于PFCs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供重要技術(shù)支持。

目前，PFCs檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)［21］、氣相色譜質(zhì)譜法(GC－MS)［22］、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(GC－MS/MS)［23］和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)［24－33］?；赑FCs極性大、沸點(diǎn)高、不能直接氣化的特點(diǎn)，GC、GC－MS、GC－MS/MS法在分析前需要對(duì)PFCs進(jìn)行衍生化，但處理過程繁瑣，易引入污染和干擾物質(zhì)，這使得上述三種方法在應(yīng)用上受到局限。HPLC－MS/MS的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multi－reaction monitoring，MRM)，背景干擾少，選擇性好、檢出限低，在痕量PFCs檢測(cè)分析中具有顯著優(yōu)勢(shì)。HPLC－MS/MS對(duì)應(yīng)的前處理方法，主要采用離子對(duì)液液萃取、液固萃取、堿消解提取結(jié)合弱陰離子交換柱WAX［31］或HLB固相萃取柱凈化［29］，但是這些傳統(tǒng)的前處理方法步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，重現(xiàn)性差。本實(shí)驗(yàn)采用酸化乙腈提取輔以分散固相萃取技術(shù)(QuEChERS)進(jìn)行樣品前處理。QuEChERS是目前廣泛應(yīng)用于食品中目標(biāo)物測(cè)定的方法，也已逐步應(yīng)用到動(dòng)物源性食品中PFCs檢測(cè)［24，27－28，30，32］，郭萌萌等［27］采用十八烷基鍵合硅膠(C18)和石墨化碳黑(GCB)分散固相萃取法測(cè)定水產(chǎn)品中23種全氟化合物，朱萍萍等［28］、何建麗等［30］、白文薈等［32］采用C18、GCB和N－丙基乙二胺(PSA)3種混合吸附劑凈化法測(cè)定羊肝、牛肝、豬肝和豬肉中多種全氟化合物。上述改進(jìn)的QuEChERS－LC－MS/MS方法都具有合理的回收率及較高的靈敏度，但存在樣品基質(zhì)類型不全或檢測(cè)項(xiàng)目少等缺點(diǎn)。我國(guó)人群膳食暴露頻繁且PFCs富集普遍的動(dòng)物源性食品(豬、牛、羊)的肝臟、腎臟、肌肉中PFCAs和PFSAs多種類PFCs同時(shí)檢測(cè)的方法報(bào)道較少。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外頒布的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)［24－25］也只關(guān)注了食品中最典型的PFOA和PFOS，而對(duì)同樣具有危害性的其它PFCs沒有涉及。因此，本實(shí)驗(yàn)采用酸化乙腈提取，C18、GCB和PSA混合吸附劑分散固相萃取凈化，UPLC－MS/MS檢測(cè)9種基質(zhì)(豬、牛、羊的肝臟、腎臟、肌肉)13種PFCs(包括9種PFCAs，4種PFSAs)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。該方法步驟簡(jiǎn)化、定量準(zhǔn)確、靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中多種PFCs的分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、正己烷 色譜純，德國(guó)Merck公司;甲酸、乙酸銨 色譜純，美國(guó)Fisher Chemical公司;鹽酸、氯化鈉 優(yōu)級(jí)純，天津康科德公司;C18、GCB 40～60μm，北京迪馬公司;PSA 40～63μm，上海安譜公司;聚丙烯離心管 15、50 mL，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司;標(biāo)準(zhǔn)品全氟丁烷羧酸(PFBA)、全氟戊烷羧酸(PFPeA)、全氟己烷羧酸(PFHxA)、全氟庚烷羧酸(PFHpA)、全氟辛烷羧酸(PFOA)、全氟壬烷羧酸(PFNA)、全氟癸烷羧酸(PFDA)、全氟十一烷羧酸(PFUd A)、全氟十二烷羧酸(PFDoA)、全氟己烷磺酸鈉(PFHxS)、全氟辛烷磺酸鈉(PFOS)、全氟癸烷磺酸鈉(PFDS)、全氟十二烷磺酸鈉(PFDoS)、同位素內(nèi)標(biāo)物13C4－PFOA(Perfluoro－n－［1，2，3，4－13C4］octanoic acid，MPFOA)、同位素內(nèi)標(biāo)物13C4－PFOS(Sodium perfluoro－1－［1，2，3，4－13C4］octanesulfonate，MPFOS) 均為50μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，溶劑甲醇，陰涼避光放置，加拿大Wellington公司;實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物源性食品 均為市售豬、牛、羊的肝臟、腎臟、肌肉，取可食用部分絞碎并均質(zhì)，取2.00 g均質(zhì)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，待檢，其余樣品密封保存于－18℃冰箱中。

UltiMate 3000超高效液相色譜儀、TSQ Quantiva三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)ThermoFisher Scientific公司;T25數(shù)顯型高速分散機(jī)、Vortex genius 3渦流混合器 德國(guó)IKA公司;TD25－WS離心機(jī) 湖南湘儀公司;THZ－98A恒溫振蕩器 上海一恒公司;L－119A氮?dú)獯蹈蓛x 北京來亨科貿(mào)有限公司;Biofuge Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 13種PFCs和2種同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制:分別準(zhǔn)確移取13種PFCs、2種同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(50μg/mL)適量于10 mL容量瓶中，甲醇定容，分別配制成濃度均為5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，濃度以全氟烷基羧酸或全氟烷基磺酸計(jì)，－18℃避光保存，有效期12個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:分別準(zhǔn)確移取13種PFCs標(biāo)準(zhǔn)中間液各1 mL，于50 mL容量瓶中，甲醇定容。該溶液中每種PFCs濃度為100 ng/mL。－18℃避光保存，有效期3個(gè)月。

混合同位素內(nèi)標(biāo)中間液的配制:分別準(zhǔn)確移取同位素內(nèi)標(biāo)中間液MPFOA 1.5 mL、MPFOS 3 mL，于50 mL容量瓶中，甲醇定容。該溶液中MPFOA濃度為150 ng/mL、MPFOS濃度為300 ng/mL。－18℃避光保存，有效期6個(gè)月。

混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液:準(zhǔn)確移取混合同位素內(nèi)標(biāo)中間液1 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容。該溶液中MPFOA濃度為15 ng/mL、MPFOS濃度為30 ng/mL。－18℃避光保存，有效期3個(gè)月。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:準(zhǔn)確移取13種PFCs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液適量，用甲醇配制濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10 ng/mL(同位素內(nèi)標(biāo)MPFOA濃度為1.5 ng/mL、MPFOS濃度為3.0 ng/mL)的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。MPFOA是定量9種PFCAs的同位素內(nèi)標(biāo)，MPFOS是定量4種PFSAs的同位素內(nèi)標(biāo)。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:Atlantis T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，3μm);流速:0.3 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:10μL;流動(dòng)相:2.5 mmol/L乙酸銨－甲醇溶液(A)(2.5 mmol/L乙酸銨溶液(B);梯度洗脫程序:0～3 min，90%～40%B;3～12 min，40%～10%B;12～14 min，10%B;14～14.5 min，10%～90%B;14.5～18 min，90%B。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);掃描方式:負(fù)離子掃描;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);噴霧電壓:3500 V;蒸汽溫度;290℃;離子傳輸管溫度:270℃;鞘氣流速:30 arb;輔助氣流速:10 arb;二級(jí)碰撞氣:氬氣;碰撞氣壓力:1.5 mTorr;保留時(shí)間、定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量見表1。

1.2.3 前處理 稱取樣品(肝臟、腎臟、肌肉)2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液100μL，再加入2 mL水，渦旋混合1 min。加入0.2%鹽酸－乙腈溶液10 mL，200 r/min振蕩10 min，加入2 g氯化鈉，再振蕩10 min，5000 r/min離心5 min。將全部上清液轉(zhuǎn)移至15 mL聚丙烯離心管并40℃氮吹至約5 mL，加入100 mg PSA、80 mg C18、30 mg GCB，渦旋混合1 min，振蕩10 min，5000 r/min離心10 min。取全部上清液至另一個(gè)15 mL聚丙烯離心管中，40℃氮吹至近干，1 mL甲醇定容，15000 r/min離心5 min，上清液供上機(jī)測(cè)定。

表1 13種全氟化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric conditions of 13 PFCs

為減少實(shí)驗(yàn)過程中帶來的污染及背景干擾，全程盡量避免使用聚四氟乙烯器皿而使用聚丙烯材質(zhì)器皿［28］。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)采用1.2.1配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2.2條件測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，選取9種空白樣品基質(zhì)(豬肉、豬肝、豬腎、牛肉、牛肝、牛腎、羊肉、羊肝、羊腎)不加同位素內(nèi)標(biāo)按照1.2.3前處理后，采用空白基質(zhì)溶液作為溶劑配制相同濃度范圍的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2.2條件測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過比較基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率的比值來判斷基質(zhì)效應(yīng)的影響。

1.3.2 線性范圍、檢出限、定量限 0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照1.2.2條件測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，以各個(gè)目標(biāo)物與對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)、以各目標(biāo)物濃度與與對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物的濃度比值為橫坐標(biāo)，求線性方程及相關(guān)系數(shù)。按照GB/T 27417－2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》［34］中5.4條款規(guī)定，在豬、牛、羊的肝臟、腎臟、肌肉空白樣品基質(zhì)中添加預(yù)估最低可接受濃度0.15μg/kg，每個(gè)樣品平行測(cè)定10次，計(jì)算方法檢出限(LOD)=0+3SD、方法定量限(LOQ)=0+10SD。

1.3.3 回收率和精密度 按照GB/T 27404－2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗(yàn)要求》［35］，對(duì)于未制定MRL限量的物質(zhì)，回收率實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法測(cè)定低限、常見限量指標(biāo)、一個(gè)合理的添加濃度三個(gè)水平進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)采用在豬肝、牛肝、羊肝、豬腎、牛腎、羊腎、豬肉、牛肉、羊肉9個(gè)不同基質(zhì)空白樣品中添加0.2、1和2μg/kg三個(gè)濃度，每個(gè)濃度6個(gè)平行，前處理方法參照1.2.3，儀器條件參照1.2.2，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，均扣除本底值后計(jì)算回收率及精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用美國(guó)ThermoFisher Scientific公司Xcalibur 3.0軟件、Origin 8.0版本進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化 PFCs具有親水性和疏水性以及一定的表面活性和極性，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［24－26］及文獻(xiàn)［27－30］多數(shù)采用較低硅羥基活性填料的C18液相色譜柱分離、乙腈－乙酸銨水溶液或甲醇－乙酸銨水溶液流動(dòng)相梯度洗脫，來實(shí)現(xiàn)這類化合物的良好分離。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察兩種流動(dòng)相體系乙腈－乙酸銨水溶液、甲醇－乙酸銨水溶液對(duì)PFCs及同位素內(nèi)標(biāo)的靈敏度差異。通過比較相同濃度標(biāo)液峰面積(見圖1)發(fā)現(xiàn)，兩種流動(dòng)相梯度洗脫條件下，15種物質(zhì)峰形均尖銳對(duì)稱。與乙腈－乙酸銨水溶液流動(dòng)相相比，以甲醇－乙酸銨水溶液為流動(dòng)相時(shí)，除PFBA峰面積減少29%之外，其他14種物質(zhì)的色譜峰峰面積增加了22%～151%。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇峰面積較大、靈敏度較高的甲醇－乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相體系。

圖1 甲醇－乙酸銨水溶液、乙腈－乙酸銨水溶液流動(dòng)相條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/mL)峰面積比較Fig.1 Comparison of peak area of standard solution(10 ng/mL)in methanol－ammonium acetate and acetonitrile－ammonium acetate mobile phase system

13種PFCs及2種同位素內(nèi)標(biāo)物是羧酸或磺酸鹽，在流動(dòng)相中加入乙酸銨，能使溶液保持一定的pH及離子強(qiáng)度，可以有效地增強(qiáng)電噴霧離子化響應(yīng)值，并減少溶劑效應(yīng)，改善峰形［32］;但也有研究表明，較高濃度的乙酸銨對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)有較強(qiáng)的抑制作用［36］。標(biāo)準(zhǔn)［24－26］及文獻(xiàn)［27－30］中常見的乙酸銨濃度為1～10 mmol/L，本實(shí)驗(yàn)以甲醇和水為溶劑，分別配制相同濃度的乙酸銨甲醇溶液及乙酸銨水溶液。通過比較1、2.5、5、10 mmol/L四個(gè)不同濃度條件下的測(cè)定結(jié)果(見圖2)可以看出，PFOS和PFDoA在1、2.5 mmol/L濃度的峰面積較高且?guī)缀跸嗟?，其?3種物質(zhì)均在乙酸銨濃度為2.5 mmol/L時(shí)，色譜峰面積達(dá)到最大值。

圖2 不同濃度乙酸銨對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0 ng/mL)峰面積的影響Fig.2 Effect of different concentrations of ammonium acetate on peak area of standard solution(5.0 ng/mL)

圖3 13種PFCs和2種同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 ng/mL)MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of 13 PFCs and 2 internal standards(1.0 ng/mL)

因此，本實(shí)驗(yàn)采用Atlantis T3色譜柱，以2.5 mmol/L乙酸銨甲醇溶液－2.5 mmol/L乙酸銨水溶液進(jìn)行梯度洗脫。由圖3可見15種物質(zhì)在12 min內(nèi)全部流出，目標(biāo)化合物保留時(shí)間適中，峰面積、信噪比較高，雜峰響應(yīng)較小;在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物，在上述檢測(cè)條件下，譜圖無干擾雜峰，13種PFCs響應(yīng)好。隨碳鏈的增加，PFCs在C18柱上的保留逐漸增強(qiáng)，同一碳鏈數(shù)全氟磺酸類化合物保留強(qiáng)于全氟羧酸類化合物。PFBA最先流出，PFDoS最后流出。

2.1.2 質(zhì)譜條件選擇 PFCs化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有羧基或磺酸基，因此采用負(fù)離子模式檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)注射進(jìn)樣方式，分別對(duì)5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行m/z 200～1000 ESI一級(jí)全掃描，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PFCs主要以電離后失去羥基上氫原子［M－H］－最強(qiáng)，確定其為準(zhǔn)分子離子，并優(yōu)化噴霧電壓、蒸汽溫度、離子傳輸管溫度以獲得較強(qiáng)的響應(yīng)值。接下來，以其作為母離子進(jìn)行子離子掃描并優(yōu)化碰撞能量，確定定性離子和定量離子。在實(shí)驗(yàn)過程中，PFCAs生成［M－H－44］－子離子，推斷是PFCAs發(fā)生中性丟失CO2產(chǎn)生;PFSAs生成m/z 99和m/z 80子離子，推斷是PFSAs斷裂生成［FSO3］－和［SO3］－。本次實(shí)驗(yàn)選取豐度較高且干擾較少的子離子［M－H－44］－和［SO3］－分別作為PFCAs和PFSAs的定量離子。以MRM模式采集數(shù)據(jù)，具體參數(shù)見表1。

2.2 前處理優(yōu)化

針對(duì)動(dòng)物源性食品(肝臟、腎臟、肌肉)基質(zhì)復(fù)雜、含有大量蛋白質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)等特點(diǎn)，本研究采用改良的QuEChERS樣品前處理方法，酸化乙腈提取，C18、PSA和GCB混合吸附劑分散固相萃取凈化，減少基質(zhì)中雜質(zhì)干擾、提高回收率。

2.2.1 提取溶劑優(yōu)化 已報(bào)道的文獻(xiàn)中采用乙腈［29］、鹽酸－乙腈［28，31］作為提取溶劑提取動(dòng)物源性食品的肌肉和肝臟基質(zhì)中的PFCs。鑒于乙腈是常用的動(dòng)物源性食品有機(jī)提取溶劑，而且PFCs是酸性化合物，在酸性環(huán)境下呈非解離狀態(tài)，有利于進(jìn)入有機(jī)相，所以本實(shí)驗(yàn)選擇鹽酸－乙腈作為提取溶劑。

同時(shí)，考察了0.05%、0.1%、0.2%、0.3%四個(gè)不同濃度鹽酸－乙腈對(duì)動(dòng)物源性食品中13種PFCs的提取回收率。由圖4結(jié)果表明，在0.05%～0.3%范圍內(nèi)，9種PFCAs的回收率基本是逐漸增加趨勢(shì)，4種PFSAs是逐漸增加再減少趨勢(shì)，0.1%、0.2%、0.3%鹽酸－乙腈的回收率均在合理范圍內(nèi)，分別為76.3%～114.6%、95.3%～119.4%、85.8%～118.9%。上述三個(gè)濃度都是適宜的提取濃度，但0.2%鹽酸－乙腈的回收率較集中，分布在95%～120%之間，最低回收率95.3%均高于其他兩個(gè)濃度;同時(shí)為避免增加鹽酸用量對(duì)后續(xù)分析產(chǎn)生干擾，所以選擇0.2%鹽酸－乙腈作為提取溶劑。在提取過程中，0.2%鹽酸－乙腈使樣品基質(zhì)中大量蛋白質(zhì)變性形成沉淀，并通過高速離心去除。但含脂量較高的樣品進(jìn)行蛋白沉淀時(shí)，易將樣品中的脂肪和水溶性雜質(zhì)也提取出來，造成提取液混濁，可能對(duì)LC－MS/MS分析產(chǎn)生基質(zhì)干擾，因此對(duì)提取液要進(jìn)一步凈化。

2.2.2 凈化方式優(yōu)化 QuEChERS方法是使用分散固相萃取技術(shù)凈化，通過將固相吸附劑直接加入到樣品提取液中來達(dá)到吸附干擾物質(zhì)的目的。動(dòng)物源性食品中存在蛋白質(zhì)、碳水化合物、色素、脂肪、甾醇等物質(zhì)，可以通過采用不同類型吸附劑達(dá)到凈化效果。已有文獻(xiàn)［28，32］選用C18、PSA、GCB三種吸附劑單一或不同配比進(jìn)行PFCs凈化，但存在樣品基質(zhì)種類較少或檢測(cè)項(xiàng)目少等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)比較了3種吸附劑單一和混合方式對(duì)動(dòng)物源性食品的肝臟、腎臟和肌肉中多種PFCs的凈化效果及回收率。

圖4 不同濃度鹽酸－乙腈提取溶劑對(duì)13種PFCs提取效率Fig.4 Extraction efficiencies of 13 PFCs by different concentions of HCl－acetonitrile

2.2.2.1 C18優(yōu)化 C18主要吸附脂肪和酯類等非極性共萃物［37］。通過在空白樣品中添加目標(biāo)物，做2μg/kg添加濃度3個(gè)平行，比較40～100 mg單一吸附劑C18對(duì)PFCs回收率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著C18用量由40 mg增加到80 mg，回收率亦增加，在80 mg達(dá)到88.4%～116.3%(見圖5);由80 mg增加到100 mg，大多數(shù)PFCAs回收率基本保持不變，4種PFSAs和PFHpA、PFDA回收率有所下降，但13種PFCs回收率仍處于85.5%～118.0%的合理范圍(見圖5)。因此采用合理回收率的最小用量80 mg。但凈化后的溶液有色素殘留，會(huì)污染色譜柱及檢測(cè)儀器，需要進(jìn)一步去除色素。

圖5 C18用量對(duì)PFCs回收率的影響Fig.5 Effect of C18 amount on recoveries of PFCs

2.2.2.2 PSA優(yōu)化 PSA是一種弱陰離子交換劑，可以吸附碳水化合物、有機(jī)酸、少量色素等極性干擾物質(zhì)［37］。在空白樣品中添加目標(biāo)物，做2μg/kg添加濃度3個(gè)平行，在80 mg C18凈化基礎(chǔ)上，同時(shí)加入80～140 mg PSA觀察PFCs的回收率變化情況。由圖6可以得知隨著PSA用量的增加，PFCAs回收率呈先上升后下降趨勢(shì)，并在100、120 mg時(shí)回收率達(dá)到合理最大值;PFSAs回收率呈下降趨勢(shì)，80、100 mg回收率是83.9%～92.1%。綜合考慮，選擇100 mg PSA為最佳用量。但凈化后的溶液有色素殘留，需要加入GCB去除。

2.2.2.3 GCB優(yōu)化 GCB主要吸附色素、甾醇等雜質(zhì)，通過π鍵作用來吸附與分離不同化合物。PFCs的π電子被高電負(fù)性的氟束縛，不能與GCB形成π鍵而被解析;而不含氟的化合物則可與GCB形成π鍵而吸附，從而達(dá)到吸附雜質(zhì)凈化樣品的目的［38］。

圖6 PSA用量對(duì)回收率的影響Fig.6 Effect of PSA amount on recoveries of PFCs

通過在空白樣品中添加目標(biāo)物，做2μg/kg添加濃度3個(gè)平行，考察不同GCB用量與80 mg C18、100 mg PSA組合對(duì)13種PFCs加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果如圖7所示。隨著GCB用量增加，回收率最大值基本保持不變，在110.2%～121.6%之間;最小值變化較大，為53.6%～84.3%。GCB用量為30、40、50 mg時(shí)，回收率為75.6%～114.0%，均在合理范圍內(nèi);其中30 mg的回收率在84.3%～110.2%之間，不同PFCs的回收率變化幅度不大。鑒于上述3個(gè)添加量都可以有效去除色素、樣品溶液接近無色的前提下，考慮到增加GCB吸附劑用量可能會(huì)帶來實(shí)驗(yàn)成本增加及雜質(zhì)引入，最后確定30 mg是最優(yōu)化的GCB添加量。

圖7 GCB用量對(duì)PFCs回收率的影響Fig.7 Effect of GCB amount on recoveries of PFCs

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 液質(zhì)檢測(cè)過程，樣品基質(zhì)本身的內(nèi)源性成分及前處理過程中引入的外源性成分會(huì)改變待測(cè)物的離子化效率，進(jìn)而影響檢測(cè)方法的靈敏度和選擇性，即存在“基質(zhì)效應(yīng)”(matrix effect，ME)。目前常用的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法是采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程斜率的比值，可用百分?jǐn)?shù)表示。當(dāng)ME為80%～120%，說明存在基質(zhì)效應(yīng)，但影響不大;當(dāng)50%＜ME＜80%或120%＜ME＜150%時(shí)，表現(xiàn)為中等程度的基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)ME＜50%或ME＞150%，表示基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)烈［39］。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，9種基質(zhì)中13種PFCs基質(zhì)效應(yīng)均不相同，變化范圍是81%～119%;以PFOA為例(見表2)，ME為86%～111%。上述結(jié)果表明待測(cè)目標(biāo)物在9種基質(zhì)中存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，但影響不明顯。因此，本方法采用溶劑甲醇配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行定量。

表2 PFOA基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of PFOA

2.3.2 線性范圍、檢出限、定量限 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，13種PFCs在0.05～10 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9974～0.9999，均大于0.99。在空白樣品中添加預(yù)估最低可接受濃度0.15μg/kg，每個(gè)樣品平行測(cè)定10次，分別計(jì)算3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差、10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，確定本方法LOD和LOQ分別為0.02～0.05、0.06～0.15μg/kg。具體見表3。

2.3.3 回收率和精密度 13種PFCs在0.2、1、2μg/kg三個(gè)添加水平的平均回收率為62.3%～119.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為6.4%～19.9%、5.7%～18.3%、3.5%～15.0%(見表4～表6)。本方法具有較高的回收率和精密度，滿足GB/T 27417－2017［34］中多殘留分析要求。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

采用優(yōu)化的前處理方法和檢測(cè)條件，對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買的16個(gè)樣品進(jìn)行13種PFCs分析測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見圖8)，13種PFCs的含量為0.046～5.1μg/kg;PFHxA和PFOS分別有9個(gè)樣品檢出，檢出率高達(dá)50%;PFBA、PFHp A、PFOA、PFNA、PFDS的檢出率均大于20%。由此可見，PFCs在動(dòng)物源性食品中，尤其是肝臟、腎臟、肌肉中是普遍存在的，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［2，19－20］。

圖8 16個(gè)動(dòng)物源性食品中13種全氟化合物的含量Fig.8 Contents of 13 PFCs in 16 animal－derived foods

3 結(jié)論

本文建立了UPLC－MS/MS同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品(豬、牛、羊的肝臟、腎臟、肌肉)中13種全氟化合物(包括9種PFCAs，4種PFSAs)的檢測(cè)方法。樣品采用0.2%鹽酸－乙腈提取，C18、PSA、GCB混合吸附劑的分散固相萃取技術(shù)凈化，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，13種PFCs在12 min內(nèi)得到有效分離，相關(guān)系數(shù)均大于0.99;本方法具有較高的靈敏度和精密度，檢出限為0.02～0.05μg/kg，定量限為0.06～0.15μg/kg，0.2、1、2μg/kg三個(gè)添加濃度平均回收率為62.3%～119.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～19.9%。本方法簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)、分析速度快，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中PFCs的分析，同時(shí)為PFCs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供重要的技術(shù)支持。

表3 13種PFCs線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs for 13 PFCs

表4 豬肝、牛肝、羊肝中13種PFCs的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Mean recoveries and relative standard deviations of 13 PFCs in pig liver，cattle liver and lamb liver

表5 豬腎、牛腎、羊腎中13種PFCs的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Mean recoveries and relative standard deviations of 13 PFCs in pig kidney，cattle kidney and lamb kidney

續(xù)表

表6 豬肉、牛肉、羊肉中13種PFCs的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 6 Mean recoveries and relative standard deviations of 13 PFCs in pork，beef and mutton

續(xù)表