鹿胎肽對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

張凱月，李春楠，蘭 夢(mèng)，王亞蘋，尹馨雪，張 輝，高曉晨

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130117)

生物活性肽(Bioactive Peptides，BAP)是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或是具有生理作用的肽類化合物，其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不一，含有2～20個(gè)氨基酸的特異性蛋白片段，可通過磷酸化、糖基化或酰基化而被修飾［1］?，F(xiàn)代研究表明，胎盤中含有多種活性成分，如生物活性肽、免疫球蛋白、氨基酸、礦物質(zhì)等其他成分，是一種較為理想的免疫調(diào)節(jié)劑，其作用機(jī)制為通過調(diào)控巨噬細(xì)胞吞噬和抗原遞呈功能以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而參與巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)［2－3］。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞之一，具有吞噬、表達(dá)相應(yīng)抗原遞呈分子、分泌多種細(xì)胞因子等功能，在機(jī)體廣泛參與清除病原微生物與衰老細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，在天然免疫中起重要作用［4］。另有研究表明，生物活性肽類成分在免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等方面表現(xiàn)出了重要的生理活性［1］。鄧志程等［5］以馬氏珠母貝為原料，酶解后經(jīng)多級(jí)分離純化后得到兩種寡肽，通過體外研究發(fā)現(xiàn)兩種寡肽能明顯促進(jìn)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的吞噬功能，表達(dá)其免疫調(diào)節(jié)作用。

鹿胎為鹿科動(dòng)物梅花鹿(Cervus nippon Temminck)或馬鹿(Cervus elaphus Linnacus)的胎盤和胎獸［6］。近年來的研究表明，鹿胎制劑在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎方面表現(xiàn)出良好的活性［7－9］。韓廣金等［10］用鹿胎制劑觀察大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的現(xiàn)象，證明鹿胎制劑可顯著提高大鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)。然而對(duì)鹿胎中提取的生物活性肽的藥理作用研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)以鹿胎為原料，通過閃式提取法和超濾的方法制備鹿胎肽，而后根據(jù)其對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖、細(xì)胞形態(tài)、吞噬作用、NO分泌和細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞周期的影響，評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)作用，以期為鹿胎肽(Deer fetus peptides，DFP)的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹿胎 吉林省東鰲鹿業(yè)科技開發(fā)有限公司;牛血清白蛋白 上海源葉生物科技有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基 美國(guó) Gibco公司;脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 上海源葉生物科技有限公司;噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) 美國(guó)Amresco公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;NO試劑盒、白介素(interleukin，IL)－1β試劑盒、IL－6試劑盒、腫瘤壞死因子－α(tumor necrosis factorα，TNF－α)試劑盒 長(zhǎng)春百金生物科技有限公司;中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒 貝博生物科技有限公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HERAEUS HERAcell 150 CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司;Model 680型酶標(biāo)儀 日本TAKARA公司;CX 23熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司;JHBE－50T閃式提取器 北京金洋萬達(dá)科技有限公司;XL90超濾離心機(jī) Beckman公司;GZLY－0.4型藥用真空冷凍干燥機(jī) 北京速原中天科技有限公司;BD Facscalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿胎肽的提取及蛋白含量的測(cè)定

1.2.1.1 鹿胎的預(yù)處理 將鮮鹿胎洗凈，絞碎，放置于通風(fēng)陰暗處陰干，粉碎，過180目篩，即得鹿胎粗粉末。

1.2.1.2 鹿胎肽的提取 取鹿胎粗粉40 g，加入25倍量的水，混勻，用閃式提取器提取10次，每次10 s，所得提取液在3600 r/min下離心10 min，將上清液抽濾，過0.45μm微膜除雜，然后用超濾離心機(jī)進(jìn)行超濾分級(jí)，實(shí)驗(yàn)選用1、3、10 kDa的超濾膜，將提取液分為總提液、大于10、3～10、1～3 kDa、小于1 k Da五個(gè)分子質(zhì)量段的超濾液分別命名為DFP－1、DFP－2、DFP－3、DFP－4、DFP－5凍干備用。

1.2.1.3 鹿胎肽蛋白含量測(cè)定 參考Bradford法測(cè)定鹿胎肽的蛋白含量［11－12］。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密稱取1.0 mg牛血清白蛋白(BSA)于10 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度。分別取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于干燥試管中，每管補(bǔ)充蒸餾水至1.0 mL。分別加入考馬斯亮藍(lán)試劑5 mL，快速渦旋混勻，室溫反應(yīng)5 min，以空白組調(diào)零，5～20 min內(nèi)測(cè)定其在595 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定:將5個(gè)樣品配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL溶液，取1 mL加入考馬斯亮藍(lán)試劑5 mL，快速渦旋混勻，室溫反應(yīng)5 min，5～20 min內(nèi)測(cè)定其在595 nm處的OD值。

蛋白 質(zhì)含量(mg/mL)=(Ai－0.0443/6.8665)×Cs

式中:Ai表示樣品于595 nm處測(cè)得的OD值，Cs表示牛血清白蛋白濃度

1.2.2 鹿胎肽對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖作用的影響

1.2.2.1 不同超濾組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用 采用MTT法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞的增殖能力［13－14］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以105個(gè)/孔于96孔培養(yǎng)板，每孔150μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，分別加入100μg/mL的DFP－1、DFP－2、DFP－3、DFP－4、DFP－5溶液150μL，空白對(duì)照組為150μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組為10μg/mL LPS 150μL，每組5個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)12、24、48 h，棄去上清液，每孔加入5 mg/mL的MTT 10μL，4 h后加入DMSO 150μL，振蕩5 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)其OD值。計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)［15］。

細(xì)胞增殖指數(shù)=As/Ac

式中:As表示實(shí)驗(yàn)組OD值，Ac表示空白對(duì)照組OD值。

1.2.2.2 不同質(zhì)量濃度DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用 按“1.2.2.1”項(xiàng)下方法，分別加入6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL的DFP－5溶液150μL，空白對(duì)照組為150μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組為10μg/mL LPS 150μL，每組5個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)上清液，每孔加入5 mg/mL的MTT 10μL，4 h后加入DMSO 150μL，振蕩5 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)其OD值。計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.2.2.3 熒光倒置顯微鏡觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以105個(gè)/孔，每孔2 mL接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，吸出培養(yǎng)液，加入質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的DFP－5，以LPS(10μg/mL)為陽性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置空白組;孵育24 h后，加入90%DAPI熒光染料染色，室溫染色5 min，吸除DAPI染色液，用pH7.2磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照［16］。

1.2.2.4 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以105個(gè)/孔，每孔150μL于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，并給予質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的DFP－5藥物刺激，每組5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)定LPS組和空白組，孵育24 h。吸出上清液，PBS洗滌2次，隨后加入200μL細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)加入中性紅染液20μL，孵育2 h。除去含有中性紅染液的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，于每孔加入中性紅檢測(cè)裂解液200μL，室溫?fù)u床上裂解10 min。于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞吞噬指數(shù)［17－18］。

細(xì)胞吞噬指數(shù)=As/Ac

式中:As表示實(shí)驗(yàn)組OD值，Ac表示空白對(duì)照組OD值。

1.2.2.5 DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200μL，密度為105個(gè)/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，分別加入12.5、25、50、100、200μg/mL的DFP－5樣品溶液150μL，設(shè)置空白組和LPS組，每組5個(gè)復(fù)孔。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，取上清液150μL，按NO試劑盒說明書測(cè)定NO的分泌量。

1.2.2.6 DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放的影響 RAW264.7細(xì)胞的處理方法同“1.2.2.5”節(jié)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取上清液150μL，按ELISA試劑盒說明書測(cè)定各因子IL－1β、IL－6、TNF－α的分泌量。

1.2.2.7 DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞濃度約為105個(gè)/mL，每孔2 mL接種于6孔板中，24 h后吸出培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的DFP－5，同時(shí)設(shè)置LPS組和空白組，繼續(xù)孵育，收集樣本細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量約為6×106個(gè)，用冷PBS洗滌2次，吹散細(xì)胞至15 mL離心管中，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，用500μL PBS重懸細(xì)胞，滴加3 mL 75%冷乙醇，放入－20℃固定1 h，離心，500μL冷PBS重懸細(xì)胞，加RnaseA溶液20μL，37℃水浴30 min，離心10 min，棄上清，加入PI染液400μL，輕輕混勻后4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其結(jié)果［19－20］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿胎肽蛋白含量測(cè)定

以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以吸光度OD值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。經(jīng)公式計(jì)算得DFP－1、DFP－2、DFP－3、DFP－4、DFP－5溶液的蛋白含量分別為0.4326、0.2914、0.3160、0.3926、0.3460 mg/mL。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

2.2 不同超濾組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用

從表1中可知，DFP各超濾組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖均有一定的促進(jìn)作用;當(dāng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，DFP－1、DFP－2、DFP－3組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用具有顯著性差異(P＜0.05)，DFP－4、DFP－5組分以及LPS組對(duì)RAW264.7細(xì)胞的促進(jìn)作用具有極顯著性差異(P＜0.01)。當(dāng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后，5種樣品以及LPS組與空白組相比均有極顯著性差異(P＜0.01)，培養(yǎng)時(shí)間在24 h時(shí)，各組分的增殖能力最強(qiáng)，故后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間均為24 h，且DFP－5組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用與陽性最為接近，因此選擇DFP－5做進(jìn)一步研究。

2.3 不同質(zhì)量濃度DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用

由圖2可知，LPS和DFP－5均能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，在質(zhì)量濃度為6.25～400μg/mL的范圍內(nèi)，RAW264.7細(xì)胞的增值指數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)DFP－5質(zhì)量濃度為12.5、200μg/mL時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖影響顯著(P＜0.05);當(dāng)DFP－5質(zhì)量濃度為25、50、100μg/mL時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響極顯著(P＜0.01)，且25μg/mL質(zhì)量濃度時(shí)增殖指數(shù)最大，為1.95±0.09。隨著DFP－5質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，增殖指數(shù)開始驟降，當(dāng)質(zhì)量濃度升至400μg/mL時(shí)，與空白對(duì)照組相比，DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，故選擇12.5～200μg/mL DFP－5進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的進(jìn)一步研究。

圖2 不同質(zhì)量濃度DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖能力的影響(n=5)Fig.2 Effects of different concentrations of DFP－5 on the proliferation of RAW264.7 cells(n=5)

2.4 熒光倒置顯微鏡觀察

由圖3可以看出，與空白組相比，不同質(zhì)量濃度DFP－5與LPS組處理后細(xì)胞在數(shù)量上發(fā)生明顯的變化。隨著DFP－5從12.5～50μg/mL質(zhì)量濃度的不斷增加，細(xì)胞數(shù)量也明顯增多，但質(zhì)量濃度為100μg/mL時(shí)，數(shù)量開始慢慢變少。質(zhì)量濃度為25μg/mL時(shí)，與LPS組數(shù)量最為接近。

圖3 熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(400×)Fig.3 Morphology of RAW264.7 cells observed by fluorescence inverted microscope(400×)

2.5 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4可得，LPS組和質(zhì)量濃度為12.5、25、50μg/mL的DFP－5均能極顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力(P＜0.01)，且隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的刺激作用呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量濃度增至25μg/mL時(shí)，吞噬指數(shù)達(dá)到1.87±0.12，表明DFP－5能有效激活RAW264.7細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用。

圖4 不同質(zhì)量濃度DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響(n=5)Fig.4 Effects of different concentrations of DFP－5 on the phagocytosis of RAW264.7 cells(n=5)

2.6 DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

NO作為重要的作為一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，參與多種生理活動(dòng)和病理過程，其與免疫系統(tǒng)存在密切關(guān)系。NO在免疫調(diào)節(jié)方面具有雙重作用，一方面NO是不可或缺的調(diào)節(jié)因子;另一方面，過量NO會(huì)誘導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，引起炎癥，導(dǎo)致組織損傷［21］。試驗(yàn)細(xì)胞分泌NO的變化由圖5可知，DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的刺激作用與劑量相關(guān)，隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，NO釋放量呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中，DFP－5質(zhì)量濃度為25μg/mL時(shí)，細(xì)胞NO的分泌量達(dá)最大值，為(21.57±1.80)μmol/L;DFP－5各質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞NO分泌量均具有極顯著性差異(P＜0.01)，但弱于LPS組。試驗(yàn)中DFP－5極顯著增加了巨噬細(xì)胞釋放NO的能力(P＜0.01)，可以認(rèn)定為DFP－5是巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)活性。

圖5 不同質(zhì)量濃度DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響(n=5)Fig.5 Effects of different concentrations of DFP－5 on NO secretion in RAW264.7 cells(n=5)

2.7 DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL－1β、IL－6、TNF－α分泌量的影響(n=5)Fig.6 Effect of different concentrations of DFP－5 on the secretion of in IL－1β、IL－6、TNF－αin RAW264.7 cells(n=5)

圖7 RAW264.7細(xì)胞周期的變化Fig.7 Changes in cell cycle of RAW264.7 cells

免疫活性肽具有多方面的生理功能，不僅能增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，在動(dòng)物體內(nèi)起重要的免疫調(diào)節(jié)作用;而且還能刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高機(jī)體對(duì)外界病原物質(zhì)的抵抗能力［22］。IL－1β、IL－6和TNF－α是介導(dǎo)炎癥發(fā)生的主要因子，這些炎癥因子可以激活免疫細(xì)胞而起到免疫調(diào)節(jié)作用［23－24］。DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響由圖6所示，DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌量的影響與劑量呈相關(guān)性。經(jīng)25μg/mL DFP－5處理后，細(xì)胞因子IL－1β、IL－6和TNF－α的分泌量與空白組相比均有極顯著性作用(P＜0.01)，且其各因子的分泌量最高，趨近于陽性對(duì)照組。表明DFP－5可極顯著促進(jìn)各細(xì)胞因子分泌(P＜0.01)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

2.8 DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期的影響

由圖7、圖8可知，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)DFP－5處理24 h后，G0/G1期的細(xì)胞比例呈先上升后下降的趨勢(shì)，處于S期及G2/M期的細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)中的占比呈先下降后上升的趨勢(shì)，且比例呈劑量相關(guān)性。當(dāng)DFP－5質(zhì)量濃度達(dá)到25μg/mL時(shí)，各時(shí)期的變化趨勢(shì)與LPS組最接近。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DFP－5在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖活性，能夠促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO、IL－1β、IL－6和TNF－α等細(xì)胞因子的釋放。同時(shí)，本研究同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期檢查，DFP－5能明顯提高G0/G1細(xì)胞比例，G0/G1為RNA和蛋白質(zhì)的合成期，因此相關(guān)蛋白的表達(dá)量增加，所以吞噬作用、NO及細(xì)胞因子的分泌能力在此時(shí)期分泌量達(dá)最大值。因此，DFP－5可以作為天然免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用到食品及保健品領(lǐng)域中。同時(shí)，該項(xiàng)研究也為進(jìn)一步開發(fā)鹿胎生物活性成分提供了理論依據(jù)和參考價(jià)值。

圖8 DFP－5對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期的影響Fig.8 Effects of different concentrations of DFP－5 on cell cycle of RAW264.7 cells