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    連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素的研究

    2021-06-19 00:22:28馮亞莉曹智威顧悅馨賈洋洋郝煥煥付潔浩翟廣玉
    食品研究與開發(fā) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:草素花生殼乙醇溶液

    馮亞莉,曹智威,顧悅馨,賈洋洋,郝煥煥,付潔浩,翟廣玉

    (鄭州工業(yè)應用技術(shù)學院藥學與化學工程學院,河南 鄭州 451100)

    木犀草素(3′,4′,5,7-四羥基黃酮)是一種最為常見的天然黃酮類物質(zhì),廣泛存在于多種植物中,如金銀花、菊花、白毛夏枯草等天然藥物和芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果實中[1]。作為一種天然的抗氧化劑,木犀草素具有多種顯著的生物活性,如抗癌[2-6]、抗菌、抗炎[8-10]、保護心血管[11]、改善和治療阿爾茨海默癥[12-13]等,具有廣泛的醫(yī)藥價值和應用前景。目前,國內(nèi)多以白毛夏枯草等為原料生產(chǎn)木犀草素,價格高,收益率低。木犀草素化學結(jié)構(gòu)如圖1所示。

    圖1 木犀草素的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of luteolin

    花生殼中富含木犀草素,是木犀草素的理想來源之一[14]。花生是一年生草本植物,是世界上重要的五大油料作物之一,其生產(chǎn)遍及世界各地[15]。我國是花生生產(chǎn)、消費和出口貿(mào)易最大的國家,每年花生殼的產(chǎn)量高達500萬噸[16]。鄭州市位于河南省中部,經(jīng)濟作物主要以花生為主,花生加工業(yè)每年產(chǎn)出大量的花生殼,僅有少量用作飼料或化工原料,其余大部分被用于燃料或當作廢棄物處理,既嚴重污染環(huán)境,又造成資源的極大浪費。因此,開發(fā)利用花生殼中的有效成分木犀草素等天然黃酮類化合物,對于有效延長花生產(chǎn)業(yè)鏈,提高花生資源綜合利用效益,具有重要的社會意義。

    歸納近幾年相關(guān)研究報道,提取花生殼中木犀草素的方法主要有水浴回流法[17]、有機溶劑提取法[18-19]、堿水提取法[20],輔助方法主要有微波輔助提取技術(shù)[21]、超聲輔助提取技術(shù)[22]、超臨界流體萃取技術(shù)[23]及生物酶解技術(shù)[24]、離子液提取技術(shù)[25]等。傳統(tǒng)的水浴回流法、有機溶劑提取法及堿水提取法等存在得率較低的問題,微波輔助法和超聲波輔助法能耗和成本較高,酶提取法及離子液提取技術(shù)操作繁瑣,不適于工業(yè)生產(chǎn)。

    本文采用連續(xù)萃取法提取花生殼中的木犀草素,考察不同萃取劑、萃取劑體積分數(shù)、萃取劑用量、萃取溫度及萃取時間等因素對木犀草素提取率的影響,考察石油醚脫脂預處理對提取的花生殼中木犀草素純度的影響,采用高效液相色譜法對花生殼中木犀草素的提取率及產(chǎn)品純度進行測定。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    木犀草素標準品(98%):上海麥克林生化科技有限公司;花生殼:花生果產(chǎn)于河南省鄭州市,手工剝殼,洗凈后60℃干燥箱烘干,粉碎備用;甲醇:色譜級,天津市科密歐化學試劑有限公司。其它所用試劑均為分析純。

    萃取器:鄭州市高等學校生藥學名師技術(shù)技能工作室自制;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;HJ-3型恒溫磁力加熱攪拌器:常州翔天實驗儀器廠;SQP型分析天平:賽多利斯科學儀器有限公司;SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵:天津華鑫儀器廠;ZW-3型紫外分析儀:鞏義市予華儀器有限責任公司;FW-100型藥用植物粉碎機:天津泰斯特儀器有限公司;Agilent-1260型高效液相色譜儀、Zorbax SB型C18色譜柱(4.6 mm×4 250 mm,5 μm):美國Agilent公司。

    1.2 試驗方法

    稱取100 g過40目篩的花生殼干粉于1 000 mL燒杯中,加入500 mL石油醚,攪拌密封放置24 h進行脫脂處理。過濾,石油醚回收,花生殼自然揮干24 h。將揮干后的花生殼置于萃取器中,加入2 000 mL 75%乙醇,在萃取器中加熱回流,控制溫度為80℃,連續(xù)提取2 h。立即切換另一個新的已經(jīng)裝好花生殼干粉的萃取器,開始新一輪的連續(xù)萃取。

    提取完成后,旋蒸濃縮提取液至浸膏狀,加入10倍體積的蒸餾水,靜置后取沉淀,置于50℃恒溫干燥箱烘干,得粗提物。然后依次加入適量的無水乙醇、丙酮,使其完全溶解,過濾,石油醚進行二次脫脂,脫脂完成后加入適量乙酸乙酯再次重結(jié)晶,干燥,得到木犀草素供試樣品。

    1.3 薄層層析(thin layer chromatography,TLC)鑒定

    取適量木犀草素標準品、木犀草素供試品用無水乙醇溶解,以氯仿-甲醇-冰乙酸(9∶0.5∶0.5,體積比)的混合溶液為展開劑,置于紫外燈下(365 nm)檢視。

    1.4 高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)測定

    1.4.1 溶液配制

    標準品溶液:精密稱取木犀草素標準品1.00 mg,取適量甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至1 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,超聲混勻,得濃度為1 mg/mL木犀草素標準品溶液[26]。

    供試品溶液:精密稱取木犀草素供試品1.00 mg,取適量甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至1 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,超聲混勻,得1 mg/mL的供試品溶液[26]。

    1.4.2 色譜條件選擇

    色譜柱:Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-0.5%磷酸溶液(體積比,70∶30),流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長(λ)∶348 nm。

    1.4.3 線性關(guān)系考察和花生殼中木犀草素含量測定

    準確量取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 木犀草素標準品溶液于50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。按“1.4.2”色譜條件依次進樣分析,平行測定5次,取平均值。以木犀草素標準品濃度為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y)繪制標準曲線,建立回歸方程。

    對木犀草素供試品溶液進樣測定,測定結(jié)果代入回歸方程計算木犀草素的濃度,并按照下列公式計算木犀草素供試品純度ω和木犀草素的提取率W。

    式中:n為稀釋倍數(shù);c為供試品溶液的濃度,mg/mL;V為供試品溶液的體積,mL;m1為稱取的木犀草素供試品質(zhì)量,mg。

    式中:m2為提取的木犀草素產(chǎn)品總質(zhì)量,mg;m為試驗稱取的花生殼質(zhì)量,g;ω為木犀草素供試品純度,%。

    1.4.4 精密度試驗

    對同一木犀草素標準品溶液重復進樣8次,進樣體積為20 μL,計算峰面積的相對標準偏差(rlative sandard deviation,RSD)。

    1.4.5 穩(wěn)定性試驗

    對同一木犀草素供試品溶液12 h內(nèi)每隔1 h進樣測定1次,進樣體積為20 μL,計算峰面積的RSD。

    1.4.6 重復性試驗

    對同一木犀草素供試品溶液重復進樣5次,進樣體積為20 μL,計算峰面積的RSD。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 薄層層析鑒定結(jié)果

    薄層層析鑒定結(jié)果如圖2所示。

    圖2 TLC分析Fig.2 TLC analysis

    在紫外燈檢視下發(fā)現(xiàn),標準品與供試品溶液在同一硅膠G薄層層析板相同位置顯示相同顏色斑點。

    2.2 木犀草素含量測定結(jié)果

    2.2.1 線性關(guān)系試驗

    以色譜峰面積(Y)對木犀草素標準品濃度(X)進行線性回歸,得回歸方程Y=29538X+380.98(r=0.9974),線性關(guān)系良好。在本試驗的色譜條件下,木犀草素的保留效果較好,出峰時間約為3.8 min,分析時間較短,有利于快速分析。木犀草素標照品的HPLC圖見圖3,木犀草素供試品的HPLC圖見圖4。

    圖3 木犀草素標準品色譜圖Fig.3 Chromatogram of luteolin standard product

    圖4 木犀草素供試品色譜圖Fig.4 Chromatogram of luteolin test product

    2.2.2 精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗結(jié)果

    精密度試驗測得木犀草素的峰面積RSD為0.62%(n=8),表明儀器精密度良好;穩(wěn)定性試驗測得木犀草素的峰面積RSD為0.64%(n=12),表明木犀草素供試品溶液在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性;重復性試驗測得木犀草素的峰面積RSD為0.13%(n=5),表明該方法重現(xiàn)性良好,在測定過程中木犀草素供試品溶液能夠保持穩(wěn)定。

    2.3 單因素試驗結(jié)果

    2.3.1 石油醚脫脂預處理對花生殼中木犀草素產(chǎn)品純度的影響

    固定料液比為1∶20(g/mL),萃取溫度為80℃,萃取時間為2.0 h,考察石油醚脫脂預處理對花生殼提取物中木犀草素產(chǎn)品純度的影響,試驗結(jié)果如圖5所示。

    圖5 石油醚脫脂預處理對花生殼中木犀草素純度的影響Fig.5 Effect of petroleum ether degreasing pretreatment on the purity of luteolin in peanut shells

    結(jié)果顯示,石油醚脫脂預處理后,花生殼提取物中木犀草素產(chǎn)品的純度可達到67.86%,而未經(jīng)石油醚脫脂預處理的花生殼提取物中木犀草素產(chǎn)品的純度僅為10.05%?;ㄉ鷼さ闹饕煞质前肜w維素和粗纖維素,另有粗蛋白、粗脂肪、糖類、黃酮類物質(zhì)及礦物質(zhì)成分等[27]。其中粗蛋白含量為4.8%~7.2%,粗脂肪含量為1.2%~1.8%[28],主要是油脂類成分及脂肪烷烴類成分,如二十六烷酸-α-單甘油酯、十八烷酸-α-單甘油酯、十六烷酸-α-單甘油酯、正二十六碳酸乙酯、磷脂等。采用石油醚密封浸泡攪拌預處理可除去花生殼中大量的粗蛋白、粗脂肪、木犀草素苷等低極性雜質(zhì),從而提高木犀草素產(chǎn)品的純度。

    2.3.2 不同萃取劑對花生殼中木犀草素提取率的影響

    采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h,固定料液比為1∶20(g/mL),萃取溫度為80℃,萃取時間為2.0h,考察不同萃取劑對花生殼提取物中木犀草素提取率的影響。分別選用75%乙醇溶液、75%甲醇溶液、75%丙酮溶液、乙酸乙酯、0.2 mol/L NaOH溶液以及水作為萃取劑進行提取,試驗結(jié)果如表1所示。

    表1 不同萃取劑花生殼提取物中木犀草素的提取率和純度Table 1 Luteolin extraction rate and purity of peanut shell extracts with different extractants

    從表1中可以看出,各萃取劑對花生殼中木犀草素提取率的影響順序為:水>75%乙醇溶液>75%丙酮溶液>75%甲醇溶液>0.2 mol/L NaOH溶液>乙酸乙酯,而提取物中木犀草素產(chǎn)品純度大小為:75%丙酮溶液>75%乙醇溶液>75%甲醇溶液>0.2 mol/L NaOH溶液>乙酸乙酯>水。而根據(jù)價格、性能、來源、對環(huán)境的影響等綜合考慮,選擇乙醇溶液作為萃取劑比較合適。

    2.3.3 乙醇溶液體積分數(shù)對花生殼中木犀草素提取率的影響

    采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h,固定料液比為1∶20(g/mL),萃取溫度為 80℃,萃取時間為2.0h,考察乙醇溶液體積分數(shù)(45%、55%、65%、75%、85%、90%)對花生殼提取物中木犀草素提取率的影響,試驗結(jié)果如圖6所示。

    圖6 乙醇溶液體積分數(shù)對花生殼中木犀草素提取率的影響Fig.6 Effect of ethanol solution volume fraction on extraction rate of luteolin from peanut shell

    從圖6中可以看出,當乙醇溶液體積分數(shù)低于75%時,花生殼中木犀草素提取率隨乙醇溶液體積分數(shù)的增大而提高,而當乙醇溶液體積分數(shù)達到85%、90%時,木犀草素提取率呈緩慢下降趨勢。這是由于木犀草素母核是由兩個具有酚羥基的苯環(huán)通過一個成環(huán)的C3相互連接而成,是一種弱極性化合物,因此易溶于乙醇。同時木犀草素還是一種平面性較強的分子,各個分子間排列緊密,引力較大,故難溶于水。因此,根據(jù)相似相溶原理,木犀草素的溶解度隨萃取劑中乙醇含量的升高而增大。但是,當乙醇含量過高,即超過75%時,導致萃取劑極性過低,也不利于木犀草素的提取。因此,當乙醇溶液體積分數(shù)為75%時,萃取效果較好。

    2.3.4 料液比對花生殼中木犀草素提取率的影響

    采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h,固定萃取溫度為80℃,萃取時間為2.0 h,乙醇溶液體積分數(shù)為75%,考察料液比為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1:25、1∶30(g/mL)時對花生殼中木犀草素提取率的影響,試驗結(jié)果如圖7所示。

    從圖7可以看出,木犀草素提取率隨萃取劑用量的增大而提高,在 1∶5(g/mL)~1∶20(g/mL)區(qū)間時,木犀草素的提取率增加較快,而當料液比大于1∶20(g/mL)時,木犀草素提取率的增加趨勢比較緩慢。因此,選擇料液比為 1∶20(g/mL)。

    圖7 料液比對花生殼中木犀草素提取率的影響Fig.7 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of luteolin from peanut shell

    2.3.5 萃取溫度對花生殼中木犀草素提取率的影響

    采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h,固定料液比為1∶20(g/mL),萃取時間為2.0 h,乙醇溶液體積分數(shù)為 75%,考察萃取溫度(40、50、60、70、80、85、90 ℃)對花生殼中木犀草素提取率的影響,結(jié)果如圖8所示。

    圖8 萃取溫度對花生殼中木犀草素提取率的影響Fig.8 Effect of extraction temperature on extraction rate of luteolin from peanut shell

    從圖8可以看出,萃取溫度對花生殼中木犀草素提取率的影響很明顯。當萃取溫度低于80℃時,木犀草素提取率隨溫度的升高而增加,而當萃取溫度高于80℃時,木犀草素提取率隨溫度的升高反而有所降低。這是由于在乙醇溶液提取木犀草素的過程中,溫度既影響溶質(zhì)在溶劑中的溶解速度,又影響溶質(zhì)向外擴散的速度。另外,溫度的升高也會提高木犀草素在萃取劑中的溶解度。但是由于木犀草素為黃酮類化合物,對熱比較敏感,高溫會加速其氧化,所以萃取溫度也不是越高越好。當萃取溫度為80℃左右時,萃取效果較好。

    2.3.6 萃取時間對花生殼中木犀草素提取率的影響

    采用石油醚對花生殼脫脂預處理24 h,固定料液比為1∶20(g/mL),萃取溫度為80℃,乙醇溶液體積分數(shù)為 75%,考察萃取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)對花生殼提取物中木犀草素提取率的影響,結(jié)果如圖9所示。

    圖9 萃取時間對花生殼中木犀草素提取率的影響Fig.9 Effect of extraction time on extraction rate of luteolin from peanut shell

    從圖9可以看出,隨著萃取時間的增加,花生殼中木犀草素的提取率也增加,但是當時間超過2.0 h時,木犀草素的提取率呈降低趨勢。這是由于長時間的加熱會造成木犀草素受熱氧化,從而使得木犀草素提取率降低,因此,選擇萃取時間為2.0 h效果較好。

    3 結(jié)論

    采用連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素,節(jié)省溶劑,操作簡單,工藝流程短,提取率高,含雜質(zhì)少,殘渣少,耗能小,符合綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展原則,經(jīng)濟和社會效益顯著,具有省工省時,便于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點。本試驗結(jié)果表明,使用石油醚對花生殼進行脫脂預處理,以75%乙醇溶液為萃取劑,采用連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素,料液比為1∶20(g/mL),萃取溫度為80℃,萃取時間為2.0 h時,提取率可達到0.32 mg/g,純度可達到67.86%,可明顯增加花生殼提取物中木犀草素的提取率。

    花生殼資源的綜合利用屬于典型的低碳經(jīng)濟。鄭州市花生種植面積大,產(chǎn)量高,花生殼資源豐富,價格低廉,但回收利用較少,造成自然資源的浪費及一定程度的環(huán)境污染。本研究旨在為花生殼中木犀草素的生產(chǎn)提供參考,使花生殼資源得到綜合利用,同時也能獲得良好的經(jīng)濟效益和社會效益,具有廣闊的開發(fā)前景和重要的社會價值。

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