電化學(xué)生物傳感器及其檢測大腸桿菌的研究

曹卓松，孫飛龍，李辰宇，楊曉波，王尚，薛斌，趙辰，張曦，諶志強，王景峰，邱志剛*

（1.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710600；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

電化學(xué)生物傳感器是通過測量電化學(xué)信號檢測微生物的生物傳感器，這種傳感器是以生物敏感材料（如抗體等）作為識別元件特異性識別待測物，以電極（如玻碳固體電極等）作為轉(zhuǎn)換元件將物理或化學(xué)變化轉(zhuǎn)換為電信號，通過信號放大并處理從而實現(xiàn)定性或定量分析待測物[1]。近年來電化學(xué)生物傳感器隨著材料、生物、電化學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展也取得了巨大進(jìn)步，各領(lǐng)域?qū)W者也報道了大量新型電化學(xué)生物傳感器。

大腸桿菌是廣泛存在于水體中的一類致病菌，人體感染其可引起闌尾炎、膽囊炎等疾病，嚴(yán)重情況甚至可導(dǎo)致死亡[2-3]。傳統(tǒng)檢測大腸桿菌的方法主要有操作復(fù)雜、檢測耗時長的濾膜法、多管發(fā)酵法等，其缺點是很難滿足污染源快速檢測的需求。近年來發(fā)展的許多檢測方法[如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[4-5]、免疫學(xué)檢測[6-7]等]均具有獨特優(yōu)勢，但仍達(dá)不到現(xiàn)場檢測的時間要求。因此，電化學(xué)生物傳感器因其靈敏度高、特異性強、耗時短的優(yōu)勢迅速發(fā)展起來。

本文介紹了電化學(xué)生物傳感器的檢測原理及常用的檢測技術(shù)，探討了電化學(xué)生物傳感器在大腸桿菌檢測方面的傳感原理及應(yīng)用成果，并對電化學(xué)生物傳感器發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 大腸桿菌

1.1 生物學(xué)特性及致病性

大腸桿菌，又稱大腸埃希氏菌（Escherichia coli），是一種兩端鈍圓的短桿菌，屬腸桿菌科、埃希氏菌屬，革蘭氏陰性菌種，大量存在于恒溫動物腸道內(nèi)，是腸道內(nèi)正常棲息菌，可隨糞便排出后在自然界廣泛散播，因此環(huán)境內(nèi)檢出大腸桿菌則表明被糞便感染。所以從大腸桿菌被發(fā)現(xiàn)開始，其就被作為食品類糞源污染的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)及水體衛(wèi)生學(xué)檢測的微生物指標(biāo)[8]。

大部分大腸桿菌無致病性，少部分菌種可產(chǎn)生腸毒素，能導(dǎo)致腸胃炎等疾病，是食物中毒主要原因之一[9]。若人體其他組織器官遭到大腸桿菌侵染，還可引起尿道炎、膀胱炎等疾病，甚至還能導(dǎo)致免疫力較弱人群引起敗血癥[10]。

1.2 檢測方法研究現(xiàn)狀

目前世界普遍采用的大腸桿菌檢測方法有稀釋平板計數(shù)法、多管發(fā)酵法和濾膜法[11]。其中前兩者適用范圍廣，但操作繁瑣耗時長；而濾膜法僅適用于雜質(zhì)較少的水樣，較前兩者操作相對簡單；這幾種傳統(tǒng)方法在檢測周期、檢測效率等方面都存在不足，無法滿足快速檢測的需求[12]。近年來除了傳統(tǒng)的檢測方法外，在各界學(xué)者的大量研究下也發(fā)展了許多檢測大腸桿菌的新方法，如PCR法、免疫法、酶底物法、電化學(xué)法等。

PCR技術(shù)，在檢測大腸桿菌方面具有快速靈敏等優(yōu)勢，其原理是以擴增的目標(biāo)DNA為模板，將與模板互補的寡核苷酸片段作為引物，在DNA聚合酶作用下沿著模板延伸至完成新的DNA的合成，目前大腸桿菌PCR技術(shù)主要是針對致病性大腸桿菌的致病基因[13]。但該方法也存在反應(yīng)效率差異大、擴增產(chǎn)物長度有限等不足。

免疫法是基于抗原抗體之間特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測的一種方法，其通過對反應(yīng)物進(jìn)行示蹤物標(biāo)記，利用抗原或抗體進(jìn)行快速定量檢測。免疫法在檢測大腸桿菌方面主要方法有免疫磁珠法、酶聯(lián)免疫吸附法、熒光免疫法等[14]。免疫法具有特異性強、耗時短、靈敏度高等優(yōu)勢，但待測物抗體的制備較為復(fù)雜。

酶底物法基于微生物代謝過程中產(chǎn)生的特異性酶可以專一地催化底物的原理對微生物進(jìn)行檢測，大腸桿菌較其他微生物特有的酶是β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，該酶通常作為大腸桿菌標(biāo)志酶[15]。基于β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶檢測大腸桿菌的方法被廣泛應(yīng)用，也研究了多種可用于顯色反應(yīng)或熒光反應(yīng)的催化底物。雖然該方法在特異性方面有出色表現(xiàn)，但技術(shù)本身的局限性導(dǎo)致了其靈敏度不高。

電化學(xué)法是通過制備電化學(xué)生物傳感器，利用微生物的物理、化學(xué)或電學(xué)變化及獨特的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析的研究方法。電化學(xué)檢測大腸桿菌的方法常分為3類：基于標(biāo)記的間接檢測方法、基于無標(biāo)記的直接檢測方法、基于微生物代謝的檢測方法。電化學(xué)方法得以廣泛研究應(yīng)用的主要原因在于其具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，且檢測范圍廣、特異性強、耗時短，重要的是其可以通過與其他技術(shù)聯(lián)用以滿足不同的需求。

2 電化學(xué)生物傳感器技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 檢測原理

電化學(xué)檢測原理是復(fù)相化學(xué)反應(yīng)，一般反應(yīng)形式如公式（1）所示。

式中：O為化合物的氧化態(tài)，R為還原態(tài)，ne為氧化還原反應(yīng)轉(zhuǎn)移的電子。電極表面反應(yīng)過程主要為：O從溶液中遷移至電極/溶液界面→O在電極表面吸附→O得電子還原為R→R從電極表面解析→R從電極/溶液界面遷移至溶液中，該過程為法拉第過程。電極表面的雙電層結(jié)構(gòu)（電極/溶液界面）相當(dāng)于一個電容器，其具有電容特性，當(dāng)電極電位改變時雙電層充電或放電，該過程電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生電信號，通過對電信號的采集處理即可實現(xiàn)對樣品的檢測。

穩(wěn)態(tài)測量技術(shù)：電化學(xué)穩(wěn)態(tài)是指電化學(xué)系統(tǒng)的參數(shù)（如電極界面狀態(tài)、電流密度、電極電勢等）沒有變化或變化可忽略的狀態(tài)。穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的特點是穩(wěn)態(tài)電流全部用于電化學(xué)反應(yīng)，且電極界面上擴散層范圍不變，擴散層厚度恒定。穩(wěn)態(tài)法檢測的是電極過程達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后電流密度與電極電勢的關(guān)系，此時電流密度與電極電勢不隨時間改變，外電路即代表速率。Rocchini等[16-17]學(xué)者利用穩(wěn)態(tài)技術(shù)論述了極化曲線動力學(xué)計算對掃描速率的影響。值得注意的是，在使用固體電極時，隨著測量時間的延長，電極表面狀態(tài)及其表面積的變化情況逐漸累積，不可忽略。

暫態(tài)測量技術(shù)：暫態(tài)是當(dāng)系統(tǒng)極化條件改變時電極經(jīng)歷的一段不穩(wěn)定、變化的階段，是電極從一個穩(wěn)態(tài)向另一個穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)變的過渡狀態(tài)。暫態(tài)過程具有雙電層充電電流，且電極附近液層中的電極電勢、雙電層結(jié)構(gòu)、擴散層厚度、濃度梯度等參數(shù)均隨時間變化。暫態(tài)法主要研究手段依據(jù)施加擾動信號的大小分類，小幅度擾動信號（濃差極化可忽略）采用等效電路研究，電極過程處于傳荷過程控制，大幅度擾動信號（濃差極化不可忽略）采用方程解析法研究。暫態(tài)法主要可用于測量 i、k 等動力學(xué)參數(shù)[18-20]，雙電層電容[21-22]、溶液電阻[23-25]等電化學(xué)參數(shù)，電沉積[26-27]、金屬腐蝕[28-29]等表面狀態(tài)變化快的體系。

2.2 技術(shù)分類

線性電勢掃描法，在電化學(xué)分析中又稱伏安法，是通過控制電極電勢以恒定速率變化來測量電極電流的方法，其中常用的檢測手段包括薄層伏安法、循環(huán)掃描法、循環(huán)伏安法等。一般情況下線性掃描有以下特點：測得的電流是電極雙電層充電電流和放電電流之和；由于電勢不斷變化，因此雙電層充電電流不為零；雙電層電容隨著電勢變化而改變；而電勢變化也導(dǎo)致反應(yīng)速率改變。特別的是，如果電極表面在電勢變化范圍內(nèi)不發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，則相當(dāng)于理想極化電極，測得曲線反映的即是雙電層電容和電勢的關(guān)系。

脈沖伏安法是通過消除充電電流進(jìn)行研究的一種極譜技術(shù)，其具有分辨率高、靈敏度強等特點。該技術(shù)方法被廣泛應(yīng)用于痕量分析[30-32]的原因是其通過充分減少充電電流和毛細(xì)管噪聲電流，提高了信噪比，使其達(dá)到極高的靈敏度。脈沖技術(shù)又可細(xì)分為常規(guī)脈沖伏安法、微分脈沖伏安法、差示脈沖伏安法、方波伏安法等，其中差示脈沖伏安法和方波伏安法是靈敏度最高的檢測方法。

電化學(xué)阻抗法是屬于暫態(tài)電化學(xué)技術(shù)的一類檢測方法，其原理也是向電化學(xué)系統(tǒng)施加一個擾動信號，通過觀測系統(tǒng)電信號響應(yīng)分析系統(tǒng)電化學(xué)性質(zhì)，特別的是其施加的電信號是不同頻率的振幅較小的正弦電勢波，測量的信號是電勢與電流信號的比值（即阻抗）。由于電化學(xué)阻抗法向電極施加的是小振幅交流電信號，因此當(dāng)頻率足夠高時其表面狀態(tài)化和濃差極化不至太嚴(yán)重，且不會導(dǎo)致極化累積，避免了對電化學(xué)體系產(chǎn)生過大的影響。

3 電化學(xué)生物傳感器檢測大腸桿菌的進(jìn)展

電化學(xué)生物傳感器用于直接檢測大腸桿菌的技術(shù)根據(jù)制造傳感器的檢測策略分為依賴標(biāo)記的檢測技術(shù)和無標(biāo)記檢測技術(shù)，其中依賴標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器采用間接檢測法，一般情況下采用生物分子或其他理化分子（如酶、金屬納米顆粒等）對目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行標(biāo)記，用于誘導(dǎo)電化學(xué)信號進(jìn)行測量。而無標(biāo)記檢測技術(shù)是在電極表面固定生物受體（如抗體、核酸等）用于特異性識別，在不進(jìn)行標(biāo)記的條件下，通過細(xì)菌的附著引起電化學(xué)參數(shù)變化，從而直接檢測目標(biāo)細(xì)菌。除上述兩種直接檢測大腸桿菌的技術(shù)外，還有一種采用通過對大腸桿菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析從而間接檢測大腸桿菌的技術(shù)，即基于微生物代謝的檢測技術(shù)。

3.1 基于標(biāo)記的間接檢測傳感器

Gehring等[33]基于酶聯(lián)免疫法制備了酶聯(lián)免疫磁電化學(xué)生物傳感器，將大腸桿菌固定在免疫磁珠和酶結(jié)合抗體之間制成三明治結(jié)構(gòu)，多孔板磁化石墨電極用于吸附被捕獲的大腸桿菌，該傳感器在緩沖溶液中檢測限為3.3×103cfu/mL。由于傳感器檢測的電信號是由標(biāo)簽轉(zhuǎn)換而來，則還有一種檢測思路是采用多個不同的標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，從而實現(xiàn)對多個細(xì)菌進(jìn)行同時檢測。Viswanathan等[34]制備了一種可以同時檢測大腸桿菌、沙門氏菌和彎曲桿菌的傳感器，他們將這3種細(xì)菌分別用 Cd、Cu、Pb 標(biāo)簽標(biāo)記為 E.coli-CdS、Salmonella-CuS、Campylobacter-PbS，并將這3種細(xì)菌的抗體功能化多壁碳納米管-聚烯丙基胺修飾到絲網(wǎng)印刷電極表面，被標(biāo)記的細(xì)菌被捕獲后與特定的抗體結(jié)合并釋放標(biāo)記物金屬離子，通過對不同金屬離子的測定實現(xiàn)對不同細(xì)菌的定量檢測，3種細(xì)菌檢測限分別為0.8×103、0.4×103、0.4×103cfu/mL。

基于標(biāo)記的電化學(xué)傳感器優(yōu)勢在于其通過標(biāo)記實現(xiàn)了對電信號的放大，從而降低了檢測限、提高了特異性。但是，這類電化學(xué)傳感器由于標(biāo)記過程的復(fù)雜性而延長了檢測時間、增加操作難度。

3.2 基于無標(biāo)記的直接檢測傳感器

根據(jù)Wang等[35]的報道，天然細(xì)菌細(xì)胞膜厚度為5 nm～10 nm，因為膜的選擇透過性所以細(xì)菌電阻為102Ωcm2～105Ωcm2，電容為 0.5 μF/cm2～1.3 μF/cm2，因此細(xì)菌在電極表面的附著可以引起電化學(xué)參數(shù)的變化。Zelada-Guillén等[36]制備了一種簡單直接有效的傳感器用于檢測大腸桿菌，該傳感器通過在修飾有單壁碳納米管的玻碳電極表面固定適配子實現(xiàn)了對大腸桿菌的特異性檢測，經(jīng)過對食品樣液預(yù)處理后，該傳感器在牛奶中檢測限達(dá)到6 cfu/mL，在蘋果汁中達(dá)到26 cfu/mL。Li等[37]利用石英晶金電極制備了一種免疫傳感器，該傳感器先用蛋白A對電極進(jìn)行簡單修飾，然后用抗大腸桿菌抗體進(jìn)行功能化，由于該傳感器的電極表面積較大，從而可以捕獲更多細(xì)菌，增大了電阻變化，該傳感器檢測限為103cfu/mL。

相較于基于標(biāo)記的電化學(xué)傳感器，無標(biāo)記電化學(xué)傳感器最大的優(yōu)勢在于檢測時間短、檢測過程簡單，但是也存在檢測限不夠低、靈敏度不夠高、電極再生困難等不足。

3.3 基于微生物代謝的檢測傳感器

活的微生物在生長代謝過程中加入某些特定介質(zhì)后，能通過代謝時發(fā)生的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號，目前該技術(shù)主要基于傳感器上的pH值、離子濃度、電阻等電化學(xué)參數(shù)的變化對細(xì)菌進(jìn)行檢測，多年來，依據(jù)對微生物代謝過程進(jìn)行檢測從而實現(xiàn)定量檢測的傳感器已不在少數(shù)[38-39]。

Sippy等[40]依據(jù)大腸桿菌在代謝過程中能產(chǎn)生分解過氧化氫的過氧化氫酶[41]的原理，通過檢測大腸桿菌代謝消耗的過氧化氫的量實現(xiàn)了對大腸桿菌的定量檢測，該傳感器檢測范圍為20cfu/mL～2.0×107cfu/mL。程欲曉[10]通過對大腸桿菌溶液進(jìn)行預(yù)處理，使代謝產(chǎn)物β-D-半乳糖苷酶釋放到溶液中，再向溶液添加底物氨基酚-β-D半乳糖苷酶，利用代謝產(chǎn)物水解底物產(chǎn)生對氨基酚的反應(yīng)，制備了大腸桿菌電化學(xué)傳感器，傳感器檢測范圍為50 cfu/mL～1.0×105cfu/mL。

基于微生物代謝的檢測傳感器在檢測大腸桿菌方面具有方便快捷的獨特優(yōu)勢，但仍存在特異性不高、靈敏度低等不足。

4 展望

由于大腸桿菌作為重要的環(huán)境監(jiān)測指標(biāo)且其在食品領(lǐng)域零容忍的政策，因此對大腸桿菌的檢測有著較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，在電化學(xué)生物傳感器方面也有靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、檢測時間等指標(biāo)的要求。近年來，隨著納米技術(shù)、小型芯片技術(shù)、絲網(wǎng)印刷技術(shù)在電化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，電化學(xué)生物傳感器也得到了迅速的發(fā)展，且逐漸被認(rèn)為是微生物現(xiàn)場檢測最具前景的檢測方法。電化學(xué)生物傳感器雖然有小型化、成本低、受樣品影響小等優(yōu)勢，但在穩(wěn)定性、易保存性、可再生性及批量生產(chǎn)實現(xiàn)商品化方面仍有較大發(fā)展空間，而且目前尚缺少對于電化學(xué)生物傳感器的官方統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此，實現(xiàn)電化學(xué)生物傳感器商業(yè)化仍任重道遠(yuǎn)。