亞硝酸鹽還原酶高產(chǎn)菌株的篩選與產(chǎn)酶條件的研究

付豪，鄧艷芳，黃麗玲，趙丹，王昌濤，2，李萌*

（1.北京工商大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.北京工商大學(xué)北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

亞硝酸鹽（nitrite，NIT）外觀與食用鹽極為相似，顏色為白色或者黃色，普遍存在于自然界和日常生活中。在自然環(huán)境下，NIT由硝酸鹽還原生成和銨鹽氧化生成，硝酸鹽和銨鹽本身都是無毒的，在特定條件下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)后就會(huì)生成有毒的NIT，NIT被用作添加劑是法定許可的，而且常作為添加劑廣泛用于食品加工中。當(dāng)然，NIT的使用量須嚴(yán)格管控，GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定其使用量不得超過150 mg/kg，殘留量不得超過30 mg/kg[1]?，F(xiàn)在常用降解NIT的方法有：加入酸性物質(zhì)使亞硝酸鹽生成不穩(wěn)定的亞硝酸，亞硝酸分解又可以生成對(duì)心血管有益的NO；加入堿性氨基酸使NIT轉(zhuǎn)變成亞硝胺；加入高濃度食鹽溶液，使離子濃度增高，降低pH值的同時(shí)降低NIT濃度[2]。乳酸菌發(fā)酵法是一種更為安全、快速的方法[3]，當(dāng)乳酸菌在有亞硝酸鹽的環(huán)境時(shí)，自身會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶，從而達(dá)到降低亞硝酸鹽含量的目的。乳酸菌發(fā)酵前期pH值較高，主要是通過亞硝酸鹽還原酶來降解NIT，隨著乳酸菌生產(chǎn)的乳酸越來越多，其pH值會(huì)一直下降，發(fā)酵后期降解NIT則主要由乳酸來實(shí)現(xiàn)。

亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase，NIR）能夠還原亞硝酸鹽，生成NH4+或N2。目前，亞硝酸鹽還原酶已從多種高等植物、藍(lán)藻、細(xì)菌分離提純獲得。此外，NIR是一種胞內(nèi)酶，大多數(shù)位于周質(zhì)間隙或細(xì)胞膜中。亞硝酸鹽還原酶在植物和微生物細(xì)胞內(nèi)分布在不同位置，因此需要利用不同的處理方法來提取酶液[4]。主要的方法原理是：根據(jù)酶的疏水性和分子大小等性質(zhì)，用疏水相互作用、尺寸排阻色譜等方法純化還原酶[5]。自20世紀(jì)80年代起，國(guó)內(nèi)外研究者從分離純化、定位、光譜性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)和編碼基因等方面，探討了亞硝酸鹽還原酶的性質(zhì)。迄今為止，人們研究發(fā)現(xiàn)了4種亞硝酸還原酶：nirK、nirS、nrfA、nasB[6]。亞硝酸還原酶基因和蛋白序列的差異性很大，同種類微生物中不同類型的亞硝酸還原酶，不同種類微生物中不同類型的亞硝酸還原酶，其序列也會(huì)表現(xiàn)出明顯的差異性。大腸桿菌中的降解亞硝酸鹽活性的功能基因片段，利用生物信息分析手段已經(jīng)被確定[7]。目前植物乳桿菌上編碼硝酸還原酶的功能性基因還未被明確，根據(jù)基因庫中已知的亞硝酸鹽還原酶蛋白序列的保守序列，查找到了植物乳桿菌功能基因組上的亞硝酸鹽還原酶疑似基因[8-9]。

植物乳桿菌等產(chǎn)生的NIR在25℃～38℃時(shí)酶活均較高，其最適溫度為30℃左右，當(dāng)溫度為15℃時(shí)，NIR的酶活會(huì)受到抑制，酶活力降至原來的10%；當(dāng)溫度為50℃時(shí)，酶會(huì)失去活性。NIR在pH值為5～6時(shí)，酶均表現(xiàn)有較明顯活力，酶的最適反應(yīng)pH值為5.5。與酸性環(huán)境不一樣，在堿性環(huán)境中，酶活性將受到限制甚至全部消失。在這些最適反應(yīng)條件下，測(cè)得酶的米氏常數(shù)Km值為120.5 μg/mL[10]。

目前研究表明，只有部分乳酸菌會(huì)產(chǎn)生NIR，且會(huì)因基因表達(dá)差異而產(chǎn)生不同類型的亞硝酸鹽還原酶。本文對(duì)自然發(fā)酵泡菜中產(chǎn)生的亞硝酸鹽微生物進(jìn)行分離純化，對(duì)其中降解NIT效率最高的菌株鼠李糖乳桿菌N-6的培養(yǎng)基和部分培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)酶液進(jìn)行初步純化，并測(cè)定純化后的酶活性。

1 材料與方法

1.1 材料

自然發(fā)酵泡菜：市售；MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨2g、葡萄糖 4 g、乙酸鈉 1 g、硫酸鎂0.04 g、硫酸錳 0.01 g、牛肉粉1 g、酵母粉0.8 g、磷酸氫二鉀0.4 g、檸檬酸三銨0.4 g、吐溫80 0.2 mL、蒸餾水200 mL；平板篩選培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加入2.8 g瓊脂，200 mL去離子水；鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸、亞硝酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、葡萄糖、乙酸鈉、鹽酸萘乙二胺、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、對(duì)氨基苯磺酸、硼酸鈉、乙酸鋅、亞氰化鉀、鹽酸、冰乙酸（分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

BS2202S型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BXM-30R高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HH-SY11-Ni1電熱恒溫水浴鍋：北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；UVmini－1240紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；4k15 3-18k冷凍高速離心機(jī)：Sigma公司；DYY-12C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 亞硝酸鈉含量測(cè)定

1.3.1 溶液配制

鹽酸萘乙二胺溶液：準(zhǔn)確稱取0.1 g鹽酸萘乙二胺，溶解于50 mL超純水中，混勻，置棕色瓶中，避光4℃保存待用；對(duì)氨基苯磺酸溶液：稱取0.4 g對(duì)氨基苯磺酸，溶于100mL20%鹽酸中，置于棕色瓶中混勻，避光保存待用。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1 g亞硝酸鈉，加入超純水溶解，移入500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，此溶液即為亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

準(zhǔn)確吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、5.0 mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于50 mL容量瓶中，加入40 mL超純水，搖勻，加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，置于避光處反應(yīng)5 min；再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，定容至50 mL，混勻，避光靜置15 min。設(shè)置分光光度計(jì)波長(zhǎng)為538 nm，分別測(cè)定吸光值，以亞硝酸鈉溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。亞硝酸鈉在0～0.25 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與A538呈良好的線性關(guān)系，以吸光度A538對(duì)亞硝酸鈉濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程如下：y=1.058 3x+0.001 5（R2=0.998 72）；y 表示吸光度值 A538；x 表示亞硝酸鈉濃度，μg/mL。

1.4 高產(chǎn)NIR的乳酸菌篩選

1.4.1 菌株活化

活化培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，配制100 mL MRS培養(yǎng)基，接種1 g雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑，置于搖床中30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)24 h。

1.4.2 分離篩選

配制300 mL MRS瓊脂培養(yǎng)基將活化好的新鮮種子液分別稀釋1、10、100、1 000倍，將這4種濃度的菌液以涂布法接種在平板中，每個(gè)濃度接種2個(gè)平板，30℃培養(yǎng)24 h。配制500 mL MRS液體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，選取長(zhǎng)勢(shì)較好菌落，用接種環(huán)分別接種到錐形瓶中，30℃培養(yǎng)24 h。從平板中篩選的菌落序號(hào)分別為 N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-10、N-14、N-17、N-21、N-22、N-25、N-28、N-29、N-31[11]。

1.4.3 鹽酸萘乙二胺分光光度法測(cè)定菌株分解亞硝酸鹽能力

1.4.3.1 溶液配制

飽和硼酸鈉溶液：稱取50 g硼酸鈉，溶于1 000 mL熱水中，冷卻備用；乙酸鋅溶液：稱取22 g乙酸鋅，加入3 mL冰乙酸，最后再加水稀釋到100 mL；亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6 g亞鐵氰化鉀，加水至100 mL，攪拌溶解；鹽酸萘乙二胺溶液：稱取0.1 g鹽酸萘乙二胺，溶解于50 mL水中，攪拌混勻，放入棕色瓶中備用；對(duì)氨基苯磺酸溶液：稱取0.4 g對(duì)氨基苯磺酸，溶解于100 mL去離子水中，放進(jìn)棕色瓶中備用。

配制NaNO2濃度為125 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基500 mL和不含NaNO2的液體培養(yǎng)基100 mL，以接種量3%，30℃培養(yǎng)24 h[12]。

1.4.3.2 吸光度測(cè)定

試樣處理：吸取5 mL樣品，分別置于250 mL三角瓶中，加入飽和硼砂溶液12.5mL，搖勻后再加入約50 mL蒸餾水，沸水鍋里加熱15 min，取出后冷卻至25℃，再轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加入5mL亞鐵氰化鉀溶液，混勻，再加入5mL乙酸鋅溶液，定容到100mL，充分混勻，靜置約30 min，沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。這沉淀進(jìn)行抽濾，棄去初濾液30 mL，收集剩余的濾液。

吸取2 mL上述濾液于50 mL容量瓶中，加水40 mL，搖晃均勻，先加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，定容至50 mL，混勻，避光靜置15 min，在波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光值[13]。

1.5 菌株篩選

引物序列為 27f：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG；1492r：GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變形 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸1.5min，共循環(huán)30次，最后72℃延伸10min?；驕y(cè)序：由北京華大測(cè)序公司進(jìn)行。

1.6 影響高產(chǎn)菌株NIR的培養(yǎng)條件優(yōu)化

篩選出的高產(chǎn)菌株，以NIT為指標(biāo)，以碳源、氮源、磷源、培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)方式作為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，初始培養(yǎng)條件設(shè)定為2%葡萄糖、0.5%酪蛋白胨、0.2%磷酸二氫鉀、培養(yǎng)溫度37℃，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，其中碳源分別選取蔗糖、葡萄糖和乳糖，并以不加碳源為空白對(duì)照。氮源分別選取蛋白胨、酪蛋白胨及胰蛋白胨，以不加氮源為空白對(duì)照，磷源分別選取磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鉀，以不加磷源為無磷空白對(duì)照，培養(yǎng)溫度分別選取 20、30、37、40 ℃，培養(yǎng)方式選用動(dòng)態(tài)和靜態(tài)兩種不同培養(yǎng)方式[14]。

1.7 亞硝酸還原酶的提取與分離純化

1.7.1 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

雙縮脲法測(cè)定蛋白含量，首先制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得蛋白質(zhì)含量的回歸方程曲線y=0.077 3x+0.005，回歸系數(shù)R2=0.999 3，線性度較好[15]。

1.7.2 酶活測(cè)定方法

1.7.2.1 酶活力計(jì)算

酶活力單位定義：每小時(shí)降解1 μg亞硝酸鹽所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U），即1 U=1 μg/h。

1.7.2.2 酶活反應(yīng)體系

取干凈試管，加入1%葡萄糖1mL，50μg/mLNaNO21 mL，0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH7.2）7 mL，酶液1 mL，在40℃保溫反應(yīng)24 h。加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL，混勻，避光靜置5 min。再加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液1 mL，靜置15 min，在538 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值計(jì)算酶活力。以磷酸緩沖液代替酶液為空白對(duì)照，以磷酸緩沖液代替NaNO2溶液和酶液作為調(diào)零值[16]。

1.7.3 粗酶液制備與純化

亞硝酸還原酶粗酶液的提取制備方法為溶菌酶和超聲波破碎，具體制備過程參照文獻(xiàn)[17]。粗酶液的純化步驟：粗酶液—硫酸銨分級(jí)鹽析—透析—二乙基氨基乙基纖維素陰離子交換層析—透析—濃縮—目的蛋白，具體操作過程見文獻(xiàn)[18]。

1.7.3.1 NIR粗酶液的制備

將初篩獲得的菌株分別接入含0.2 mg/mL亞硝酸鈉的培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。分別取菌液100 mL，6 000 r/min 4℃離心10 min。收集沉淀，棄去上清液，用10 mL磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）。振蕩，將菌體懸浮，加入溶菌酶，使其濃度為5 mg/mL，30℃反應(yīng)24 h。經(jīng)過超聲波破碎后，8 000 r/min 4℃離心15 min。取上清液即為粗酶液[19]。

1.7.3.2 硫酸銨分級(jí)鹽析

本研究采用硫酸銨沉淀法來沉淀上清液中的蛋白成分。

根據(jù)鹽析粗酶液的體積，稱取30%硫酸銨，置于4℃冰箱 4h，再離心（20 min、6 000 r/min），留上清液去沉淀。向上清液中繼續(xù)添加硫酸銨（飽和度達(dá)到60%），4℃放置 4 h，離心（15 min，1 200 r/min），收集沉淀。將沉淀溶于粗酶液同體積的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH7.2）[20]。

1.7.3.3 透析

選用的透析袋截留范圍是8 000～14 000，透析袋的預(yù)處理參考文獻(xiàn)[21]。

1.7.3.4 二乙基氨基乙基纖維素（diethylaminoethylcellulose，DEAE）陰離子交換層析

選擇的陰離子交換層析為DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B，層析柱規(guī)格為1.6 cm×30 cm。具體操作步驟如下：根據(jù)柱子大小取適量的凝膠。凝膠高度達(dá)到柱子高度的80%左右，自然沉降。沉降完成后用去離子水平衡12 h，備用，取粗酶液，上樣量3 mL。上樣前過0.22 mm孔徑聚醚砜濾膜，除去不溶物。洗脫：用含0.5 mol/L NaCl的0.002 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽在2 mL/min的流速下進(jìn)行洗脫，洗脫液每5 min收集一管，每管3 mL，共收集80管；檢測(cè)：經(jīng)酶標(biāo)儀在280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每一管蛋白溶液的吸光值，并繪制層析圖譜。然后收集峰值較高處的蛋白，用雙縮脲法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量；再生：用洗脫液洗脫各組分直到完全洗脫，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，并利用Origin95進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落初步篩選

不同菌落作用后的亞硝酸鈉含量見圖1。

通過鹽酸萘乙二胺分光光度法測(cè)試菌株分解亞硝酸鹽能力，由圖1可知，亞硝酸鈉含量越高，意味著降解率越底，因此初步篩選出亞硝酸鈉含量較低的菌落，分別為 N-6、N-25、N-28、N-31。

圖1 不同菌落作用后的亞硝酸鈉含量Fig.1 Sodium nitrite content after different colonies

2.2 高產(chǎn)NIR酶活測(cè)定結(jié)果

不同菌落的NIT降解率結(jié)果見圖2。

圖2 不同菌落的NIT降解率Fig.2 NIT degradation rate of different colonies

如圖2所示，從泡菜樣品中，初步篩選得出N-6、N-25、N-28、N-31號(hào)乳酸桿菌可高效降解NIT，其中N-6的降解率最高。經(jīng)16SrDNA序列測(cè)序鑒定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。

2.3 鼠李糖乳桿菌N-6培養(yǎng)條件優(yōu)化

試驗(yàn)得出了鼠李糖乳桿菌N-6為最高產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的乳桿菌，因此將進(jìn)一步研究探索出影響鼠李糖乳桿菌產(chǎn)生NIR的最佳條件。影響乳桿菌降解NIT因素有很多，包括碳源、氮源、磷源、培養(yǎng)方式及培養(yǎng)溫度等，本文對(duì)上述影響因素進(jìn)行試驗(yàn)，得到鼠李糖乳桿菌產(chǎn)生NIR的最佳條件。

2.3.1 碳源對(duì)亞硝酸還原酶活性的影響

不同碳源對(duì)鼠李糖乳桿菌降解亞硝酸鹽結(jié)果見圖3。

由圖3可知，無碳對(duì)照的NIT降解率為0.01%，由此說明碳源對(duì)鼠李糖乳桿菌影響較大，其中葡萄糖為最佳碳源，其降解率為52.22%，其降解亞硝酸鈉的能力明顯更強(qiáng)。這可能是由于鼠李糖乳桿菌自身對(duì)糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝效率會(huì)因糖而異，導(dǎo)致在降解亞硝酸鹽上的差別。

圖3 不同碳源對(duì)降解NIT的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on degradation of NIT

2.3.2 氮源對(duì)亞硝酸還原酶活性的影響

不同氮源對(duì)降解NIT的影響見圖4。

圖4 不同氮源對(duì)降解NIT的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on degradation of NIT

由圖4可知，無氮對(duì)照的NIT降解率為44.44%，其中氮源為酪蛋白胨時(shí)鼠李糖乳桿菌的降解率最高，為68.89%。因此，此菌的最佳氮源為酪蛋白胨。

2.3.3 磷源對(duì)亞硝酸還原酶活性的影響

不同磷源對(duì)鼠李糖乳桿菌降解亞硝酸鹽結(jié)果見圖5。

由圖5可知，無磷對(duì)照的降解率高于磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉，而低于磷酸二氫鉀，因此鼠李糖乳桿菌的最佳磷源為磷酸二氫鉀。

圖5 不同磷源對(duì)NIT降解率的影響Fig.5 Effect of different phosphorus sources on the degradation rate of NIT

2.3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)鼠李糖乳桿菌降解亞硝酸鹽的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)鼠李糖乳桿菌降解亞硝酸鹽結(jié)果見圖6。

由圖6可知，鼠李糖乳桿菌的最適培養(yǎng)溫度為37℃。

圖6 不同溫度條件下的NIT降解率Fig.6 NIT degradation rate under different temperature conditions

2.3.5 不同培養(yǎng)方式對(duì)亞硝酸還原酶活性的影響

采用靜置培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)（搖床通氣培養(yǎng)）兩種培養(yǎng)方式，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌時(shí)，其亞硝酸鹽降解率較高，而靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)亞硝酸鹽降解率相對(duì)較低，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分能被充分利用，菌株活力變強(qiáng)，而靜態(tài)培養(yǎng)的菌株則相對(duì)不能充分利用營(yíng)養(yǎng)。

2.4 亞硝酸還原酶的分離純化

2.4.1 硫酸銨分級(jí)鹽析結(jié)果分析

鹽析過程酶活性見表1。

表1 鹽析過程酶活性Table 1 Enzyme activity during salting out

由表1可知，經(jīng)30%硫酸銨鹽析處理，離心后所得蛋白沉淀測(cè)得酶活：303.875 U/mL；經(jīng)60%硫酸銨處理上清液，離心后所得蛋白沉淀測(cè)得酶活力：309.375 U/mL，上清液中無酶活性。上清液已經(jīng)無法檢測(cè)出酶活性，表明酶蛋白已經(jīng)完全經(jīng)鹽析沉淀下來，得到很好的分離。同時(shí)也表明，60%的硫酸銨濃度更有利于蛋白質(zhì)的析出。因此，對(duì)于此還原酶來說，鹽析時(shí)選擇較高濃度的鹽濃度（60%）比較有利于蛋白質(zhì)沉淀完全。

2.4.2 DEAE陰離子層析交換結(jié)果分析

DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B層析圖譜見圖8。

圖8 DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B層析圖譜Fig.8 DEAE agarose gel CL-6B chromatogram

如圖8所示，DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B層析圖譜包含4個(gè)洗脫峰值，收集這4個(gè)峰值附近的幾個(gè)酶活力高的洗脫液進(jìn)行濃縮，測(cè)定蛋白含量和酶活力。A處的洗脫液酶活力最高為764.49 U/mL，其它洗脫峰經(jīng)檢測(cè)后均無酶活，可能為雜蛋白。

粗酶液、鹽析、透析與陰離子交換柱的蛋白含量與酶活力見表2。

由表2可知，經(jīng)過鹽析后亞硝酸鹽還原酶的活性無顯著提升，在采用透析袋，透析24 h后，經(jīng)透析后測(cè)得還原酶活力為：208.48 U/mL。經(jīng)透析除鹽后，相對(duì)于上述鹽析后的酶液酶活性有所提高。經(jīng)DEAE柱層析分離純化后還原酶的酶活力由60.83 U/mL提高到764.49 U/mL，純化倍數(shù)為12.57倍。

表2 分離純化亞硝酸還原酶蛋白含量及酶活力變化Table 2 Isolation and purification of nitrite reductase protein content and enzyme activity

3 結(jié)論

通過篩選多種乳酸桿菌后得出鼠李糖乳桿菌N-6所產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶的降解能力最強(qiáng)。進(jìn)一步研究出影響鼠李糖產(chǎn)生NIR的最佳條件，培養(yǎng)基中的最適碳源、氮源、磷源、培養(yǎng)方式和溫度分別為2%葡萄糖、0.5%酪蛋白胨、0.2%磷酸二氫鉀、動(dòng)態(tài)培養(yǎng)、37℃。

對(duì)菌液進(jìn)行粗提，對(duì)結(jié)合超聲波法得到的粗酶液、再經(jīng)硫酸銨鹽析、透析、陰離子層析法3種方法逐級(jí)分離純化所提粗酶液，提高酶活性。經(jīng)分離純化后還原酶酶活力由60.83 U/mL提高到764.49 U/mL，有效地提高了還原酶純度。