利用芽孢桿菌去除水體中亞硝酸氮的研究

劉韶娜 余東游 趙智勇*

（1. 云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南昆明650224；2. 浙江大學動物科學學院，浙江杭州310058）

《中國環(huán)境狀況公報》報道，2017年全國地表水污染依然較重。1 940個水質斷面中，Ⅰ至Ⅲ類、Ⅳ至Ⅴ類和劣Ⅴ類水質的斷面比例分別為67.9%、23.8%和8.3%。在監(jiān)測營養(yǎng)狀態(tài)的112 個重要湖泊(水庫)中，劣V類的占10.7%。

亞硝酸鹽是氨轉化為硝酸鹽過程中的中間產(chǎn)物，對魚、蝦的毒性較強，是養(yǎng)殖水域中誘發(fā)暴發(fā)性疾病的重要因素[1-2]。亞硝酸鹽主要通過層狀氯細胞主動運輸穿過鰓，通過體液積累，并競爭性的與血紅蛋白反應生成高鐵血紅蛋白，降低機體運輸氧的能力，從而導致水生生物的窒息死亡[3]，還影響血液中血紅蛋白、血糖、紅細胞總數(shù)、白細胞總數(shù)等血液化學指標。并且也會提高其對細菌性疾病的易感性[4-6]。國家地下水質標準中規(guī)定飲用水中亞硝酸氮濃度不得高于0.02 mg/l。

研究發(fā)現(xiàn)日本囊對蝦幼蝦養(yǎng)殖中亞硝酸氮的安全濃度為42.739 mg/l[7]，當鹽度為2.5%時，墨吉明對蝦的半數(shù)致死量為20.11 mg/l[8]，亞硝酸氮濃度在4 mg/l以下時，羅氏沼蝦的生長能達到最優(yōu)[9]。亞硝酸氮對凡納濱對蝦的安全濃度為0.2 mg/l[10]。杜浩等[11]報道亞硝酸氮對中華鱘稚魚的24、48、72 h 和96 h 的LC50及95%可信區(qū)間分別為7.05（6.22～8.03）、4.07（1.51～7.88）、3.10（2.07～4.34）mg/l 和2.57（2.31～2.85）mg/l。呂敢堂等[12]就亞硝酸氮對三疣梭子蟹幼體饑餓和飽食兩種狀態(tài)下72 h 半致死濃度（LC50）研究發(fā)現(xiàn)分別為0.46 mg/l 和0.56 mg/l，養(yǎng)殖中亞硝酸氮應控制在0.23 mg/l?？傊?，高濃度亞硝酸氮在水產(chǎn)養(yǎng)殖中對生物具有直接或間接致死作用。

生物降氮技術被認為是目前除氮污技術中最經(jīng)濟的方式，而且還安全無二次污染[13-14]。生物處理中以微生物處理為主，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的硝化菌中主要有異養(yǎng)硝化菌和自養(yǎng)硝化菌[15-18]，自養(yǎng)硝化細菌因為分離困難、代時長等特點在一定程度上阻礙硝化細菌作為純微生物制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖領域的推廣應用[19]。目前有關耐高溫高鹽的亞硝酸鹽脫氮菌的特性研究，還較少。

本文通過對已分離到的一株去除亞硝酸氮的菌株JY14 脫氮特性進行研究，為其應用于養(yǎng)殖廢水的處理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用菌株芽孢桿菌來自于實驗室分離、鑒定，NCBI中登錄號為EU581833.1。

硫酸銨、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、碳酸氫鈉、碳酸鈣、硫酸銨等試劑。

UNIC 7200 型分光光度計、電子天平、恒溫振蕩器、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱。

基礎瓊脂培養(yǎng)基：NaNO21 g、FeSO40.03 g、K2HPO41 g、MgSO40.03 g、葡萄糖1 g、蒸餾水1 L、加1.5%的瓊脂粉。

人工廢水：NaNO20.012 g、FeSO40.03 g、K2HPO41 g、MgSO40.03 g、葡萄糖1 g、蒸餾水1 L，分裝到200 ml的三角瓶中，每瓶100 ml，121 ℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析方法

亞硝酸氮測定：N 一(1-萘基)一乙二胺光度法；硝酸鹽氮測定：紫外分光光度法；氨氮測定：納氏試劑法。

1.2.2 不同因素對菌株JY14去除亞硝酸氮的影響

本實驗重點探討碳源、氮源、溫度、pH 值及鹽度對菌株JY14的亞硝酸鹽去除率的影響。在各個單因素影響試驗中，碳源為麥芽糖、蔗糖、淀粉、苯甲酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、草酸鈉、甘露醇、葡萄糖；氮源為大豆蛋白胨、胰蛋白胨、甲魚料、牛肉膏、酵母粉、干酪素；NaCl濃度為0～7%；pH值為3～10；溫度為5～60 ℃，每一因素優(yōu)化結果適用于下一實驗。于培養(yǎng)24 h 后測定亞硝酸氮的濃度。

1.2.3 不同時間對菌株JY14 去除亞硝酸氮能力的影響

將JY14 接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中，在35 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)12 h活化，在人工廢水中按照1%（v/v）的接種量接入培養(yǎng)24 h 的供試菌株菌懸液（設三個重復），在35 ℃，160 r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)32 h，每隔4 h取樣，測定亞硝酸氮含量。

1.2.4 菌株JY14對天然污水中無機氮的影響

本實驗重點探討JY14 在降低亞硝酸氮的同時，對氨氮和硝酸氮的影響。取甲魚池養(yǎng)殖污水滅菌后按照1%（v/v）的接種量接入培養(yǎng)24 h 的供試菌株菌懸液（設三個重復），在35 ℃，160 r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)12 h，每隔4 h測定一次各種無機氮的的濃度，計算各時段氮與起始濃度含量的百分比。

2 結果與分析

2.1 JY14去除亞硝酸氮的代謝特性

2.1.1 碳源對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖1）

圖1 碳源對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

由圖1可以看出，JY14菌株以甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、淀粉為唯一碳源，進行亞硝酸氮去除，在24 h內(nèi)亞硝酸氮去除率達到95%以上，其中以淀粉為碳源的去除率最高，為96.70%，人工廢水中亞硝酸氮濃度可由初始濃度2.53 mg/l降為0.048 mg/l。

2.1.2 氮源對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖2）

由圖2 可以看出，當?shù)礊橛袡C氮源時，JY14 對亞硝酸氮去除率較高，其中干酪素為其去除亞硝酸氮的最適氮源。

圖2 氮源對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

2.1.3 NaCl 含量對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖3）

圖3 NaCl對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

由圖3 可知，當NaCl 含量為0%時，JY14 對亞硝酸氮去除率達到最高，為98.12%，JY14對亞硝酸氮去除率隨著NaCl 含量的增加而降低。可見，氯化鈉的存在對JY14去除亞硝酸氮具有抑制作用。

2.1.4 pH 值對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖4）

由圖4可知，隨著初始pH值的不斷升高，JY14的對亞硝酸氮的去除率也不斷提高，當pH 值為6.0～7.0時，JY14 亞硝酸氮去除率也達到最大。pH 值為6.0～9.0時，JY14菌株對亞硝酸氮去除率在90%之上。pH值繼續(xù)升高，亞硝酸氮去除率逐漸下降。由此可見JY14去除亞硝酸氮最適pH值為7.0。

2.1.5 溫度對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖5）

圖4 pH值對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

圖5 溫度對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

從圖5中可看出25～40 ℃時，溫度對JY14亞硝酸氮去除率影響不顯著，當溫度在30～40 ℃時，JY14 的去除率均在95%以上，30 ℃為其去除亞硝酸氮的最適溫度。

2.1.6 不同時間對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖6）

由圖6 可知，16 h 至實驗結束時，亞硝酸氮去除率為99.50%。且在8～32 h內(nèi)亞硝酸氮含量不出現(xiàn)反彈現(xiàn)象。亞硝酸氮的去除主要發(fā)生在4～8 h 內(nèi)，此時JY14生長進入對數(shù)期。

2.2 菌株JY14對天然污水中無機氮的影響（見圖7）

由圖7可知，在0～12 h內(nèi)，亞硝酸氮、氨氮和總無機氮的含量總趨勢呈下降趨勢，而硝酸氮含量呈上升趨勢，推測原因可能為JY14 在利用亞硝酸鹽和銨鹽的同時能產(chǎn)生一定濃度的硝酸銨，而總無機鹽濃度下降，則說明有部分無機氮被轉化為另一種形式的氮，可能為菌體蛋白，也可能為氮氣。

3 討論

環(huán)境中自養(yǎng)和異養(yǎng)硝化菌在水體氮的循環(huán)中起了非常重要的作用[16-17，20-21]，有機碳源不僅影響異養(yǎng)硝化菌的生長，還影響其硝化特性[20-23]。聶歡歡等[16]分離的具有亞硝酸氮去除能力的地衣芽孢桿菌FP6最適碳源為蔗糖，孫巍等[24]分離的異養(yǎng)硝化菌假單胞菌LT-11 最適碳源為琥珀酸鈉。宋君等[23]發(fā)現(xiàn)復合有機碳源更能提高短小芽孢桿菌對水體中無機氮的去除。菌株不同則碳源不同，添加有機碳源對于異養(yǎng)硝化菌的無機氮去除具有促進作用[20-24]。本研究則發(fā)現(xiàn)添加淀粉和干酪素等有機物可以提高芽孢桿菌JY14 對亞硝酸氮去除率，這與其他學者研究趨勢一致[16，22-23]。

劉慧玲等[8]以墨吉明對蝦為試驗動物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)硝酸氮濃度為2.5%時其安全濃度最高，韓楓等[25]發(fā)現(xiàn)亞硝酸氮對花鱸幼魚的危害性與鹽度呈反比，說明一定鹽度能降低亞硝酸氮對水生生物的危害性。JY14 能夠適應較寬的NaCl 濃度環(huán)境[22]，Mirandaa 等[6]認為0.5%～1.0%時，NaCl會成為亞硝酸氮氧化或氨氧化的重要媒介，王越等[26]發(fā)現(xiàn)鹽度為2.5%時花津灘芽孢桿菌對亞硝酸氮的去除效率最高，宋君等[23]則通過對短小芽孢桿菌研究發(fā)現(xiàn)2.0%～4.0%時，亞硝酸氮的去除效果最佳。而在本實驗中JY14去除亞硝酸氮的最佳NaCl 濃度為0%，可能是由于本菌分離于淡水環(huán)境，NaCl能夠影響菌體生長而間接影響對亞硝酸氮的去除率[22]。

研究發(fā)現(xiàn)pH 值在6.5～9.0 之間亞硝酸氮去除率較高[23-29]，李思倩等[27]研究發(fā)現(xiàn)在pH 值7.0～9.0之間亞硝酸鹽氮去除率較高。劉玉等[28]發(fā)現(xiàn)在pH值4.5 時羅伊氏乳桿菌對亞硝酸氮的去除效率最高。宋君等[23]則發(fā)現(xiàn)pH 值7～8 之間短小芽孢桿菌BP-171 對無機氮的去除率最高。結合本實驗結果認為中性偏酸性的環(huán)境最適合菌株JY14 的去除亞硝酸氮。

JY14 適于生長在中等偏高的溫度環(huán)境中，在5～25 ℃偏冷環(huán)境中也能生存[22]。而其他學者研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌最適生長溫度為25～40 ℃[30-34]，宋君等[23]發(fā)現(xiàn)28 ℃時短小芽孢桿菌BP-171 去除無機氮效率最高。周鮮嬌等[35]通過研究芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)30 ℃時，對亞硝酸氮去除效率最高，唐家毅等[36]則認為芽孢桿菌去除亞硝酸氮的最佳溫度為25～35 ℃。這與本實驗結果趨勢一致，JY14在25～40 ℃時具有較高的亞硝酸氮去除率。在25～40 ℃范圍內(nèi)，溫度對其去除亞硝酸氮率影響較小，推測原因可能與其酶類有關，還需進一步研究。

4 結論

本研究結果表明，芽孢桿菌JY14 具有去除亞硝酸氮的能力。該菌在pH 值3.0～10.0 時均具有去除亞硝酸氮的功能，但受影響較大，其去除亞硝酸氮最適pH 值是7.0。能在一定的鹽度（0～3%）條件下去除亞硝酸氮，溫度對其去除亞硝酸氮能力影響較小，25～40 ℃時均能去除亞硝酸氮，且受影響較小。JY14 去除亞硝酸氮的環(huán)境條件較為寬泛，因此本實驗分離的芽孢桿菌可作為今后養(yǎng)殖水質調(diào)控菌進行深入研究。