響應(yīng)面優(yōu)化提取山茱萸籽油及其對游泳運動大鼠生理生化指標(biāo)的影響

貢新燁，蔡協(xié)清

（南京工業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 211816）

山茱萸屬于山茱萸科山茱萸屬植物，在我國有著悠久的種植歷史[1]，主產(chǎn)于山西、陜西、山東、江蘇、浙江等省份[2]。山茱萸作為我國名貴木本藥材之一，通常以干燥成熟果肉入藥，其富含多種營養(yǎng)成分[3]，包括碳水化合物、維生素C，檸檬酸、黃酮類化合物、熊果苷等成分。山茱萸籽約占整個果實質(zhì)量的80%，是其果肉藥物化利用后的主要廢棄部分[4-5]。因此，對山茱萸籽資源的研究有利于提高山茱萸的綜合利用價值。

山茱萸籽油中富含多種不飽和脂肪酸，其中油酸含量大約為35.8%，亞油酸含量大約為34.6%[6]。攝入不飽和脂肪酸對于人體的健康有至關(guān)重要的作用，其中亞油酸是人體自身無法合成的必需脂肪酸，主要的功能是軟化血管，并在新陳代謝過程中起著重要的作用，亞油酸可以降低機體的血脂血壓，起到預(yù)防動脈粥樣硬化和心腦血管疾病等功效[7]。另外，山茱萸籽油中還含有多酚類成分，其具有較強的抗氧化活性，對自由基有較好的清除作用。鑒于山茱萸籽油具有良好的利用價值，本文將采用微波輔助溶劑法來制備山茱萸籽油，并研究其對游泳運動大鼠生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸籽：定遠縣琪榮農(nóng)林種養(yǎng)經(jīng)營部；石油醚（30℃～60℃）、無水乙醇、正己烷、丙酮（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；血糖試劑盒、甘油三酯試劑盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶[glutamic-oxal（o）acetic transaminase，GOT]試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）試劑盒：南京建成生物工程所。

SPF 級雄性 SD 大鼠：40只，體重在（150±5）g，浙江普康生物技術(shù)股份有限公司，SYXK（浙）2019-0032。

1.2 儀器與設(shè)備

XL-500型粉碎機：南京耀天干燥設(shè)備有限公司；MKX-E1A型微波萃取儀：青島邁威微波化學(xué)設(shè)備有限公司；J-SKY型分析天平：巨鼎天衡（蘇州）稱重設(shè)備有限公司；DHG-9055A型鼓風(fēng)干燥機：金壇區(qū)金城致杰實驗儀器廠；TG16-WS型高速離心機：常州金壇良友儀器有限公司；HH-s6型恒溫水浴鍋：濟南歐萊博科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸籽油的提取

提取工藝流程如下[9-10]。

挑選山茱萸籽→干燥→粉碎→加入提取溶劑→微波輔助→減壓蒸餾→干燥至恒重

挑選無蟲蛀山茱萸籽，45℃干燥3 h，去除水分，粉碎至60目，得到山茱萸籽粉末。稱取適量的山茱萸籽粉末，放置于錐形瓶中，加入一定液料比的提取溶劑，放置于微波萃取儀中，在不同的微波功率、提取溫度、提取時間下進行提取，提取結(jié)束后，蒸餾出溶劑，并在45℃下干燥至恒重得到山茱萸籽油。

Y/%=（M1-M2/m）×100

式中：Y為山茱萸籽油得率，%；M1為山茱萸籽油質(zhì)量，g；M2為錐形瓶質(zhì)量，g；m為山茱萸籽粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗

固定提取溫度40℃、提取時間50 min、微波功率300 W，設(shè)定不同液料比 4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1（mL/g）；固定提取時間 50 min、微波功率 300 W、液料比 8∶1（mL/g），設(shè)定不同提取溫度 30、35、40、45、50℃；固定提取溫度40℃、液料比8∶1（mL/g）、微波功率300 W，設(shè)定不同提取時間 30、40、50、60、70 min；固定提取溫度40℃、液料比8∶1（mL/g）、提取時間50 min，設(shè)定不同微波功率 100、200、300、400、500 W，研究各因素對山茱萸籽油得率的影響。

1.3.3 動物分組及運動方案

選取SPF級雄性SD大鼠40只，體重（150±5）g，大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（23±2）℃。隨機分成2組，每組20只大鼠，分成對照組、實驗組。大鼠空腹過夜后，將大鼠放入到游泳池內(nèi)，大鼠的尾部負重其體重5%的鉛絲，從大鼠進入到游泳池開始，到大鼠力竭（頭部沉入水中8 s不能浮出）的這段周期記為游泳時間[11]。實驗組游泳前，20只大鼠灌胃10 mg/g山茱萸籽油，游泳力竭后，20只大鼠再次灌胃10 mg/g山茱萸籽油（灌胃劑量參照程耀明的小鼠實驗方法并加以改進[12]）；對照組20只大鼠游泳前后各灌胃蒸餾水10mg/g，試驗時間持續(xù)6周。游泳前和游泳2 h后，采取眼眶血，離心取血漿，并對血糖、甘油三酯、血尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、肌酸激酶（CK）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT）等指標(biāo)根據(jù)試劑盒的說明書檢測分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本文使用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采取組間進行對比，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對山茱萸籽油得率的影響

以山茱萸籽油得率為考察指標(biāo)，考察4種提取溶劑對山茱萸籽油得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溶劑對山茱萸籽油得率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on yield of Cornus officinalis seed oil

從圖1可知，正己烷相比于其它3種溶劑對山茱萸籽油得率的影響最大，所以選擇正己烷作為提取溶劑進行后續(xù)試驗[13]。

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比對山茱萸籽油得率的影響

液料比對山茱萸籽油得率的影響見圖2。

圖2 液料比對山茱萸籽油得率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the yield of Cornus officinalis seed oil

由圖2可知，隨著液料比的增加，山茱萸籽油得率逐漸提高，當(dāng)液料比為10∶1(mL/g）時，得率達到最高。這是由于液料比的增加使得物料與溶劑之間接觸更充分，有利于油脂的提取，繼續(xù)增大液料比，會使得油脂與提取溶劑之間分離時間變長，成本上升，同時溶劑量增加會使得山茱萸籽內(nèi)多余成分析出，影響得率[14]，故選擇液料比為 10∶1(mL/g）。

2.2.2 提取溫度對山茱萸籽油得率的影響

提取溫度對山茱萸籽油得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對山茱萸籽油得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of Cornus officinalis seed oil

由圖3可知，隨著提取溫度的增加，山茱萸籽油得率逐漸升高，當(dāng)提取溫度升高到40℃時，得率達到最高，繼續(xù)提高溫度，得率出現(xiàn)降低趨勢。這是因為溫度的升高，使得油脂易析出到溶劑中，而溫度過高會導(dǎo)致溶劑揮發(fā)，造成得率降低[15]，故選擇提取溫度為40℃。

2.2.3 提取時間對山茱萸籽油得率的影響

提取時間對山茱萸籽油得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對山茱萸籽油得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of Cornus officinalis seed oil

由圖4可知，隨著提取時間的增加，山茱萸籽油得率逐漸升高，在提取時間為60 min時達到最高，繼續(xù)延長時間，得率不再升高。因此，選擇提取時間為60min。

2.2.4 微波功率對山茱萸籽油得率的影響

微波功率對山茱萸籽油得率的影響見圖5。

由圖5可知，隨著微波功率的加強，山茱萸籽油得率逐漸升高，在微波功率為400 W時達到最高，繼續(xù)加強微波功率，得率出現(xiàn)降低趨勢。微波功率的加強，可以使山茱萸籽內(nèi)的細胞破碎速度加快，進而使油脂更容易析出到溶劑中，繼續(xù)增加微波功率會使得溶劑揮發(fā)加劇，導(dǎo)致溶劑流失，得率降低[16]。因此，選擇微波功率為400 W。

圖5 微波功率對山茱萸籽油得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on yield of Cornus officinalis seed oil

2.3 響應(yīng)面法試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以山茱萸籽油得率（Y）為指標(biāo)，選擇液料比（X1）、提取溫度（X2）、微波功率（X3）為因素，進行三因素三水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平Table 1 Box Behnken design factor level

響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box Behnken experimental design and results

利用Design-Expert軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到微波輔助溶劑法提取山茱萸籽油的多元回歸方程：Y=31.18+0.47X1+0.59X2+0.13X3+0.070X1X2-0.16X1X3-0.31X2X3-0.96X12-1.02X22-1.57X32。

由表3可知，模型P<0.01（極顯著），失擬項P值為0.150 5（不顯著），因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著R2=0.997 5，R2Adj=0.994 3，說明該方程的擬合度較好，表明回歸模型達到極顯著，可以反映得率和各因素之間的關(guān)系，試驗誤差小，試驗預(yù)測數(shù)據(jù)具有良好的可靠性，故可以用該模型對山茱萸籽油的提取試驗進行預(yù)測和分析。

表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis results of response surface regression model

從各個因素的顯著性水平差異可知，液料比、提取溫度、微波功率影響為極顯著，對山茱萸籽油得率影響順序為，提取溫度＞液料比＞微波功率，X1X3達到顯著水平（P<0.05）、X2X3達到極顯著水平（P<0.01），并且各個因素的二次項對山茱萸籽油得率的影響均達到了極顯著水平（P<0.01）。

試驗得出山茱萸籽油最佳提取條件為：液料比10.51∶1（mL/g）、提取溫度41.49℃、微波功率 399.79W，在此條件下山茱萸籽油的得率為31.33%。根據(jù)試驗的可操作性，將試驗條件調(diào)整為液料比11∶1（mL/g）、提取溫度41℃、微波功率400 W，進行3次驗證試驗，得出山茱萸籽油平均得率為31.25%，與預(yù)測值相近。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化得到的山茱萸籽油工藝條件準(zhǔn)確可靠。

2.4 山茱萸籽油對游泳運動大鼠游泳時間的影響

山茱萸籽油對游泳運動大鼠游泳時間的影響見圖6。

由圖6可知，實驗組大鼠游泳時間顯著大于對照組大鼠，表明山茱萸籽油具有明顯的延長游泳時間的作用，能夠提高大鼠的耐力，緩解疲勞[17]。

圖6 山茱萸籽油對游泳運動大鼠游泳時間的影響Fig.6 Effect of Cornus officinalis seed oil on swimming time of swimming rats

2.5 山茱萸籽油對游泳運動大鼠血液生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)影響

山茱萸籽油對游泳運動大鼠血液生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)影響見表4。

表4 山茱萸籽油對游泳運動大鼠血液生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)影響Table 4 Intervention effect of Cornus officinalis seed oil on blood physiological and biochemical index changes of swimming rats

從表4得出，游泳前2組大鼠各項指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，沒有顯著性差異（P＞0.05）。對照組大鼠游泳后血糖、甘油三酯、GSH-Px、SOD水平明顯下降（P<0.05），對照組大鼠游泳后 BUN、MDA、CK、GOT、GPT水平明顯升高（P<0.05），實驗組大鼠游泳后與對照組大鼠游泳后相比，血糖、甘油三酯、GSH-Px、SOD水平呈升高趨勢（P<0.05），BUN、MDA、CK、GOT、GPT 水平呈降低趨勢（P<0.05）。說明大鼠經(jīng)過游泳力竭運動之后體內(nèi)肝臟、肌肉等臟器組織代謝加快，代謝產(chǎn)物堆積，體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，這些機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物對細胞具有嚴(yán)重的損傷作用[18-20]。而游泳后實驗組大鼠經(jīng)過灌胃山茱萸籽油，各項指標(biāo)均明顯優(yōu)于灌胃蒸餾水的對照組，山茱萸籽油由于含有多酚類成分，其具有較強的抗氧化活性，對自由基有較好的清除作用，同時山茱萸籽油中富含多種不飽和脂肪酸，可以起到促進體內(nèi)脂肪分解的作用，并且可以降低機體的血脂，起到對大鼠生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)作用。

3 結(jié)論

采用微波輔助溶劑法提取制備山茱萸籽油，得出最佳提取條件為：液料比11∶1（mL/g）、提取溫度41℃、微波功率400 W。大鼠游泳運動實驗表明，對照組大鼠游泳后血糖、甘油三酯、GSH-Px、SOD水平明顯下降（P<0.05），對照組大鼠游泳后 BUN、MDA、CK、GOT、GPT水平明顯升高（P<0.05），同時灌胃山茱萸籽油的實驗組大鼠游泳后與對照組大鼠游泳后相比血糖、甘油三酯、GSH-Px、SOD 水平呈升高趨勢（P<0.05），BUN、MDA、CK、GOT、GPT 水平呈顯著降低趨勢（P<0.05），試驗組大鼠各項指標(biāo)均明顯優(yōu)于灌胃蒸餾水的對照組，起到對大鼠生理生化指標(biāo)變化的干預(yù)作用。另外，山茱萸籽油具有明顯延長游泳時間的作用，提高大鼠的耐力，緩解疲勞。