響應面法優(yōu)化菊黃東方鲀肌肉多肽制備工藝

屈帥杰，劉淑集，蘇永昌，潘 南，廖登遠，許 旻，王 勤,，劉智禹,

（1.廈門大學生命科學學院，福建廈門 361000；2.福建省水產(chǎn)研究所，國家海水魚類加工技術研發(fā)分中心（廈門），福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門 361013）

菊黃東方鲀（Takifugu flavidus）是河豚魚的一種，魚身無鱗片，其形體呈橢圓形狀[1]，在中國渤海、黃海和東海等海域均有分布，為溫帶地區(qū)近海底層魚類[2]。菊黃東方鲀肌肉富含蛋白質(zhì)、必需氨基酸，屬于高質(zhì)量蛋白質(zhì)食物來源[3]。近年來，菊黃東方鲀的育苗養(yǎng)殖技術日漸成熟，已成為我國四大養(yǎng)殖河豚魚品種之一，相對于野生的菊黃東方鲀，養(yǎng)殖的菊黃東方鲀的毒性大大降低，且其毒性主要存在于內(nèi)臟之中，菊黃東方鲀的肌肉是無毒的[4]。隨著菊黃東方鲀養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷增加，科研人員對于菊黃東方鲀的研究及產(chǎn)品開發(fā)不斷深入。

從海洋生物中制備的多肽具有抗疲勞、抗氧化、提高免疫力、降血壓和降血糖等功效[5?11]。Kondo等[12]發(fā)現(xiàn)鯖魚肽可以抑制低密度的脂蛋白（LDL）的氧化，Jang 等[13]在紅海鞘（Halocynthia aurantium）的血細胞中純化出抗菌肽Halocidin，盧連華等[14]研究海參肽對小鼠抗疲勞能力的影響發(fā)現(xiàn)，海參肽可以顯著提高小鼠負重游泳的時間，并使運動后的小鼠血液中的乳酸和尿素氮含量明顯下降。常見的多肽制備的方法有直接提取法、微生物發(fā)酵法、酶解法、基因重組法等。直接提取法是直接將生物體內(nèi)的活性肽提取出來。這種方法主要針對的是生物體內(nèi)已經(jīng)存在的活性肽[15]。因為生物體中活性肽較少，且生物體內(nèi)的物質(zhì)比較復雜，如果想得到高純度的活性肽，則必須經(jīng)過極為繁瑣的分離純化和精煉的步驟，這將導致制備成本的加大。微生物發(fā)酵法成本低廉，且微生物會產(chǎn)生多種酶，其中有的蛋白酶可以有效地將發(fā)酵原料中的苦味肽、腥味物質(zhì)以及少量的脂肪分解，改善其風味，但該方法制備多肽同時也具有一定安全隱患，比如一些產(chǎn)菌菌株具有毒害性[16]。由于基因重組法制備多肽的成本較高，所以該方法也難以應用于工業(yè)生產(chǎn)。而酶法提取具有諸多優(yōu)點，比如條件溫和，能讓多肽產(chǎn)品具有較高的速溶性、耐熱、耐酸、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[17?18]。

響應面法是一種常用的試驗優(yōu)化方法，該法已應用于多種優(yōu)化實踐中[19?21]。本實驗采用酶解法制備菊黃東方鲀肌肉多肽，并以蛋白水解度作為該試驗的響應指標，利用響應面法優(yōu)化制備工藝，為菊黃東方鲀肌肉多肽的開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊黃東方鲀 福建省鲀之鮮水產(chǎn)有限公司；酸性蛋白酶（50 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（200 U/mg）、風味蛋白酶 （30 U/mg）、木瓜蛋白酶（100 U/mg） 索萊寶生物科技有限公司；胰蛋白酶（50 U/mg）、無水乙醇（分析純）、茚三酮（分析純）、十二水和磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；果糖 分析純，阿拉丁試劑有限公司。

Infinite M200 Pro 酶標儀 TECAN 集團有限公司；Digestor 2508 消化爐 丹麥福斯公司；KjeltelTM8400 凱氏定氮儀 丹麥福斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菊黃東方鲀肌肉多肽制備 去除菊黃東方鲀的頭部、魚皮、血液、骨頭，保留肌肉部分。用水清洗干凈之后，用絞肉機將肌肉絞碎成魚糜。采用凱氏定氮儀檢測肌肉蛋白質(zhì)的含量，參考GB 5009.5-2016。然后在適宜的溫度、pH、加酶量、料液比、反應時間進行酶解實驗。酶解完成后將酶解液煮沸10 min，將蛋白酶進行滅活，檢測酶解液的水解度。

1.2.2 蛋白酶的篩選 分別采用胰蛋白酶、風味蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶進行酶解實驗。設定6 種酶的反應條件，即料液比（1:10）、反應時間（8 h）、加酶量（5000 U/g)。各種酶對應的pH 和溫度如表1 所示[22]。酶解8 h之后，100℃水對蛋白酶進行滅活，時間為10 min，冷卻后10000 r/min 離心10 min，保留上清液測定水解度。

表1 不同蛋白酶最適的pH 和溫度Table 1 Optimal pH and temperature of different proteases

1.2.3 水解度的測定 采用茚三酮法[23]對上述酶解液進行水解度的測定，計算公式如下：

式中：h 表示酶解1 g 蛋白質(zhì)所裂解的肽鍵的量（mmol）；htot表示每1 g 酶解物中的蛋白質(zhì)的肽鍵的量（mmol），河豚肉取7.70 mmol/g。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 pH 對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響 固定反應時間5 h，料液比為1:10（g/ mL）、溫度50 ℃，酶添加量為5000 U/g，pH 分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，以水解度（DH）為指標，考察pH 對菊黃東方鲀肌肉酶解液水解度的影響。

1.2.4.2 酶解時間對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響 固定反應所需的pH 為7.0，料液比為1:10（g/mL）、溫度50 ℃，加酶量為5000 U/g，反應時間分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，以水解度（DH）為指標，考察反應時間與水解度的關系。

1.2.4.3 料液比對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響 固定反應pH 為7.0，反應時間5 h，反應溫度50 ℃，酶添加量為5000 U/g，料液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25（g/mL），以水解度（DH）為指標，考察料液比與水解度的關系。

1.2.4.4 反應溫度對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響 固定反應pH 為7.0，反應時間5 h，料液比為1:10（g/mL）、酶添加量為5000 U/g，反應溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，以水解度（DH）為指標，考察反應溫度與水解度的關系。

1.2.4.5 加酶量對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響 固定反應pH 為7.0，反應時間5 h，料液比為1:10（g/mL），反應溫度50 ℃，酶添加量分別為1000、2000、3000、4000、5000 U/g，以水解度（DH）為指標，考察加酶量與水解度的關系。

1.2.5 響應面法優(yōu)化酶法制備菊黃東方鲀肌肉多肽的工藝條件 根據(jù)單因素實驗得出的結果，選擇對水解度影響較大的pH、加酶量、反應溫度3 個因素為考察對象進行Box-Behnken 設計，以水解度為指標，優(yōu)化菊黃東方鲀肌肉多肽的最優(yōu)酶解工藝，表2 為各因素的水平表，反應時間為5 h，料液比為1:10（g/mL）。

表2 Box-Behnken 設計因素水平設計Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結果以平均值±標準差（X±SD）的方式表示，每組實驗重復三次，并用Origin8.5 軟件作圖。Design Expert 8.0 設計響應面試驗，并對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析及二次多項式回歸擬合。

2 結果與分析

2.1 菊黃東方鲀肌肉總粗蛋白的含量

菊黃東方鲀肌肉總粗蛋白的含量為19.06%±0.080%。關于河豚魚的蛋白質(zhì)含量已經(jīng)有大量研究，高露姣等[24]檢測到不同飼養(yǎng)條件下的紅鰭東鲀肌肉的粗蛋白含量在15.88%～17.22%，劉振熙等[25]檢測到黑鰓兔頭鲀肌肉（Lagocephalus laevigatus）蛋白質(zhì)含量為18.70%。相對于其他品種的河豚魚，菊黃東方鲀肌肉蛋白質(zhì)含量略高。

2.2 蛋白酶的篩選

如圖1 所示，在一定條件下，酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶對菊黃東方鲀肌肉蛋白的酶解水平是具有一定差異的，其水解能力排序為風味蛋白酶>中性蛋白酶>堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>酸性蛋白酶。風味蛋白酶酶解菊黃東方鲀肌肉的水解水解能力最強，其水解度值為22.38%。水解度越高表示蛋白質(zhì)酶解得越徹底，酶解產(chǎn)物中的多肽的種類和功能也越豐富，所以選擇風味蛋白酶進行后續(xù)實驗。

圖1 不同種類的蛋白酶的酶解效果Fig.1 Enzymolysis effect of different kinds of protease

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 反應體系 pH 的確定 pH 的大小直接影響風味蛋白酶酶解菊黃東方鲀肌肉蛋白過程中的酶活力。如圖2 所示，pH 在6.0～7.5 的范圍內(nèi)，菊黃東方鲀肌肉蛋白的水解度是隨著pH 上升而上升的，而后菊黃東方鲀肌肉蛋白的水解度隨著pH 的上升而下降。菊黃東方鲀肌肉蛋白在pH 在6.0 和8.0 的條件下酶解，酶解液的水解度較低，該現(xiàn)象可能是因為風味蛋白酶在pH 為6.0 和8.0 的反應體系中其自身的酶活受到抑制，導致催化效果的降低。而pH 在7.5 的時候，風味蛋白酶的酶活性相對較高，因此酶解pH 選取7.5 為宜。

圖2 pH 對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of different pH on protein hydrolysis of the muscle from Takifugu flavidus

2.3.2 反應體系時間的確定 酶解時間對于酶解實驗至關重要，如果酶解時間較短，底物酶解不充分，就會導致水解度降低。如圖3 所示，當反應時間從3.0 h逐漸延長到5.0 h 時，菊黃東方鲀肌肉蛋白的水解度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，4.5 h 后水解度基本穩(wěn)定下來,可能是酶解進行到4.5 h 之后已經(jīng)達到了飽和狀態(tài)。從縮短生產(chǎn)周期的角度考慮，酶解時間選取4.5 h為宜。

圖3 酶解時間對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of different enzymatichydrolysis time on protein hydrolysis of the muscle from Takifugu flavidus

2.3.3 反應體系料液比的確定 料液比在酶解反應過程中起到關鍵性作用。適宜的料液比有利于提高傳質(zhì)推動力，有利于酶解實驗的進行。由圖4 可知，隨著料液比（g/mL）的降低，菊黃東方鲀肌肉蛋白的水解度呈先上升后下降的趨勢，在料液比1:5 時，酶解液的水解度較低。料液比為1:10 時，水解度達到最高水平，之后隨著溶劑的增加，水解度趨于穩(wěn)定，因此酶解料液比選取1:10為宜。

圖4 料液比對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of different feed-liquid ratios on protein hydrolysis of Takifugu flavidus

2.3.4 反應體系溫度的確定 反應溫度的高低對酶活力具有直接的影響，反應溫度太低或太高均降低風味蛋白酶的酶活力。如圖5 所示，溫度在30～60 ℃的范圍內(nèi)，菊黃東方鲀肌肉蛋白的水解度是隨著反應溫度的上升而上升的，而后當反應溫度繼續(xù)上升時，水解度開始下降。反應溫度增高，提高了分子撞擊的機率，從而對酶催化效率有促進作用，所以菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度逐漸增大。當反應溫度持續(xù)增高，酶的活性逐漸下降，黃東方肌肉蛋白水解度也隨之降低[26]，因此酶解溫度選取60 ℃為宜。

圖5 反應溫度對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度的影響Fig.5 Effects of reaction temperature on protein hydrolysis of the muscle from Takifugu flavidus

2.3.5 反應體系加酶量的確定 酶反應底物的水解程度直接取決于所加酶量的多少[27]，如圖6 所示，在酶添加量處在1000～4000 U/g 的區(qū)間時，菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度隨酶添加量的增加呈現(xiàn)出了上升的趨勢，而后，酶添加量繼續(xù)增大時，菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度逐漸平穩(wěn)。出于對生產(chǎn)中成本核算的考慮，選取加酶量4000 U/g 為宜。

2.4 響應面試驗

2.4.1 響應面試驗結果 根據(jù)單因素實驗的結果，進行3 因素3 水平響應面試驗，結果如表3 所示，對數(shù)據(jù)的方差分析結果見表4。根據(jù)Box-Behnken 的組合設計原理，采用Design-Expert8.0 軟件設計3 因素3 水平共17 個實驗，其中中心點重復5 次實驗，以水解度作為響應值（DH，%），具體實驗設計方案與結果見表3。對表3 數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，建立制備工藝參數(shù)回歸模型?；貧w方程為：

2.4.2 響應面回歸模型方差分析 由表4 可知，二次回歸模型的F值為31.36，P<0.0001，表明模型達到了極顯著水平；失擬項是模型中數(shù)據(jù)的變異，失擬項P=0.5450>0.05，說明失擬項差異不顯著，試驗沒有失擬因素，所以可以充分地反映實際情況，因此可以斷定回歸模型是適合的；且該試驗模型的決定系數(shù)R2=97.58%，表明實際結果與模型預測結果一致性較強，試驗模型的校正系數(shù)R2Adj=94.47%，試驗結果有94.47%受試驗因素的影響。因此，結果可靠，此模型可以對菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度結果進行分析和預測?；貧w方程各項方差分析中F檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此得到各因素對水解度影響的主次順序為C>B>A，所以對菊黃東方鲀肌肉蛋白的水解度影響最大的是反應溫度，然后是加酶量，最后是pH。由回歸方程和方差分析還可知，模型中一次項B、C、對水解度的影響達到極顯著水平（P<0.01），A 對水解度的影響達到顯著水平（P<0.05）；模型中二次項B2對水解度的影響達到極顯著水平（P<0.01），A2對水解度的影響達到顯著水平（P<0.05）。

表3 Box-Behnken 試驗方案及結果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

2.4.3 優(yōu)化與驗證 根據(jù)所得的模型，進一步確定各因素最佳條件，得優(yōu)化的制備條件。以水解度作為指標，菊黃東方鲀肌肉多肽的最佳制備工藝為：加酶（風味蛋白酶）量4521.96 U/g、反應溫度55 ℃、酶解pH7、料液比1:10（g/mL）、反應時間4.5 h，蛋白質(zhì)水解度的預測值為26.66%。為檢驗試驗結果與真實情況的一致性和可靠性，進行驗證試驗，水解度達到最大值為26.26%，相對誤差為1.48%。所以，響應面法優(yōu)化所得的最佳工藝條件有比較好的實際應用價值。

3 討論與結論

海洋生物多肽的生物功效已被大量的實驗研究所證明，本論文對于菊黃東方鲀肌肉多肽酶解工藝的研究對于海洋生物資源的開發(fā)具有一定推動作用。本實驗采用響應面法進行酶解工藝的優(yōu)化，并且最終確定了最佳酶解條件，為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。但由于該實驗工作量較大，導致實驗周期較長，實驗系統(tǒng)誤差較大，最終導致相同條件下的酶解實驗結果存在一定差異的現(xiàn)象。這一不足還有待后續(xù)的實驗進一步改進。

根據(jù)實驗分析，以標的酶的篩選和單因素實驗作為基礎，通過Box-Behnken 響應面試驗設計確定制備菊黃東方鲀多肽最佳制備工藝為：加酶量4521.96 U/g、酶解溫度55 ℃、酶解pH7、料液比1:10（g/mL）、酶解時間4.5 h，在此條件下，重復驗證實驗得菊黃東方鲀肌肉蛋白水解度最大值為26.26%，相對預測值誤差為1.48%。證明應用響應面法優(yōu)化菊黃東方鲀多肽的制備是準確可行的，實驗結果為菊黃東方鲀多肽的進一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。