rhNGF滴眼液與α1-AT注射液聯(lián)合應(yīng)用對糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠的治療作用及機制的研究*

蔣偉，王妍，田建明，宋蓮蓮，韋康，章蓉*

（1. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳518055；2. 吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長春130000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是最常見的視網(wǎng)膜血管病，現(xiàn)已成為糖尿病患者致盲的首要原因，且目前沒有有效的預(yù)防方法而且治療后視力恢復(fù)是有限的[1]．最近的數(shù)據(jù)表明糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)變性（diabet-ic retinal neurodegeneration，DRN）可視為糖尿病眼部損害的一種主要表現(xiàn)形式，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜微血管的改變，視網(wǎng)膜神經(jīng)變性是導(dǎo)致DR的關(guān)鍵因素[2]．研究顯示在DR早期即未出現(xiàn)臨床癥狀表現(xiàn)時視網(wǎng)膜已經(jīng)發(fā)生病理改變，因此眼科學(xué)研究各界均認(rèn)同DR歸為視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性改變，臨床表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層（RNFL）不同程度的損傷[3-4]．相關(guān)研究證實，糖尿病患者視神經(jīng)發(fā)生退行性病變是因神經(jīng)營養(yǎng)因子轉(zhuǎn)運障礙以及被剝奪所致[5]．

神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)病變領(lǐng)域一直備受關(guān)注，對中樞及周圍神經(jīng)包括視網(wǎng)膜細(xì)胞的發(fā)育、分化、生長，修復(fù)、再生和功能特性的表達(dá)有重要的調(diào)控作用，與視網(wǎng)膜生長、修復(fù)、死亡密切相關(guān)，現(xiàn)已證明神經(jīng)生長因子可減少視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)其生長發(fā)育[6-8]．有研究人員提出神經(jīng)生長因子可以防治視網(wǎng)膜微血管的病理改變，預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡[9]．相關(guān) DR的研究證實，外源性給予神經(jīng)生長因子可以預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞退變，對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直接起到保護(hù)作用，還可促進(jìn)修復(fù)損傷[10]．α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin；α1-AT）是體內(nèi)重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，被發(fā)現(xiàn)其能緩解胰腺炎和胰島素自身抗體的水平[11]．它的基因?qū)隝型糖尿病小鼠體內(nèi)能減弱T細(xì)胞免疫介導(dǎo)的β細(xì)胞損傷，表明α1-AT在治療I型糖尿病減緩胰島移植排斥反應(yīng)方面意義重大[12]．本研究通過建立大鼠糖尿病眼病模型，采用外源滴眼液的給藥方式，首次以 rhNGF與 α1-AT相結(jié)合的方式檢測DR大鼠模型的血清生化指標(biāo)、細(xì)胞因子、組織蛋白水平的變化及相關(guān)臟器的病理組織來探索治療 DR，為 DR的安全性和有效性的治療做初步的探討．

1 實驗材料

1.1 受試藥物

重組人神經(jīng)細(xì)胞生長因子 rhNGF凍干粉，100μg/瓶，臨用前用PBS配成10μg/ml濃度的滴眼液，深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供，批號 170601；α1-AT注射液，濃度5104.5μg/ml，深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供，批號170301；鹽酸二甲雙胍緩釋片，上海普康藥業(yè)有限公司，0.5g/片×24片，批號150906．

1.2 實驗動物、飼料及飼養(yǎng)環(huán)境

SD大鼠100只，雄性，體重200-220g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001；

維持飼料，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，批號17023211；

高糖高脂飼料配制：基礎(chǔ)飼料61.5%、膽固醇2.5%、膽酸鈉1%、蔗糖20%、豬大油10%、蛋黃粉5%．

飼養(yǎng)環(huán)境：吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院清潔級屏蔽環(huán)境動物室，環(huán)境設(shè)施合格證：SYXK（吉）2015-0009，溫度20℃～24℃，相對濕度40%～70%．

1.3 儀器

SD-300生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；FA1004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Leica RM2255型石蠟切片機，德國Leica公司；Leica EG1140石蠟包埋機，德國Leica公司；OlympusBX51光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)，日本NIKON公司．

1.4 試劑

鏈脲佐菌素，純度>99%，美倫生物提供，Lot:M0115A Case:18883-66-4 P.N.:MB1227. 儲存：2-8℃，防潮密閉避光；弗氏完全佐劑，F(xiàn)reund’s Adjuvant Complete，LOT:SLBR3877V,SIGMAALORICH．

葡萄糖(GLU)試劑盒，批號 141516015，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司．

ELISA試劑盒：白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、一氧化氮合成酶（NOS）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、前列環(huán)素（PGI2）、糖化血紅蛋白（GHb），均為北京愛媚麗生物科技有限公司-分裝美國RD公司．

免疫組化試劑盒：AGE抗體（批號：07104325）、RAGE抗體（批號：07157076）、P物質(zhì)抗體（批號：07010728）、ICAM-1抗體（批號：07141214）、CD80抗體（批號：07043032）、IL-12抗體（批號：07202594）、IL-33抗體（批號：72014581），均購自北京博奧森生物科技有限公司．

2 實驗方法

2.1 劑量設(shè)計

鹽酸二甲雙胍緩釋片臨床用量，2片（1000mg）/人/日，即 14.29mg/kg，折算成大鼠的等效劑量為95mg/kg；

rhNGF滴眼液臨床用量每人每日平均10μg，折算成大鼠的等效劑量為0.95μg/kg，每日1次，滴眼給藥；

受試藥α1-AT注射液腹腔注射給藥，每周2次，劑量11.5mg/kg．

2.2 造模及分組

取雄性大鼠若干只，體重180～200 g，留出10只做正常對照組外，其余90只給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，2周后ip鏈脲佐菌素25 mg/kg，第2天ipCFA（弗氏完全佐劑）0.1ml/只，誘導(dǎo)糖尿病眼病模型，每周1次，連續(xù)3周，第3次ip后3天測定血糖1次，以餐后血糖值≥16mmol/L且<20mmol/L為模型復(fù)制成功，將成模的大鼠按血糖值均分5組：模型組、二甲雙胍片組、rhNGF滴眼液組、rhNGF滴眼液+α1-AT注射液組、二甲雙胍片+α1-AT注射液組，另設(shè)一正常對照組[13]．

2.3 給藥及給藥周期

二甲雙胍片組按95mg/kg的劑量灌胃，每日1次；rhNGF滴眼液組按0.24μg/只的劑量滴眼，每日1次；α1-AT注射液組按11.5mg/kg的劑量腹腔注射，每周2次；rhNGF+α1組：rhNGF滴眼液按0.95μg/kg的劑量每日滴眼，每日1次，α1-AT按11.5mg/kg的劑量腹腔注射，每周2次；二甲雙胍片+α1-AT組：二甲雙胍片按95mg/kg的劑量每日灌胃1次，α1-AT按11.5mg/kg的劑量每周腹腔注射2次．

給藥周期為5周，給藥期間繼續(xù)用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，末次給藥后8h后開始禁食、24h后開始處理動物．

2.4 測試指標(biāo)

2.4.1 血清生化、各相關(guān)細(xì)胞因子

①血糖、糖化血紅蛋白：血糖（GLU）、糖化血紅蛋白（GHb）；

②血清炎癥細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）；

③血管內(nèi)皮功能相關(guān)因子：內(nèi)皮素-1（ET-1）、一氧化氮合成酶（NOS）；

④血管緊張素相關(guān)因子：血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、前列環(huán)素（PGI2）；

2.4.2 各相關(guān)免疫組化指標(biāo)

SABC法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜中 AGE和RAGE表達(dá)的變化，檢測視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免疫調(diào)控因子SP（P物質(zhì)），ICAM-l（細(xì)胞粘附分子），CD80，IL-12和IL-33的組織蛋白水平的變化；

2.4.3 病理組織學(xué)檢查

剖取大鼠肝、胰腺、腎等快速浸于10%中性福爾馬林溶液中固定，做病理組織學(xué)檢查備用；剝?nèi)〈笫笠暰W(wǎng)膜浸于10%中性福爾馬林溶液中固定，做免疫組化備用．

2.5 數(shù)據(jù)處理

各項指標(biāo)用±s表示，采用統(tǒng)計軟件 SPSS（17.0），進(jìn)行組間單因素方差分析（Oneway ANOVA）．

3 結(jié) 果

3.1 對糖尿病眼病大鼠相關(guān)血清生化、細(xì)胞因子的影響

3.1.1 對血糖、糖化血紅蛋白的影響

表1顯示，大鼠造成糖尿病眼病模型后，GLU、GHb明顯升高（與正常組比較：P<0.01～P<0.001）．使用受試藥物治療5周后，rhNGF+α1-AT組、二甲雙胍片+α1-AT組的GLU和GHb均得到明顯控制（與模型組比較：P<0.05）．

表1 對血糖、糖化血紅蛋白的影響（±s）

表1 對血糖、糖化血紅蛋白的影響（±s）

【注】與正常組比較：▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

組別 n GLU(mmol/L) GHb(ng/mL)模型組 8 28.76±2.87▲▲▲ 676.13±135.91▲▲二甲雙胍片組 11 20.99±7.86** 542.28±181.25 rhNGF滴眼液組 10 27.77±7.07 639.43±216.24 rhNGF+α1-AT組 10 22.02±4.52* 456.93±197.19*二甲雙胍片+α1-AT組 10 22.13±6.27* 471.90±151.46*正常組 10 8.11±0.92 391.91±157.76

3.1.2 對炎癥細(xì)胞因子的影響

表2顯示，大鼠造成糖尿病眼病模型后，TNF-α、IL-6、顯著升高（與正常組比較：P<0.01～P<0.001）．使用受試藥物治療5周后，各治療組TNF-α均有明顯改善（與模型組比較：P<0.05），但各治療組對IL-6均無明顯影響．

表2 對血清炎癥細(xì)胞因子的影響（±s）

表2 對血清炎癥細(xì)胞因子的影響（±s）

【注】與正常組比較：▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

組別 n TNF-α(pg/mL) IL-6(pg/mL)模型組 8 410.79±93.47▲▲▲ 240.52±45.88▲▲二甲雙胍片組 11 314.53±77.13* 184.13±21.27 rhNGF滴眼液組 10 307.79±107.80* 215.16±72.14 rhNGF+α1-AT組 10 270.89±81.97** 204.86±41.14二甲雙胍片+α1-AT組 10 303.30±83.43* 198.06±103.79正常組 10 233.03±63.38 144.04±67.43

3.1.3 對血管內(nèi)皮功能相關(guān)因子的影響

表3顯示，大鼠造成糖尿病眼病模型后，ET-1、NOS顯著升高（與正常組比較：P<0.01～P<0.001），使用受試藥物治療5周后，僅二甲雙胍片+α1-AT組對ET-1、NOS有明顯改善（與模型組比較：P<0.05）．

表3 對血管內(nèi)皮功能相關(guān)因子的影響（±s）

表3 對血管內(nèi)皮功能相關(guān)因子的影響（±s）

【注】與正常組比較：▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；與模型組比較：*P<0.05

組別 n ET-1(pg/mL) NOS(umol/L)模型組 8 390.94±50.75▲▲▲ 85.40±19.48▲▲二甲雙胍片組 11 327.80±78.63 67.61±18.11 rhNGF滴眼液組 10 323.66±79.62 73.37±27.34 rhNGF+α1-AT組 10 323.44±96.83 74.19±20.03二甲雙胍片+α1-AT組 10 276.56±79.08* 63.89±26.17*正常組 10 144.04±67.43 56.96±15.11

3.1.4 對血管緊張素相關(guān)因子的影響

表4顯示，大鼠造成糖尿病眼病模型后，AngⅡ顯著升高（與正常組比較：P<0.01），PGI2顯著下降（與正常組比較：P<0.05），使用受試藥物治療5周后，二甲雙胍片組、rhNGF滴眼液組、二甲雙胍片+α1-AT組對AngⅡ有明顯改善（與模型組比較：P<0.05），但各治療組對PGI2均無明顯影響．

表4 對血管緊張素相關(guān)因子的影響（±s）

表4 對血管緊張素相關(guān)因子的影響（±s）

【注】與正常組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：*P<0.05

組別 n AngⅡ(pg/mL) PGI2(pg/mL)模型組 8 580.82±110.91▲▲ 201.03±28.31▲二甲雙胍片組 11 451.08±131.99* 225.37±21.75 rhNGF滴眼液組 10 476.43±113.94* 211.04±48.87 rhNGF+α1-AT組 10 489.86±76.29 221.77±65.55二甲雙胍片+α1-AT組 10 464.74±105.37* 220.98±37.04正常組 10 429.22±103.29 253.94±44.40

3.2 對糖尿病眼病大鼠視網(wǎng)膜中相關(guān)免疫組化指標(biāo)的影響

3.2.1 對AGE與RAGE表達(dá)量的影響

圖1顯示AGE與RAGE在正常組表達(dá)量較少，在模型組中表達(dá)較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達(dá)降低，在 rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達(dá)減少，這兩組與模型組比較差異顯著（P<0.05）．

圖1 各實驗組糖尿病眼病大鼠視網(wǎng)膜中AGE、RAGE、P物質(zhì)、ICAM-l、CD80、IL-12、IL-33的表達(dá)平均光密度值（±s）

3.2.2 對P物質(zhì)表達(dá)量的影響

P物質(zhì)陽性表達(dá)主要集中在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和內(nèi)叢狀層，在細(xì)胞核，細(xì)胞胞漿也有部分陽性表達(dá)，其表達(dá)物呈棕色．正常對照組內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見一些 P物質(zhì)陽性表達(dá)細(xì)胞．在模型組中表達(dá)較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達(dá)降低，在 rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達(dá)減少，rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）（見圖1）．

3.2.3 對ICAM-1表達(dá)量的影響

ICAM-1陽性顆粒位于視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表達(dá)量較多，呈棕黃色．對照組顆粒數(shù)量少且呈淺黃色，表明ICAM-1表達(dá)較少．在模型組中表達(dá)較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達(dá)降低，在rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達(dá)減少，rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）（見圖1）．

3.2.4 對CD80表達(dá)量的影響

CD80在正常對照組視網(wǎng)膜中表達(dá)較低．在模型組中表達(dá)較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達(dá)降低，在 rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達(dá)減少，且后兩組與模型組比較差異顯著（P<0.05）（見圖1）．

3.2.5 對IL-12、IL-33表達(dá)量的影響

IL-12與 IL-33在正常對照組視網(wǎng)膜中表達(dá)較低．在模型組中表達(dá)較多（P<0.05），二甲雙胍片組表達(dá)降低，在 rhNGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍片+α1-AT組表達(dá)減少，且后兩組與模型組比較差異顯著（P<0.05）（見圖1），視網(wǎng)膜免疫組化表達(dá)結(jié)果如圖2所示．

圖2 視網(wǎng)膜免疫組化各物質(zhì)表達(dá)結(jié)果

3.3 組織病理學(xué)檢測結(jié)果

組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯示：rhNGF組除視網(wǎng)膜外，肝臟、腎臟、胰腺與模型組比較均無明顯改善，但與α1-AT合用時肝臟、腎臟、胰腺均有改善．具體結(jié)果參見表5．

表5 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

4 討 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病的常見并發(fā)癥，也是糖尿病患者失明的主要原因．視網(wǎng)膜神經(jīng)改變（DRN）在DR微血管損傷中發(fā)揮著重要的作用，被認(rèn)為與神經(jīng)纖維變性、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等因素密切相關(guān)[14]．而神經(jīng)生長因子（NGF）可通過降低糖尿病視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，恢復(fù)視網(wǎng)膜突觸數(shù)量[15]．α1-胰蛋白酶抑制劑（α1-AT）能夠改善Ⅰ型糖尿病免疫性胰島炎并且減緩胰島移植排斥反應(yīng)[16]．本文通過外援滴眼給藥的方式，直接將rhNGF作用于眼部視網(wǎng)膜，同時聯(lián)合注射α1-AT來監(jiān)測受試大鼠的一系列血清及免疫、病理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)rhNGF滴眼液單獨使用時，對血清 TNF-α、AngⅡ等指標(biāo)有明顯的改善作用；與α1-AT合用時，對血清GLU、GHb、TNF-α等指標(biāo)亦有明顯的改善作用．

視網(wǎng)膜上的AGEs與其受體（RAGE）在DR發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用．機體長期處于高血糖狀態(tài)，可導(dǎo)致糖基化反應(yīng)即生成加速 AGEs，直接影響血管壁和基底膜結(jié)構(gòu)的完整性，也可與其受體相互作用，激活多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)血管病變的發(fā)展，從而在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮致病效應(yīng)[17]．本次試驗中，在 NGF組、rhNGF+α1-AT組和二甲雙胍+α1胰蛋白酶抑制劑組中AGE與RAGE表達(dá)均有所減少．說明rhNGF可以通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜局部生化代謝過程，影響局部視網(wǎng)膜的 AGE與 RAGE表達(dá)，但是rhNGF+α1-AT組中AGE與RAGE的表達(dá)量低于rhNGF組，推測rhNGF組對局部AGE與RAGE的表達(dá)量的影響，不及全身血糖下降作用的強度大；也說明單獨依靠rhNGF滴眼的作用可能是有限的，聯(lián)合用藥的方式效果更顯著．

P物質(zhì)（substance P，SP）存在于視網(wǎng)膜組織，具有致炎性和免疫刺激作用[18]．有研究觀察到機體應(yīng)激狀態(tài)下，視網(wǎng)膜組織內(nèi)P物質(zhì)表達(dá)上調(diào)，可能對視網(wǎng)膜組織及其功能產(chǎn)生影響，與臨床眼科免疫、炎癥性病變有關(guān)[19]．本次實驗顯示，rhNGF組中P物質(zhì)表達(dá)減少，即rhNGF對糖尿病視網(wǎng)膜中P物質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用．CD80、IL-12與IL-33在大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變中的原位表達(dá)，國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見明確報道[20]．本次研究發(fā)現(xiàn)，正常視網(wǎng)膜中CD80、IL-12與IL-33的表達(dá)較低，模型組其表達(dá)量明顯上調(diào)，T細(xì)胞活化和視網(wǎng)膜免疫活性的改變都可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變有關(guān)．本次實驗中，給予rhNGF可以減少CD80、IL-12與IL-33在大鼠原位糖尿病視網(wǎng)膜病變中的表達(dá)量，說明rhNGF可以通過局部免疫調(diào)節(jié)減少視網(wǎng)膜的免疫損傷．

綜上所述，rhNGF對 DR的大鼠模型中 AGE和RAGE的表達(dá)有一定的影響，同時可以通過干預(yù)視網(wǎng)膜神經(jīng)免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，如 P物質(zhì)、ICAM-1、CD80、IL-12和IL-33的表達(dá)，在糖尿病視網(wǎng)膜病變中得以保護(hù)視網(wǎng)膜．此外，亦有研究表明 α1胰蛋白酶抑制劑可以通過抑制巨噬細(xì)胞的遷移來對I型糖尿病的進(jìn)行治療[21-22]．通過構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)hα1-AT的胰島β細(xì)胞系（NIT?hα1-AT），移植該細(xì)胞系后能穩(wěn)定表達(dá)胰島素并維持血糖呈正常水平至35 d，表明hα1-AT的表達(dá)可抑制受體對移植細(xì)胞系的免疫排斥反應(yīng)，不僅延長了移植細(xì)胞的存活時間，而且具有抗凋亡和誘導(dǎo)特異性免疫耐受的特性[23]．近年來研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗在Ⅱ型糖尿病發(fā)病中起重要作用，而α1-AT可能是影響白蛋白-胰島素結(jié)合的最重要的病理因素之一，α1-AT可通過與胰島素競爭白蛋白上的結(jié)合位點而發(fā)揮競爭性抑制作用，通過抑制白蛋白和胰島素的結(jié)合，促使胰島素從胰島素-白蛋白復(fù)合物中解離和利用，從而起到調(diào)節(jié)血糖水平的作用[24-25]．因此，在針對DR的治療方面，本研究首次采用rhNGF和α1-AT相結(jié)合的方式給藥，結(jié)果顯示兩者結(jié)合給藥比單獨 rhNGF給藥對血清相關(guān)因子的改善更為明顯．本研究對rhNGF和α1-AT在糖尿病視網(wǎng)膜疾病中神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用提供了一定理論依據(jù)，但是兩種藥物聯(lián)合給藥比 rhNGF單獨給藥發(fā)揮更好效果的作用機制，還需要在分子生物學(xué)，蛋白組學(xué)等多個層面、多個環(huán)節(jié)進(jìn)一步研究和探討．