阿膠蛋白質(zhì)組學(xué)研究

廖 峰，樊雨梅，帖 航，蘇 寧,

（1.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東聊城 252201；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

阿膠（Colla Corii Asini，CCA）為馬科動物驢（Equus asinusL.）的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠[1]，已有2000多年的使用歷史。阿膠內(nèi)含豐富的生物活性物質(zhì)，其中包括硫酸皮膚素、膠原蛋白和多肽等，且蛋白質(zhì)是阿膠的主要成分，含量70%～90%[2]。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究證明，阿膠具有治療貧血[3]、輔助治療腫瘤[4]、提高免疫力[5-6]、抑菌[7]、抗炎[8]、抗衰老[9]和抗疲勞[10]等功效。但目前對阿膠的功效研究都是基于全阿膠的藥理藥效學(xué)研究，對阿膠發(fā)揮作用的分子機(jī)制、功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少。阿膠因生物利用度較低易存在“滋膩礙胃”的現(xiàn)象，對一些適應(yīng)癥人群的療效并不顯著。因此，識別阿膠發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)對阿膠的二次開發(fā)就顯得尤為重要。

近年來，阿膠功效物質(zhì)的分離與識別引起了廣泛的關(guān)注。李輝等[10]利用動物實驗證實藥效氨基酸和膠原蛋白肽是阿膠發(fā)揮抗疲勞和提高運動耐力作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。李笑塵等[11]通過色譜和質(zhì)譜技術(shù)識別出阿膠抗氧化肽。吳宏忠教授團(tuán)隊[12-13]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，阿膠經(jīng)體外模擬消化后的活性產(chǎn)物A和B是阿膠有效補(bǔ)血的活性成分。肖黎等[14-15]證實阿膠酶解產(chǎn)物有助于預(yù)防和治療阿爾茨海默癥、促進(jìn)傷口愈合、防止UVA造成的膠原蛋白合成減少和皺紋產(chǎn)生?？梢?，膠原蛋白及其水解產(chǎn)物是阿膠發(fā)揮功效的主要物質(zhì)。利用阿膠膠原蛋白開發(fā)生物活性肽是改善阿膠“滋膩礙胃”與提升阿膠功效的途徑之一。利用在線數(shù)據(jù)工具平臺虛擬篩選阿膠生物活性肽能夠解決傳統(tǒng)篩選方法周期長且成本高等不足，但需明確阿膠蛋白的氨基酸序列。目前，關(guān)于阿膠所含的功能蛋白報道較少。應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)對阿膠的研究主要是集中在阿膠特征分子離子峰的識別，用于阿膠質(zhì)量控制和摻偽識別[16-17]，而采用蛋白質(zhì)組學(xué)對阿膠蛋白成分的分析研究，相關(guān)報道較少。王若光等[18]利用激光解析/離子化-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對阿膠蛋白進(jìn)行了初步分析，建立了阿膠蛋白質(zhì)量指紋圖。房芳等[19]采用鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)阿膠含有膠原蛋白、肌球蛋白、血紅蛋白、血影蛋白等7種具有代表性的蛋白質(zhì)，李雪[20]發(fā)現(xiàn)阿膠含有角蛋白、白蛋白和纖維蛋白等非膠原蛋白。但是，并沒有全面分析阿膠蛋白的組成。因此，為全面了解阿膠的蛋白質(zhì)組成，明確阿膠發(fā)揮功效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，利用高分辨質(zhì)譜分析阿膠蛋白質(zhì)組成，并通過基因本體論（Gene Ontology，GO）分類法對檢測到的蛋白質(zhì)進(jìn)行歸類，揭示阿膠蛋白生物學(xué)功能，為今后阿膠的二次開發(fā)、功效作用機(jī)制和功效作用物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供一定的試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿膠（批號：1707038） 東阿阿膠股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸 均為質(zhì)譜純，百靈威科技有限公司；尿素、考馬斯亮藍(lán)R-250（生物級）、二硫蘇糖醇、十二烷基硫酸鈉 北京索萊寶科技有限公司；Trisbase 美國阿拉丁公司；SDS-PAGE電泳Marker、Modified Trypsin（Sequencing Grade，Promega） 美國Bio-Rad公司。

三合一高分辨質(zhì)譜儀（Orbitrap Fusion Lumos Tribrid） 美國Thermo公司；SDS-PAGE電泳儀（Mini Protean 3 Cell） 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿膠前處理 精密稱取粉碎后的阿膠粉末10.0000 g，加入80 mL超純水，于60 ℃水浴震蕩30 min，使樣品充分溶解，待樣品冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并用超純水稀釋至刻度線，10000 r/min 離心30 min，取中間層澄清溶液，即為10%（w/v）阿膠溶液。

1.2.2 SDS-PAGE電泳 根據(jù)鄭潔[21]的方法稍作修改。10%（w/v）阿膠溶液稀釋10倍后，加入等量的含二硫蘇糖醇的 2×Loading Buffer緩沖液，充分混勻，沸水浴5 min。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠12%。上樣量為10 μL，將凝膠掃描電子圖譜保存，電泳所用的marker分子量范圍在10～250 kDa。

1.2.3 蛋白質(zhì)組成分析 阿膠溶液經(jīng)SDS-PAGE分離后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，將條帶對半切開，轉(zhuǎn)移至 EP 管中。隨后進(jìn)行膠條的脫色與酶切，方法參考文獻(xiàn)[21]。濃縮液與基質(zhì)混合后，采用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜檢測與數(shù)據(jù)采集。

液相條件：Dr.Maisch C18-AQ色譜柱（1.9 μm,120 ?；ID 150 μm，length 15 cm）；流速3 μL/min；上樣體積15 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為0.1%甲酸/90%乙腈溶液；分離梯度：7%B（0 min），15% B（11 min），25% B（48 min），40%B（68 min），100% B（69 min），100% B（75 min）。

質(zhì)譜參數(shù)：離子源類型為納噴電離源（NSI），正離子掃描模式，噴霧電壓為2000 V，毛細(xì)管溫度為320 ℃；掃描模式：全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2）；一級質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：分析器為靜電場軌道阱，掃描范圍300～1400 m/z，分辨率為12000，最大噴射時間50 ms，自動增益控制目標(biāo)（AGC target）500000；二級質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：分析器為離子阱，最大噴射時間35 ms，AGC target為5000。

利用Mascot軟件的SwissPort數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。檢索分類（Taxonomy）為Equus caballus，酶解過程采用的酶為胰蛋白酶，最大允許錯切位點為1，固定修飾設(shè)置為Carbamidomethyl（半胱氨酸），可變修飾設(shè)置為Oxidation（甲硫氨酸），質(zhì)譜容差為0.2 Da。Mascot檢索P＜0.05的結(jié)果被認(rèn)為鑒定成功。

1.2.4 利用GO法對蛋白進(jìn)行歸類 通過GO法對已檢測蛋白質(zhì)分別以其分子功能（Molecular Function，MF）、生物學(xué)過程（Biological Process，BP）和細(xì)胞組成（Cell Component，CC）三種方式進(jìn)行歸類，揭示阿膠蛋白生物學(xué)功能。再對阿膠蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，尋找阿膠蛋白集中的生物學(xué)信號通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳

阿膠的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖1所示，阿膠中的蛋白質(zhì)分子量在10～250 kDa之間呈彌散性分布。鄭潔[21]、董芯鋅[22]也報道阿膠蛋白在10～250 kDa區(qū)域內(nèi)呈彌散分布。這可能是由于加工過程中蛋白質(zhì)降解程度偏低、且降解不均一，沒有形成清晰的條帶導(dǎo)致的。因阿膠加工過程中一般使用高溫蒸煮，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解不徹底，使蛋白質(zhì)分子呈彌散型。

圖1 阿膠蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of CCA

2.2 質(zhì)譜檢測結(jié)果

利用SDS-PAGE分離得到的阿膠蛋白膠條，經(jīng)胰蛋白酶酶解消化后，用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組成鑒定，將得到的多肽片段指紋圖譜（見圖2）導(dǎo)入MASCOT數(shù)據(jù)庫中，阿膠總共查到370種蛋白質(zhì)，其中有54種未命名蛋白，316種已命名蛋白。316種已命名蛋白包括已被報道的36種組蛋白、29種角蛋白、23種肌球蛋白、13種膠原蛋白（6種膠原蛋白α1（I）和7種膠原蛋白α2（I））、4種磷脂結(jié)合蛋白、2種血清白蛋白、2種血紅蛋白、2種脂肪酸結(jié)合蛋白、1種核（纖）層蛋白[14,19]。有204 種（約占總識別蛋白的64.56%）蛋白首次在阿膠中報道出來，其中包括67種免疫λ輕鏈可變區(qū)片段和13種α1-抗胰蛋白酶，其余的124種首次報道的阿膠蛋白見表1。但是，并沒有識別出房芳等[19]報道的血影蛋白，后續(xù)需進(jìn)一步改善阿膠蛋白組成的檢測條件。

本文利用三合一高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析阿膠蛋白的組成，研究發(fā)現(xiàn)阿膠富含多種活性蛋白，反應(yīng)了阿膠的多靶點作用。核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、Lumican和纖調(diào)蛋白是阿膠含有的富含亮氨酸小分子蛋白聚糖的家族成員，在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡，腫瘤的生長、黏附等方面具有關(guān)鍵作用[23]。核心蛋白聚糖和雙糖鏈蛋白聚糖不僅可作為細(xì)胞外基質(zhì)成分參與腎臟纖維化，而且還能通過與生長因子TGF-β、I型膠原等相關(guān)作用調(diào)節(jié)纖維化的進(jìn)展[24]。這可能與加味黃連阿膠湯延緩順鉑化療導(dǎo)致的腎損害向纖維化發(fā)展進(jìn)程的機(jī)制有關(guān)[25]。Lumican可能與阿膠作為癌癥放化療時輔助應(yīng)用延長帶瘤生存的功效有關(guān)[26-27]。皮膚橋蛋白可與膠原纖維、核心糖蛋白、TGF-β等信號因子相互作用調(diào)節(jié)骨形成與骨損傷修復(fù)[28]。Osteoglycin可促進(jìn)骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化與促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟及骨形成[29]。這兩種蛋白可能是阿膠在骨愈合早期、中期促進(jìn)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的增殖及合成活性，促進(jìn)骨愈合的物質(zhì)基礎(chǔ)[30]。

圖2 阿膠酶解肽段的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of CCA

表1 阿膠首次鑒定蛋白組分分析結(jié)果Table 1 Analysis of CCA protein components by first identification

續(xù)表 1

續(xù)表 1

2.3 蛋白質(zhì)GO分類結(jié)果

通過基因本體論（Gene Ontology，GO）法對阿膠蛋白分別以其分子功能（Molecular Function，MF）、生物學(xué)過程（Biological Process，BP）和細(xì)胞組成（Cell Component，CC）三種方式進(jìn)行歸類，結(jié)果見圖3。根據(jù)生物學(xué)過程分析，阿膠蛋白參與最多的生物學(xué)過程是核小體組裝、膠原原纖維形成、染色質(zhì)沉默、中間絲組織、對革蘭氏陽性細(xì)菌的防御反應(yīng)和間充質(zhì)遷移，所占蛋白的比值分別為10.6%、6.1%、6.1%、3.9%、3.9%和2.2%。阿膠蛋白參與形成的細(xì)胞組成有角蛋白絲、中間絲、細(xì)胞外泌體、核小體、細(xì)胞外隙、蛋白質(zhì)性細(xì)胞外基質(zhì)、血液微粒、肌原纖維、髓鞘、膠原三聚體、核染色質(zhì)、肌球蛋白絲、肌纖維膜等，其中占比最高的細(xì)胞組成是細(xì)胞外泌體和細(xì)胞外間隙的蛋白組成，分別占50.0%和21.1%。阿膠蛋白參與蛋白質(zhì)種類最豐富的分子功能為結(jié)構(gòu)分子活性、DNA結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、氧結(jié)合、氧轉(zhuǎn)運蛋白活性等。

為進(jìn)一步了解阿膠蛋白發(fā)揮作用的生物學(xué)途徑，對阿膠蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，以期了解阿膠蛋白主要參與的生物信號通路，為后續(xù)阿膠蛋白功效研究提供依據(jù)。阿膠蛋白參與的KEGG信號通路主要有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、酒精中毒、蛋白質(zhì)消化吸收、ECM受體相互作用、病毒致癌、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、黏著斑等，見圖4。阿膠蛋白信號通路的富集結(jié)果為進(jìn)一步深入了解阿膠蛋白的生物學(xué)意義，闡明阿膠發(fā)揮提高免疫、改善肺部損傷、補(bǔ)血等藥理活性的機(jī)制提供新的途徑和線索。

圖3 識別出的阿膠蛋白的GO分類Fig.3 Gene ontology of the protein groups identified from CCA

圖4 識別出的驢胎盤蛋白的KEGG分類Fig.4 KEGG of the protein groups identified from CCA

阿膠蛋白參與的KEGG通路揭示，阿膠蛋白參與ECM受體相互作用信號通路的基因為ECM中的collagen、THBS等和細(xì)胞膜上的整合素、CD44、syndecan，從另一角度證實了復(fù)方阿膠漿通過上調(diào)αvβ3表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性[31]。已有研究表明，黏著斑、ECM受體相互作用等信號通路中的調(diào)控因子在骨骼肌生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[32]，為阿膠促進(jìn)骨愈合、改善骨密度及預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制和機(jī)理提供了新的途徑和線索[33-35]。阿膠參與肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病信號通路在一定程度上解釋了黃連阿膠湯可防治積累使用蒽環(huán)類藥物化療患者的心臟毒性、抑制心肌損傷的作用機(jī)制[36]。

3 結(jié)論

本文主要旨在研究阿膠蛋白的組成，為明確阿膠功效物質(zhì)基礎(chǔ)和二次開發(fā)提供依據(jù)。采用SDSPAGE凝膠電泳和三合一高分辨質(zhì)譜等手段揭示阿膠蛋白組成。研究表明，通過與馬科蛋白圖庫進(jìn)行對比，檢索出316種可識別的蛋白，阿膠含有多種活性蛋白，比如核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、Lumican和纖調(diào)蛋白等富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖、角蛋白、皮膚橋蛋白、免疫球蛋白和膠原蛋白等。GO分類和KEGG通路分析顯示，阿膠蛋白主要富集在膠原原纖維形成、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、蛋白質(zhì)消化吸收、ECM受體相互作用、病毒致癌、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病等。該研究為進(jìn)一步探究與阿膠藥理活性相關(guān)蛋白質(zhì)組分、阿膠二次開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐，明確阿膠蛋白成分發(fā)揮藥理活性的機(jī)制提供了新的途徑和線索。