添加不同有機(jī)氮源對L-賴氨酸發(fā)酵的作用

李朝波，翟秀超，溫 琦，王世賓

無錫中糧工程科技有限公司 (無錫 214035)

L-賴氨酸(Lysine)是人體必需的8種氨基酸之一，在8種必需氨基酸中是唯一的僅L-型成分才能有效利用的[1]。L-賴氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的一種必需氨基酸，哺乳動(dòng)物不能自行合成，且在谷物食品中含量極低，在加工過程中損失嚴(yán)重，所以被稱為第一限制性氨基酸。2019年國內(nèi)賴氨酸產(chǎn)能和產(chǎn)量分別達(dá)280萬t和197萬t，產(chǎn)品90%用于飼料養(yǎng)殖業(yè)[2]。目前，在L-賴氨酸的生產(chǎn)方法多為微生物發(fā)酵法，比較典型的菌種為大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等[3]。國內(nèi)賴氨酸生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國際領(lǐng)先水平，賴氨酸產(chǎn)量居世界第一[4]。

在發(fā)酵過程中，氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞和含氮目的產(chǎn)物，其中無機(jī)氮源是微生物生長的速效氮源，而有機(jī)氮源為菌體生長提供氮元素和必須的生長因子，對發(fā)酵起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，可促進(jìn)生長速率，調(diào)節(jié)初級代謝及次級代謝的通量；控制生長水平，啟動(dòng)次級代謝產(chǎn)物形成；控制生長速率，影響菌型形成，從而影響發(fā)酵產(chǎn)量；影響供氧水平，增加功率消耗[5]。因此添加不同有機(jī)氮源對培養(yǎng)基的優(yōu)化意義重大[6]。

發(fā)酵培養(yǎng)基的成本直接影響著生產(chǎn)企業(yè)的盈利，如何降低發(fā)酵培養(yǎng)基原料成本，是企業(yè)利潤提高的迫切需求。傳統(tǒng)的L-賴氨酸發(fā)酵過程中，以硫酸銨為無機(jī)氮源，玉米漿、豆粕水解液和多肽粉等為有機(jī)氮源。本文結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，擬分別用玉米漿、菌體蛋白水解液[7]、菌體蛋白水解液加玉米漿混合物、豆粕水解液、多肽粉等作為有機(jī)氮源，研究不同有機(jī)氮源對L-賴氨酸發(fā)酵過程的影響，進(jìn)而優(yōu)化有機(jī)氮源的使用，降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)利潤。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

L-賴氨酸生產(chǎn)菌，Corynebacterium glutamicum JULY1801菌株。

1.1.2原材料

玉米漿、豆粕水解液、多肽粉、菌體蛋白，安徽億輝生物科技有限公司，菌體蛋白水解液，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3設(shè)備與儀器

5 L發(fā)酵罐；721型分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；M100型生物傳感分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；E-10型銨離子分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；1 000 mL三角燒瓶；恒溫?fù)u床，太倉市強(qiáng)文實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1搖瓶培養(yǎng)

(1)搖瓶培養(yǎng)基及滅菌

培養(yǎng)基：葡萄糖110 g/L，氯化鈉2.9 g/L，磷酸二氫鉀5.7 g/L，蛋白胨16 g/L，VB10.005 g/L，丙酮酸鈉0.005 g/L,硫酸銨13 g/L。

按上述配方稱量藥品，將藥品置于燒杯中加水，用氨水調(diào)pH值 7.5，轉(zhuǎn)入1 000 mL三角燒瓶，定容100 mL。裝入滅菌鍋，待溫度升至121 ℃開始計(jì)時(shí)，溫度控制在121 ℃～123 ℃，維持20 min。

(2)搖瓶種子培養(yǎng)

將接種后的搖瓶在內(nèi)層8層紗布上扎上棉繩后，牛皮紙輕放在搖瓶上，放入搖床培養(yǎng)48 h。搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)溫度37 ℃，每隔2 h監(jiān)控1次溫度。

1.2.2發(fā)酵罐培養(yǎng)

(1)種子培養(yǎng)基及滅菌

培養(yǎng)基：葡萄糖65 g/L，蔗糖24 g/L，磷酸二氫鉀1.2 g/L，蛋白胨12 g/L，VB10.005 g/L，醋酸氨38 g/L，硫酸銨1 g/L。

將培養(yǎng)基溶解后加入錐形瓶，pH用氨水調(diào)節(jié)至6.9，加入泡敵0.5 mL，滅菌鍋121 ℃滅菌20 min。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基及滅菌

培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蔗糖10 g/L，玉米漿12 g/L，硫酸鎂9 g/L，氯化鉀5.5 g/L，磷酸6 g/L，硫酸銨20 g/L。

將培養(yǎng)基溶解后加入錐形瓶，氨水調(diào)pH值至6.5，滅菌鍋121 ℃滅菌23 min。

(3)培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：在火焰保護(hù)下將一級種子按5%接種量接入5 L種子罐中，初始裝液量3 L。用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0，pH范圍：6.9～7.0 。設(shè)置轉(zhuǎn)速恒定700 r/min，風(fēng)量恒定至1.5 L/min進(jìn)行培養(yǎng)。若溶氧還不足，再提罐壓至0.06～0.07 MPa。待種子培養(yǎng)液OD562值在1.0左右時(shí)，按照10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

發(fā)酵培養(yǎng)：按照10%接種量將種子液接入到5 L的發(fā)酵罐中，初始通氣量為1.0 L/min；攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min；pH通過流加氨水控制在6.9～7.0；培養(yǎng)溫度37 ℃。當(dāng)殘?zhí)呛虯N降至一定值時(shí)，將葡萄糖和硫酸銨溶液流加到培養(yǎng)基中；并以泡敵消泡防止泡沫外逃。

1.2.3測定方法

菌體含量：以O(shè)D值表示，發(fā)酵液稀釋50倍后，用721分光光度計(jì)在波長562 nm下測量吸光度；殘?zhí)呛康臏y定：生物傳感分析儀；氨氮含量的測定：銨離子分析儀；L-賴氨酸含量的測定，生物傳感分析儀；溶氧的測定：溶氧電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同有機(jī)氮源對 L- 賴氨酸搖瓶發(fā)酵的影響

分別選取玉米漿、豆粕水解液、多肽粉、菌體蛋白水解液以及菌體蛋白水解液和玉米漿混配作為初始有機(jī)氮源，添加量為 12 g/L(菌體蛋白水解液和玉米漿混配時(shí)各6 g/L)，搖床培養(yǎng)48 h,測定結(jié)果見表1。

表1 不同有機(jī)氮源對 L- 賴氨酸搖瓶發(fā)酵的影響

通過搖瓶試驗(yàn)可知，玉米漿、菌體蛋白水解液、玉米漿和菌體蛋白水解液混配物都是良好的發(fā)酵有機(jī)氮源。為了進(jìn)一步確定一種最優(yōu)氮源，現(xiàn)分別用玉米漿、菌體蛋白水解液、玉米漿和菌體蛋白水解液混配物作為有機(jī)氮源用5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)。

2.2 不同有機(jī)氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵罐發(fā)酵的影響

分別選取玉米漿、菌體蛋白水解液以及菌體蛋白水解液和玉米漿混配作為初始有機(jī)氮源，添加量為 12 g/L(菌體蛋白水解液和玉米漿混合時(shí)各6 g/L)，發(fā)酵罐培養(yǎng)36 h。

2.2.1不同有機(jī)氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵菌體生長的影響

由圖1可以看出，不同有機(jī)氮源對L-賴氨酸生產(chǎn)菌的生長影響不大。3種不同有機(jī)氮源，在對數(shù)生長期的時(shí)間段一致，即均在3 h進(jìn)入對數(shù)生長期，12 h進(jìn)入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期持續(xù)時(shí)間均在15 h左右。以玉米漿和菌體蛋白混配作為有機(jī)氮源時(shí)菌體對應(yīng)的最大OD值略大，OD值約在1.04。

圖1 不同有機(jī)氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵菌體生長的影響

2.2.2不同有機(jī)氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

由圖2可以看出，使用不同有機(jī)氮源發(fā)酵，在36 h停止發(fā)酵時(shí)，以玉米漿和菌體蛋白水解液1∶1混合的有機(jī)氮源的產(chǎn)酸量略大于以玉米漿、菌體蛋白水解液為有機(jī)氮源的產(chǎn)酸量。

圖2 不同有機(jī)氮源對 L- 賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

3.2.3不同有機(jī)氮源對賴氨酸發(fā)酵綜合指標(biāo)影響

由表2可以看出，使用不同有機(jī)氮源，在36 h停止發(fā)酵時(shí)，以玉米漿和菌體蛋白水解液混合使用的有機(jī)氮源的產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率最髙，均優(yōu)于以單品種玉米漿或菌體蛋白水解液為有機(jī)氮源的發(fā)酵指標(biāo)。

表2 不同有機(jī)氮源對賴氨酸發(fā)酵綜合指標(biāo)影響

3 結(jié)論

影響L-賴氨酸發(fā)酵指標(biāo)的因素很多，如菌種、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件、發(fā)酵過程控制等。其中有機(jī)氮源種類的選擇對菌體生長和 L-賴氨酸的產(chǎn)量影響較大。本試驗(yàn)根據(jù)表2可以看出，玉米漿和菌體蛋白水解液混合使用作為L-賴氨酸發(fā)酵的有機(jī)氮源有利于產(chǎn)酸和提高轉(zhuǎn)化率。且菌體蛋白是賴氨酸生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸、糖類及維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是利用微生物發(fā)酵氨基酸的優(yōu)質(zhì)原料[8-11]。按年產(chǎn)4萬t 98.5%賴氨酸計(jì)算，可回收理論菌體蛋白水解液2 800 t，將菌體蛋白作為有機(jī)氮源可以降低賴氨酸生產(chǎn)原料成本，并提高副產(chǎn)物的附加值。

玉米漿是以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得的，玉米在浸漬過程中，由于使用了一定量和濃度的亞硫酸，使種皮成為半透性膜，一些可溶性蛋白，生長因子、無機(jī)鹽和糖類進(jìn)入到浸漬水中，因而玉米漿含有豐富的營養(yǎng)物，它可按一定比例加入到玉米皮中，以彌補(bǔ)玉米纖維中蛋白質(zhì)含量的不足，可以用于氨基酸的培養(yǎng)基[12]。

本文通過實(shí)驗(yàn)確定了玉米漿和菌體蛋白水解液混合使用作為 L-賴氨酸發(fā)酵的有機(jī)氮源，既能提高產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率，又可在成本方面相對其它有機(jī)氮源占有明顯的優(yōu)勢。