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    QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS法在糧谷有機(jī)污染物檢測(cè)中的研究進(jìn)展

    2021-12-03 16:49:50蔣林惠周易枚袁琛凱
    糧食與食品工業(yè) 2021年3期
    關(guān)鍵詞:鹽析提取液乙腈

    蔣林惠,周易枚,陳 煜,袁琛凱,陳 彬

    南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心 (南通 226000)

    農(nóng)藥殘留和真菌毒素是可能污染糧谷的兩類有害物質(zhì)。近年來糧食衛(wèi)生檢查、食品監(jiān)督抽查、食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)等項(xiàng)目中,農(nóng)藥殘留和真菌毒素已經(jīng)成為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象。但由于農(nóng)藥殘留和真菌毒素的品種極多,使檢驗(yàn)工作量嚴(yán)重增加,尤其對(duì)大批量樣品檢查,檢驗(yàn)效率明顯降低。故而開發(fā)高通量的多重污染檢測(cè)技術(shù)變得十分重要。

    使用化學(xué)農(nóng)藥,雖在控制農(nóng)作物病蟲害發(fā)生以及保障糧食、經(jīng)濟(jì)作物持續(xù)穩(wěn)產(chǎn)豐收等方面,做出了突出貢獻(xiàn)[1],但農(nóng)作物可能由此受到嚴(yán)重污染,再加上工業(yè)三廢對(duì)水體土壤的污染,從而使得對(duì)糧谷的污染殘留監(jiān)控變得尤為重要。而糧谷的儲(chǔ)藏加工過程中,由于空氣潮濕或儲(chǔ)藏不善,易遭受各種霉菌的侵害,霉菌的生長(zhǎng)繁殖會(huì)產(chǎn)生多種有毒代謝產(chǎn)物,進(jìn)而造成各種各樣真菌毒素的污染[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全世界每年大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染,約有2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,造成的損失高達(dá)數(shù)百億美元。中國(guó)作為糧食作物的主要產(chǎn)國(guó)之一,真菌毒素污染也造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

    糧谷中農(nóng)藥殘留物主要采用色譜法,包括氣相色譜法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法及液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù),往往需要較為復(fù)雜的樣品提取和凈化等前處理過程。真菌毒素的檢測(cè)則是大多數(shù)先采用免疫親和層析提取、凈化后,再采用高效液相色譜法紫外、熒光檢測(cè)或質(zhì)譜檢測(cè)[4]。這些檢測(cè)方案所需的時(shí)間成本和試劑成本較高,操作繁瑣。隨著檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,多種快速前處理方案的發(fā)布幫助有機(jī)污染物的檢測(cè)往便捷、高效的方向發(fā)展,QuEChERS快速樣品前處理技術(shù)(QuEChERS:Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是近年來發(fā)展較快、應(yīng)用較多的技術(shù)之一。先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)不僅能提高工作效率,節(jié)約資源,也是最終能為食品安全保駕護(hù)航[5]。

    本文介紹QuEChERS結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用法近年來在糧谷有機(jī)污染物檢測(cè)中的應(yīng)用,對(duì)其在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)的問題進(jìn)行了分析歸類,提出進(jìn)行方法優(yōu)化的思路,并展望其在糧谷有機(jī)污染物檢測(cè)中的應(yīng)用和發(fā)展。

    1 QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

    糧食作物生長(zhǎng)過程中易遭受各種病害、蟲害和草害,為提高農(nóng)作物產(chǎn)量,保證糧食生產(chǎn)安全,需要在不同的生長(zhǎng)階段噴施農(nóng)藥。但若農(nóng)藥使用不當(dāng)則會(huì)導(dǎo)致成品糧中農(nóng)藥殘留過多,危害糧谷的食用安全。為快速了解糧谷中農(nóng)藥殘留的實(shí)際情況,開發(fā)快速、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留提取、凈化與檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。目前,QuEChERS法已在農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用[6]。近年來,新儀器新技術(shù)的協(xié)同發(fā)展,使得QuEChERS法提取食品中農(nóng)藥殘留的回收率不斷提高,同時(shí)提取的農(nóng)藥殘留品種不斷增加,檢測(cè)限和定量限也逐漸降低。

    陳溪[7]研究了大米205種農(nóng)殘的快速提取,LC-Q-TRAP/MS測(cè)定方案。實(shí)驗(yàn)取大米粉5 g,加10 mL水[8],15 mL乙腈(含0.1%乙酸),6 g MgSO4、1.5 g NaCl,上清液8 mL,1200 mg無水硫酸鎂,400 mg C18和400 mg PSA吸附劑,上清液過0.2 μm濾膜,LC-Q-TRAP/MS測(cè)定。205種農(nóng)藥在添加水平為10 μg/kg時(shí)的平均回收率范圍為62.4%~127.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍1.9%~20.0%;添加水平為50 μg/kg時(shí),平均回收率范圍為65.9%~120.3%,RSD范圍1.0%~18.4%。檢測(cè)大米中205種農(nóng)藥的定量限均低于10 μg/kg,其中176種農(nóng)藥的定量限為0.5 μg/kg,3種農(nóng)藥的定量限為5 μg/kg,11種農(nóng)藥的定量限為2.5 μg/kg,2種農(nóng)藥的定量限為1.25 μg/kg,13種農(nóng)藥的定量限為10.0 μg/kg,滿足我國(guó)、韓國(guó)、日本、歐盟等國(guó)家大米中農(nóng)藥最大殘留限量(MRLs)的要求。

    張利明等[9]進(jìn)行了QuEChERS-LC-MS/MS實(shí)驗(yàn),針對(duì)稻谷生產(chǎn)中使用的農(nóng)藥種類,大米樣品5 g大米經(jīng)10 mL乙腈提取,加3 g氯化鈉,氮吹濃縮至2 mL,過濾膜,利用LC-MS/MS的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好,R2>0.996,在5、10、50、200 μg/kg 4個(gè)添加水平下,加標(biāo)回收率為80.1%~109.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%~13.5%。盧蘭香等[10]稱取適量試樣(黃瓜10 g、大米5 g、茶葉2 g),加入10 mL水(大米和茶葉加水,黃瓜不加水),渦旋混勻,加乙腈20 mL,加入醋酸鈉提取鹽,取上層提取液到15 mL PSA/C18凈化管中。取上清液10 mL,45 ℃氮吹濃縮至近干。用1 mL乙腈-0.1%磷酸水(1∶1,v/v)復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后上機(jī)測(cè)定。該方法中吡蟲啉在0.05~10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.999),平均回收率在88.3%~109.1%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于3.5%。

    上述研究發(fā)現(xiàn),進(jìn)行糧谷中農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí),多采用含有有機(jī)酸的乙腈溶液進(jìn)行初次提取,再加入鹽析劑(多為硫酸鎂、氯化鈉或醋酸鈉)以期提高萃取效率,凈化試劑主要為單一組分C18、PSA、無水硫酸鎂或其多組分混合物。色譜柱選擇質(zhì)譜專用C18柱即可,目標(biāo)物進(jìn)行LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式掃描定量[11-12]。該類研究方案均能獲得較為滿意的檢出限、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,其指定濃度范圍的線性關(guān)系良好。本文提及的研究對(duì)于提取液、鹽析劑、凈化劑各持己見,但這其中有幾處關(guān)鍵點(diǎn)需要注意,比如提取液的比例(乙腈、水、有機(jī)酸)、鹽析劑及凈化劑的品種及比例選擇。

    2 QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

    糧谷類是受真菌毒素污染最嚴(yán)重的食品原料。近年來,由于氣候、耕作制度和栽培措施的顯著變化,導(dǎo)致真菌毒素對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的污染愈發(fā)嚴(yán)重。為了應(yīng)對(duì)真菌毒素污染問題,許多國(guó)家和地區(qū)制定了糧食及其制品中真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí),國(guó)內(nèi)外研究者也對(duì)食品中真菌毒素的檢測(cè)方法進(jìn)行了深入的研究,研究目的主要集中在提高樣品通量、縮短檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)限和提高準(zhǔn)確性等[13-14]。

    與農(nóng)藥殘留相比,QuEChERS法在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用相對(duì)較少,這是由于受真菌毒素污染最嚴(yán)重的食品主要是谷物和豆類,而谷物和豆類與果蔬的基本組分差異較大。谷物和豆類中水分含量較低,同時(shí)糖類、蛋白質(zhì)和脂類的含量遠(yuǎn)高于果蔬。此外,真菌毒素與谷物、豆類等物料組分的結(jié)合形式和果蔬中農(nóng)藥殘留也有所不同。近年來,許多學(xué)者根據(jù)谷物和豆類的特性開發(fā)了許多基于QuEChERS法的真菌毒素檢測(cè)方法。

    陳慧菲等[15]經(jīng)過研究用改良的QuEChERS方法進(jìn)行提取,用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定谷物中的8種真菌毒素。5 g樣品,提取液16 mL 1%的乙酸乙腈,鹽析劑6 g MgSO4、1.5 g NaCl,1 mL甲醇-乙酸銨溶液(1∶1,v/v)復(fù)溶,供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。8種毒素的線性相關(guān)系數(shù)(R2)均不小于0.998,檢出限0.3~1.0 μg/kg,加標(biāo)回收率76.5%~113.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.78%~5.03%。姜濤等[16]建立了玉米中共17種真菌毒素的測(cè)定方法,5 g樣品,提取液25 mL含有1%甲酸的乙腈水(80∶20,v/v),鹽析劑3 g NaCl,上清液濃縮至1 mL,0.1 g C18凈化,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。線性相關(guān)系數(shù)(R2)均不小于0.994,檢出限為0.1~20.0 μg/kg,加標(biāo)回收率為70.76%~115.14%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.21%~11.34%。肖全偉等[17]實(shí)現(xiàn)了小麥中8種真菌毒素的同時(shí)測(cè)定。2 g樣品,8 mL 0.3%甲酸水溶液,10 mL乙腈提取,鹽析劑1.5 g MgSO4、0.5 g NaCl,上清液2 mL,150 mg無水硫酸鎂,150 mg C18和20 mg PSA吸附劑,提取液濃縮后20%乙腈水溶液溶解,液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。8種真菌毒素在小麥中線性良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99,方法檢出限0.10~1.0 μg/kg,樣品平均加標(biāo)回收率85.1%~95.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.8%~8.5%。

    王麗娟等[18]進(jìn)行糧谷中16種真菌毒素測(cè)定研究,5 g樣品經(jīng)20 mL乙腈-水-乙酸(84∶15∶1,v/v)溶液超聲提取,鹽析劑4 g無水MgSO4、1 g NaCl,提取液采用120 mg C18、600 mg MgSO4凈化,凈化液過0.22 μm微孔濾膜,用HPLC-MS/MS分析檢測(cè),結(jié)果能滿足日常檢測(cè)需求。Koesukwiwat等[19]采用研究利用QuEChERS法提取大米中的14種真菌毒素,所用提取溶劑為水-乙腈(10∶10,v/v)混合溶劑,鹽析劑4 g MgSO4和1 g NaCl,8 mL上清液,加入1.2 g MgSO4、0.25 g C18、0.25 g中性氧化鋁(Al-N)和0.4 g PSA凈化,結(jié)果滿意度高。

    總結(jié)上述學(xué)者對(duì)于谷物中真菌毒素的檢測(cè)方案:提取液中水的比例是提取效率的關(guān)鍵點(diǎn),選擇水、乙腈、有機(jī)酸三者的比例對(duì)于提高提取率十分重要;鹽析劑的選擇與農(nóng)藥殘留提取相似;凈化試劑則更為多樣化,C18、PSA、中性氧化鋁、MgSO4;濃縮后復(fù)溶試劑的選擇十分重要(有機(jī)相種類、有機(jī)相比例、銨鹽),建議選擇與初始流動(dòng)相相一致的復(fù)溶試劑。

    3 QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在復(fù)合污染物檢測(cè)中的應(yīng)用

    總結(jié)現(xiàn)有的QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于糧谷類產(chǎn)品的實(shí)例,其多局限于農(nóng)藥殘留或真菌毒素單類藥物,使用QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定農(nóng)獸藥殘留和真菌毒素的方法仍較少見。

    趙健等[20]建立了同時(shí)測(cè)定大米10種真菌毒素和殺鼠劑的檢測(cè)方法。大米樣品2.5 g,使用10 mL乙腈-水-甲酸(體積比80∶19∶1)作為提取溶液,80 mg PSA凈化,凈化溶液經(jīng)濃縮、復(fù)溶后,采用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明:10種藥物的線性范圍為2~100 μg/L,線性關(guān)系良好(R2>0.99),各藥物的平均加標(biāo)回收率在75.2%~110.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%~10.7%,方法定量限在0.5~2.5 μg/kg,適用于大米中10種殺鼠劑和真菌毒素殘留的同時(shí)快速定性定量分析。高璐斐[4]進(jìn)行了小麥種污染物的專項(xiàng)研究,實(shí)驗(yàn)稱取5 g樣品,加入20 mL甲酸/水/乙腈(v/v/v,1∶14∶85)和少量的氯化鈉以及4 g硫酸鈉,提取上清液5 mL,裝入0.1 g C18吸附劑,取上清液3 mL濃縮,加入500 μL甲醇/水(v/v,3∶2)混合液溶解,過0.22 μm濾膜,液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。采用本方法可以同時(shí)對(duì)14種小麥污染物進(jìn)行定性定量測(cè)定,其線性方程相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99;檢測(cè)低限均在現(xiàn)有限量范圍內(nèi);農(nóng)藥殘留殘留回收率在87%~103%之間,真菌毒素回收率在82%~96%之間。

    同時(shí)提取測(cè)定多類有機(jī)污染物,所需考慮的因素相應(yīng)增加,農(nóng)藥殘留類物質(zhì)與真菌毒素類在有些性質(zhì)方面相差較遠(yuǎn),如何選擇一個(gè)合適的提取體系變得較為困難。糧谷類的特殊性質(zhì)對(duì)于凈化試劑也有特殊選擇性,需根據(jù)實(shí)際樣品進(jìn)行篩選,凈化試劑多選擇單一品種,不再進(jìn)行多成分組合。

    4 結(jié)語

    大量的研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行糧谷中農(nóng)藥真菌毒素殘留的高通量快速檢測(cè)技術(shù)研究,從前處理的快速提取技術(shù)到目標(biāo)物的儀器確認(rèn),其思路一脈相承。QuEChERS技術(shù)講究快速、簡(jiǎn)單、低了價(jià)、高效、安全,其主要通過提取液提取、鹽析劑萃取、凈化試劑再凈化三大步驟進(jìn)行樣品中目標(biāo)物的富集。

    各項(xiàng)研究中,提取液、鹽析劑、凈化劑得選擇并不一致,有些研究甚至省略了凈化步驟。這些方法雖然在已有研究中獲得了較為滿意得效果,但作為一種通用方案并不完善。筆者期望能夠?qū)σ延械梅椒ㄟM(jìn)行優(yōu)化,建立一種適用于糧谷中多類別污染物的快速檢測(cè)技術(shù)。進(jìn)行糧谷中農(nóng)藥殘留及真菌毒素的檢測(cè)時(shí),對(duì)以下幾個(gè)方面提出優(yōu)化建議。

    (1)提取液。需特別注意糧谷樣品蛋白質(zhì)及糖類組分較高,提取和凈化過程中易交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),提取液中加入一定比例的水,能浸潤(rùn)糧谷顆粒,增加有機(jī)溶劑對(duì)非水溶性基質(zhì)的滲透性,提高目標(biāo)物提取效果;有機(jī)相選擇乙腈,因乙腈易于鹽析、溶解農(nóng)藥、真菌毒素的能力較強(qiáng),且萃取物中脂類物質(zhì)的雜質(zhì)含量較低;少量的甲酸能調(diào)節(jié)pH,并有效提取對(duì)于酸度、極性較為敏感的真菌毒素,并降低對(duì)堿敏感的農(nóng)藥或毒素的影響[21]。故而建議提取液選擇乙腈∶水∶甲酸的混合溶液。

    (2)鹽析劑。MgSO4是促進(jìn)液液分配的最佳選擇,且可以增大極性組分的回收率,但會(huì)引入極性組分雜志;添加NaCl可以調(diào)節(jié)極性、減少極性雜質(zhì)的干擾,但也會(huì)導(dǎo)致液液分配效果變差。在實(shí)際應(yīng)用將MgSO4和NaCl混合使用,以獲得最佳鹽析效果。鹽析劑選擇MgSO4∶NaCl質(zhì)量比為4∶1。

    (3)凈化試劑。C18對(duì)長(zhǎng)鏈脂類物質(zhì)、甾醇等非極性干擾物有良好的吸附效果。PSA能有效吸附糖類、脂肪酸、有機(jī)酸、脂類以及某些色素等,也易與酸性真菌毒素(OTA等)分子上羧基反應(yīng),影其回收率。凈化試劑建議選擇C18。

    (4)復(fù)溶試劑。復(fù)溶試劑的選擇需兼顧目標(biāo)物的溶解能力及溶劑效應(yīng)。建議選擇初始流動(dòng)相作為目標(biāo)物的復(fù)溶試劑。

    建立適用于糧谷中真菌毒素及農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方案,達(dá)到高效,準(zhǔn)確,高通量的目標(biāo),除上述關(guān)鍵點(diǎn),可能還有其它方面,需要通過更深入的探索來加以完善。

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