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    芥子堿硫氰酸鹽對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制研究

    2021-06-15 15:29:07蘇羽屾曾智銳榮冬蕓王葉李丹唐姍姍汪濤龍雪梅曹煜
    中國藥房 2021年8期
    關(guān)鍵詞:激動劑鱗狀空白對照

    蘇羽屾 曾智銳 榮冬蕓 王葉 李丹 唐姍姍 汪濤 龍雪梅 曹煜

    中圖分類號 R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408(2021)08-0952-09

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.10

    摘 要 目的:研究芥子堿硫氰酸鹽(ST)對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移的影響,并考察其可能的作用機(jī)制。方法:將人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞分為空白對照組(0.1%二甲基亞砜)和ST不同濃度組(5、10、20 μmol/L),分別通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷染色實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,通過Western blot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分別測定各組細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)的表達(dá)水平。另將SCL-1細(xì)胞分為空白對照組(0.1%二甲基亞砜)、ST單用組(20 μmol/L)、ST+NSC228155組[20 μmol/L ST+100 μmol/L NSC228155(EGFR激動劑)]和ST+SC79組[20 μmol/L ST+20 μmol/L SC79(PI3K/Akt激動劑)],分別通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,并通過Western blot實(shí)驗(yàn)測定空白對照組(0.1%二甲基亞砜)和ST不同濃度組(5、10、20 μmol/L)組細(xì)胞中表皮生長因子受體(EGFR)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表達(dá)水平,以驗(yàn)證ST的作用與EGFR/PI3K/Akt信號通路的關(guān)系。另將SCL-1細(xì)胞和人正常皮膚成纖維細(xì)胞WS1分別分為空白對照組(0.1%二甲基亞砜)、 ST組(20 μmol/L)、 ZD1839組(陽性對照,20 μmol/L,EGFR抑制劑)和LY294002組(陽性對照,20 μmol/L,PI3K/Akt抑制劑),采用CCK-8實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞的增殖能力,以評價(jià)ST的細(xì)胞毒性。結(jié)果:與空白對照組比較,5、10、20 μmol/L ST組SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著減弱(P<0.05);Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5、10、20 μmol/L ST組SCL-1細(xì)胞中N-cadherin蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05),E-cadherin蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05),并且細(xì)胞中EGFR、p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。與ST單用組比較,ST+NSC228155組和ST+SC79組SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著增強(qiáng)(P<0.05)。與空白對照組比較,ST組WS1細(xì)胞的增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),SCL-1細(xì)胞增殖能力顯著減弱(P<0.05),ZD1839組和LY294002組兩種細(xì)胞的增殖能力均顯著減弱(P<0.05);與ST組比較,ZD1839組和LY294002組WS1細(xì)胞的增殖能力均顯著減弱(P<0.05),但SCL-1細(xì)胞的增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:ST可能通過抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路的活化而抑制人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞的增殖、EMT和轉(zhuǎn)移,且其毒副作用較小。

    關(guān)鍵詞 芥子堿硫氰酸鹽;人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞;增殖;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)移;EGFR/PI3K/Akt信號通路

    Study on the Effects and Its Mechanism of Sinapine Thiocyanate on the Proliferation, Epithelial Mesenchymal Transition and Metastasis of Human Cutaneous Squamous Cell Carcinoma SCL-1 Cells

    SU Yushen1,2,ZENG Zhirui3,4,RONG Dongyun1,2,WANG Ye1,2,LI Dan1,2,TANG Shanshan1,2,WANG Tao1,2, LONG Xuemei1,2,CAO Yu1,2(1. School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China; 2. Dept. of Dermatology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China; 3. Dept. of Physiology, School of Basic Medical Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China; 4. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pathogenesis&Drug Research on Common Chronic Diseases, Guiyang 550004, China)

    ABSTRACT? ?OBJECTIVE: To study the effects of sinapine thiocyanate (ST) on the proliferation, epithelial mesenchymal transformation (EMT) and metastasis of human cutaneous squamous cell carcinoma SCL-1 cells, and to investigate its possible mechanism. METHODS: Human cutaneous squamous cell carcinoma SCL-1 cells were divided into blank control group (0.1% DMSO) and ST different concentration groups (5, 10, 20? ? ? μmol/L). CCK-8 assay, 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) test, scratch test and Transwell chamber invasion test were adopted to test the proliferation, migration and invasion ability. The expression of N-cadherin and E-cadherin were detected by Western blot and immunofluorescence assay. Other SCL-1 cells were collected and divided into blank control group (0.1% DMSO), ST group (20 μmol/L), ST+NSC228155 group [20 μmol/L ST+100 μmol/L NSC228155 (EGFR agonist)] and ST+SC79 group [20 μmol/L ST+20 μmol/L SC79 (PI3K/Akt agonist)]. The proliferation, migration and invasion ability of SCL-1 cells in each group were detected by CCK-8 assay, scratch test and Transwell chamber invasion assay. The expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K), phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase (p-PI3k), protein kinase B (Akt) and phosphorylated protein Akt (p-Akt) protein of cells in blank control group and ST different concentration groups (5, 10, 20 μmol/L) were determined by Western blot assay so as to validate the relationship between ST effect and EGFR/PI3K/Akt signaling pathway. SCL-1 cells and human normal skin fibroblasts cell WS1 were divided into blank control group (0.1% DMSO), ST group (20 μmol//L), ZD1839 group (positive control, 20 μmol//L, EGFR inhibitor) and LY294002 group (positive control, 20 μmol//L, PI3K/Akt inhibitor). CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation in order to evaluate the cells cytotoxicity of ST. RESULTS: Compared with blank control group, the proliferation, migration and invasion ability of SCL-1 cells were significantly decreased in 5, 10, 20 μmol/L ST groups (P<0.05). Western blot and immunofluorescence assay showed that the expression of N-cadherin in SCL-1 cells were decreased significantly in 5, 10, 20 μmol/L ST groups (P<0.05), while the protein expression of E-cadherin was increased significantly (P<0.05); the protein expressions of EGFR, p-PI3K and p-Akt were significantly decreased (P<0.05). Compared with ST group, the proliferation, migration and invasion ability of SCL-1 cells were increased significantly in ST+NSC228155 group and ST+SC79 group (P<0.05). Compared with blank control group, the proliferation ability of WS1 cells had no significant change in ST group, while the proliferation ability of SCL-1 cells was decreased significantly (P<0.05); the proliferation ability of the two kinds of cells were decreased significantly in ZD1839 group and LY294002 group (P<0.05). Compared with ST group, the proliferation ability of WS1 cells was decreased significantly in ZD1839 group and LY294002 group (P<0.05), but there was no significant difference in the proliferation ability of SCL-1 cells (P>0.05). CONCLUSIONS: ST may inhibit the proliferation, EMT and metastasis of SCL-1 cells through inhibiting the activation of EGFR/PI3K/Akt signaling pathway, and its side effects are few.

    KEYWORDS? ?Sinapine thiocyanate; Human cutaneous squamous cell carcinoma SCL-1 cells; Proliferation; Epithelial mesechymal transition; Metastasis; EGFR/PI3K/Akt signaling pathway

    皮膚鱗狀細(xì)胞癌多為表皮腫瘤,常采用手術(shù)方法進(jìn)行治療,但治療后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移;復(fù)發(fā)后,多采用放化療方法進(jìn)行治療,治療風(fēng)險(xiǎn)較高[1-2]。因此,尋找一種安全的新型藥物對于治療復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性皮膚鱗狀細(xì)胞癌較為重要。皮膚鱗狀細(xì)胞癌易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)是其轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一[3]。EMT是細(xì)胞由上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的過程,其與多種細(xì)胞生物的正常胚胎發(fā)育相關(guān),但同時(shí)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展過程中,原柱狀的正常上皮細(xì)胞會逐漸變?yōu)樗笮蔚拈g質(zhì)細(xì)胞,此時(shí)上皮細(xì)胞的極性消失,失去了原本與基底膜連接的上皮表型特征,從而獲得遷移、侵襲、抗凋亡等間質(zhì)表型功能[5]。

    表皮生長因子受體(EGFR)是細(xì)胞增殖、發(fā)育所必需的受體[6]。當(dāng)表皮生長因子與其配體在細(xì)胞外結(jié)合后形成二聚體,此二聚體可使細(xì)胞內(nèi)酪氨酸發(fā)生磷酸化并激活下游細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián),激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑[7],而該途徑與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性行為密切相關(guān)[8]。

    芥子堿硫氰酸鹽(ST)是從十字花科藥用植物中提取得到的一種木脂素類化合物,具有抗炎、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[9],具有較大的開發(fā)價(jià)值。有報(bào)道指出,ST能夠抑制小鼠的血脂血糖升高、動脈粥樣硬化和肝細(xì)胞脂肪變性[10-11];此外,ST對肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有抑制作用[12]。然而,ST對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的影響及作用機(jī)制尚不清楚。因此,本研究擬探討ST對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、EMC和轉(zhuǎn)移的影響,并從EGFR/PI3K/Akt信號通路出發(fā)初步分析其分子作用機(jī)制,為ST藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)以及將其用于臨床治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌提供可行的參考依據(jù)。

    1 材料

    1.1 主要儀器

    HHM-SY96S型多功能酶標(biāo)儀購自深圳恒美生物科技有限公司;54-03003型倒置光學(xué)顯微鏡購自德國Bresser公司;GelDoc XR型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;LV100ND型熒光顯微鏡購自日本Nikon公司;DYCP-31DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀均購自北京六一生物科技有限公司;D-650型水平細(xì)胞超凈工作臺購自江蘇常州如益科技有限公司;303-5B型二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海尚儀生物科技有限公司。

    1.2 主要藥品與試劑

    ST原料藥(批號7431-77-8,純度>98%)購自成都儀睿生物科技有限公司;EGFR激動劑NSC228155、PI3K/Akt激動劑SC79、EGFR抑制劑ZD1839和PI3K/Akt抑制劑LY294002(批號分別為HY-101084、HY- 18749、HY-50895、HY-10108,純度均大于99%)均購自美國MCE公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶[含乙二胺四乙酸(EDTA)]溶液均購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒(批號BS350A)購自上海白鯊生物科技有限公司;Transwell小室(批號30419069)購自美國Corning公司;Matrigel膠(批號2446ML005)購自德國Biofroxx公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解液均購自福州飛凈生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)凝膠試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)定量試劑盒(批號分別為MA0388-08F、MA0082-02C)均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;兔源EGFR、PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)多克隆抗體(批號分別為25869、60225、10176、12789、22018)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔源N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)多克隆抗體、鼠源E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、鼠源β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(批號分別為GB111009、GB12868、GB12001)均購自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(批號分別為AS014、AS003)均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EDU)增殖檢測試劑盒(批號C0088L)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ECL高敏曝光液(批號36222ES60)購自武漢聚能慧達(dá)生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格,水為超純水。

    1.3 細(xì)胞

    人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司,人正常皮膚表皮纖維細(xì)胞WS1購自美國ATCC細(xì)胞庫。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

    將SCL-1細(xì)胞和WS1細(xì)胞分別用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(后文簡寫為“完全培養(yǎng)基”)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長至融合度約90%時(shí),用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)溶液對其進(jìn)行消化、傳代,取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(本研究所用的為傳代6~10代的細(xì)胞)。

    2.2 ST對SCL-1細(xì)胞增殖的影響

    2.2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將SCL-1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)溶液消化7 min后,以1 000 r/min離心5 min,吸棄上清液,收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸,制成密度均為4×103 mL-1的單細(xì)胞懸液,按每孔100 μL接種到96孔板中。將細(xì)胞分為空白對照組(含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基,下同)和ST不同濃度組(5、10、20 μmol/L,以完全培養(yǎng)基配制,藥物濃度均根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定,下同),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔;并另設(shè)不加細(xì)胞和藥物的調(diào)零孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞充分貼壁后,每孔加入相應(yīng)藥液或完全培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)24 h后,吸棄培養(yǎng)基,按每孔100 μL加入CCK-8溶液(將CCK-8溶液與RPMI 1640培養(yǎng)基按體積比1 ∶ 9混合);作用3 h后,采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔的光密度(OD)值并計(jì)算各組細(xì)胞的增殖率:增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值)/(空白對照組OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。去掉3次實(shí)驗(yàn)中的最大值和最小值,將其余所有數(shù)據(jù)均用于統(tǒng)計(jì)分析。

    2.2.2 EDU染色實(shí)驗(yàn) 將SCL-1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)溶液消化8 min后,以1 000 r/min離心5 min,吸棄上清液,收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸,制成密度為2×105 mL-1的細(xì)胞懸液。在6孔板中鋪上無菌蓋玻片,并按每孔200 μL加入細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分為空白對照組(含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基)和ST不同濃度組(5、10、20 μmol/L),每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。每組細(xì)胞中加入EDU溶液(按RPMI 1640培養(yǎng)基和EDU原液體積比1 000 ∶ 1稀釋)1.9 mL和相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基100 μL,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h,根據(jù)EDU增殖檢測試劑盒說明書方法對其進(jìn)行洗片、固定、染色、DAPI染核等操作。隨后,在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照,分別計(jì)數(shù)每視野下的陽性細(xì)胞數(shù)(即出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)),并計(jì)算陽性細(xì)胞率:每視野下的陽性細(xì)胞率(%)=每視野下陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%,每組均取平均值作為檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)處理同“2.2.1”項(xiàng)。

    2.3 ST對SCL-1細(xì)胞遷移能力的影響

    采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。按“2.2.2”項(xiàng)下方法對SCL-1細(xì)胞進(jìn)行消化、離心和重懸。將細(xì)胞懸液按每孔1 mL接種至6孔板中,并按每孔1 mL加入完全培養(yǎng)基,吹打混勻后,將細(xì)胞分為空白對照組(含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基)和ST不同濃度組(5、10、20 μmol/L),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞融合度達(dá)95%以上時(shí),用200 μL移液槍槍頭在每孔細(xì)胞中劃3條線。以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后,分別加入RPMI 1640培養(yǎng)基1.9 mL和相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基100 μL。在加藥培養(yǎng)的0、24 h時(shí),分別在倒置光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野對進(jìn)行拍照,使用Image Pro Plus 6.0軟件測量各孔劃痕的面積并計(jì)算各組細(xì)胞的相對遷移率:相對遷移率(%)=(實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)0 h時(shí)的劃痕面積-實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24 h時(shí)的劃痕面積)/(空白對照組培養(yǎng)0 h的劃痕面積-空白對照組培養(yǎng)24 h時(shí)的劃痕面積)×100%,每組均取平均值作為檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)處理同“2.2.1”項(xiàng)。

    2.4 ST對SCL-1細(xì)胞侵襲能力的影響

    采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。將Matrigel膠和不含血清的培養(yǎng)基按體積比1 ∶ 8混勻,均勻鋪在Transwell小室的上室,在37 ℃培養(yǎng)箱中將Matrigel烘干,棄掉多余的培養(yǎng)基。按“2.2.2”項(xiàng)下方法對SCL-1細(xì)胞進(jìn)行消化、離心并收集細(xì)胞,然后將細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸,制成密度為4×105 mL-1的細(xì)胞懸液。吸取上述細(xì)胞懸液100 μL到Transwell小室的上室,下室加入完全培養(yǎng)基700 μL。將細(xì)胞分為空白對照組(含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基)和ST不同濃度組(5、10、20 μmol/L),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞均按每孔100 μL加入相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基。將小室置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后,再以4%多聚甲醛溶液固定20 min,PBS漂洗5 min×2次;用1%結(jié)晶紫試劑染色15 min,PBS漂洗5 min×2次。擦拭掉非侵襲細(xì)胞后將小室放入烘箱中烘干,然后在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各孔侵襲的細(xì)胞,每個(gè)小室隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照后進(jìn)行計(jì)數(shù),取其平均值作為檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)處理同“2.2.1”項(xiàng)。

    2.5 ST對SCL-1細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    2.5.1 Western blot實(shí)驗(yàn) 將SCL-1細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶(含EDTA)溶液消化7 min后,以1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞沉淀。按“2.2.2”項(xiàng)下方法將細(xì)胞重懸,然后按每孔2 mL將細(xì)胞接種至6孔板中,將其分為空白對照組(含0.1%DMSO)和ST不同濃度組(5、10、20 μmol/L)。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后,每孔加入相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基2 mL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;吸棄培養(yǎng)基,按每孔100 μL加入體積比1 ∶ 100的PMSF和RIPA裂解液的混合液,于冰上裂解15 min,然后在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min,吸取蛋白上清液,并采用BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白定量。取變性后的蛋白20 μg行10%SDS-PAGE(電壓85 V,時(shí)間2 h),再以320 mA恒流2 h轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,分別加入E-cadherin、N-cadherin、β-actin一抗(稀釋比例均為1 ∶ 1 000),4 ℃孵育過夜;TBST溶液漂洗15 min×3次,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(稀釋比例均為1 ∶ 2 000),室溫孵育2 h;TBST溶液漂洗3次×15 min,加入ECL曝光液后,于凝膠成像儀中成像。以Image Lab 5.2.0軟件測定目標(biāo)條帶的灰度值,以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)的條帶灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.5.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法對SCL-1細(xì)胞進(jìn)行消化、離心和重懸,然后按每孔100 μL接種到預(yù)先放有蓋玻片的6孔板中,并加入完全培養(yǎng)基2 mL,吹打混勻。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,以PBS清洗細(xì)胞爬片5 min×3次,然后將細(xì)胞分為空白對照組(含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基)和ST不同濃度組(5、10、20 μmol/L),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,各組細(xì)胞均按每孔100 μL加入相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞再次置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后用PBS浸洗3 min×3次,用4%多聚甲醛溶液固定爬片15 min,以PBS浸洗5 min×3次,用0.3%TritonX-100試劑室溫通透25 min,以PBS浸洗5 min×3次,將爬有細(xì)胞的蓋玻片倒扣在載玻片上,在每個(gè)蓋玻片上滴山羊血清室溫封閉30 min后,吸掉多余封閉液,分別加入N-cadherin、E-cadherin一抗(稀釋比例均為1 ∶ 100),4 ℃孵育過夜;PBS浸洗3 min×3次,避光加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(稀釋比例均為1 ∶ 100),室溫孵育1 h;以PBS浸洗3 min×3次,用DAPI復(fù)染核5 min;以PBS浸洗3 min×3次,吸水紙吸干多余液體,然后用含熒光猝滅劑的封片液封片。在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,用Image Pro Plus 6.0軟件測定各組細(xì)胞每視野下的熒光強(qiáng)度并計(jì)算其相對熒光強(qiáng)度:相對熒光強(qiáng)度(%)=各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞每視野下平均熒光強(qiáng)度/空白對照組細(xì)胞每視野下平均熒光強(qiáng)度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)處理同“2.2.1”項(xiàng)。

    2.6 ST是否通過EGFR/PI3K/Akt信號通路影響SCL-1細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究

    2.6.1 加入EGFR/PI3K/Akt信號通路激動劑后對ST生物學(xué)效應(yīng)的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組(含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基)、ST組(20 μmol/L)、ST+NSC228155組[20 μmol/L ST+100 μmol/L NSC228155]和ST+SC79組[20 μmol/L ST+20 μmol/L SC79],分別按“2.2.1”“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并檢測SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)處理同“2.1.1”項(xiàng)。

    2.6.2 細(xì)胞中EGFR/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)采用 Western blot法進(jìn)行檢測。按“2.7”項(xiàng)下方法對細(xì)胞進(jìn)行分組、給藥、電泳和轉(zhuǎn)膜等操作。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后,分別加入EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin一抗(稀釋比例均為1 ∶ 1 000),4 ℃孵育過夜;TBST溶液漂洗15 min×3次,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比例為1 ∶ 2 000),室溫孵育2 h;TBST溶液漂洗15 min×3次,加入ECL曝光液后,于凝膠成像儀中成像。以Image Lab 5.2.0軟件測定目標(biāo)條帶的灰度值,以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(EGFR以β-actin為內(nèi)參,p-PI3K以PI3K為內(nèi)參,p-Akt以Akt為內(nèi)參)的條帶灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.7 ST的細(xì)胞毒性考察

    分別將SCL-1、WS1細(xì)胞分為空白對照組(含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基)、ST組(20 μmol/L)、EGFR抑制劑ZD1839組(陽性對照,20 μmol/L)和 PI3K/Akt抑制劑LY294002組(陽性對照,20 μmol/L),按“2.2.1”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞的增殖能力,并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 ST對SCL-1細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

    3.1.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組比較,5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞的增殖率均顯著降低(P<0.05),且ST的作用具有明顯的濃度依賴性(P<0.05)。各組SCL-1細(xì)胞增殖率的測定結(jié)果見表1。

    3.1.2 EDU染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組比較,5、10、20 μmol/L ST組的細(xì)胞陽性率均顯著降低(P<0.05),且ST的作用具有一定的濃度依賴性趨勢,其中20 μmol/L ST組的細(xì)胞陽性率顯著低于5、10 μmol/L ST組(P<0.05)。各組SCL-1細(xì)胞的EDU染色圖見圖1(圖中,EDU表示陽性細(xì)胞,DAPI表示細(xì)胞核,Merge表示兩者的熒光合并圖),陽性細(xì)胞率的測定結(jié)果見表1。

    3.2 ST對SCL-1細(xì)胞遷移的影響結(jié)果

    與空白對照組比較,5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞的相對遷移率均顯著降低(P<0.05),且ST的作用具有一定的濃度依賴性趨勢,其中10、20 μmol/L ST組細(xì)胞的相對遷移率顯著低于5 μmol/L ST組(P<0.05)。各組SCL-1細(xì)胞遷移能力觀察的顯微圖見圖2,相對遷移率的測定結(jié)果見表1。

    3.3 ST對SCL-1細(xì)胞侵襲能力的影響結(jié)果

    與空白對照組比較,5、10、20 μmol/L ST組的侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05),且ST的作用具有一定的濃度依賴性趨勢,其中20 μmol/L ST組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于5、10 μmol/L ST組(P<0.05)。各組細(xì)胞侵襲能力觀察的顯微圖見圖3,侵襲細(xì)胞數(shù)的測定結(jié)果見表1。

    3.4 ST對SCL-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果

    3.4.1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組比較,5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),N-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),且ST的作用具有明顯的濃度依賴性(P<0.05)。各組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的電泳圖見圖4,表達(dá)水平的測定結(jié)果見表2。

    3.4.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組比較,5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05),N-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05),且ST的作用具有明顯的濃度依賴性(P<0.05),該結(jié)果與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。各組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的免疫熒光圖見圖5(圖中,E-cadherin、N-cadherin表示蛋白表達(dá),DAPI表示細(xì)胞核,Merge表示兩者的熒光合并圖),表達(dá)水平的測定結(jié)果見表2。

    3.5 ST是否通過EGFR/PI3K/Akt信號通路影響SCL-1細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究結(jié)果

    3.5.1 加入EGFR/PI3K/Akt信號通路激動劑后對ST抑制SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響結(jié)果 與空白對照組比較,各藥物組細(xì)胞的增殖率、相對遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與ST組比較,ST+NSC228155組和ST+ SC79組細(xì)胞的增殖率、相對遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05),表明EGFR激動劑NSC228155和PI3K/Akt激動劑SC79均可逆轉(zhuǎn)ST對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用,這提示ST可能是通過EGFR/PI3K/Akt信號通路而發(fā)揮其對SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。加入EGFR/PI3K/Akt信號通路激動劑后對ST抑制SCL-1細(xì)胞遷移、侵襲能力影響的顯微圖見圖6,增殖、遷移、侵襲能力影響的測定結(jié)果見表3。

    3.5.2 ST對SCL-1細(xì)胞中EGFR/ PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果 與空白對照組比較,5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞中EGFR、p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),且具有明顯的濃度依賴性(P<0.05)。各組細(xì)胞中EGFR、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的電泳圖見圖7,表達(dá)水平的測定結(jié)果見表4。

    3.6 ST的細(xì)胞毒性考察結(jié)果

    與空白對照組比較,ST組WS1細(xì)胞的增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且SCL-1細(xì)胞的增殖率顯著降低(P<0.05);而ZD1839組、LY294002組WS1、SCL-1細(xì)胞的增殖率均顯著降低(P<0.05)。與ST組比較,ZD1839組、LY294002組WS1細(xì)胞的增殖率均顯著降低(P<0.05),而SCL-1細(xì)胞的增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示,在等濃度下,ST的細(xì)胞毒性較陽性藥EGFR抑制劑ZD1839和PI3K/Akt抑制劑LY294002小,說明ST是一種藥效明顯且較為安全的藥物。各藥物對WS1細(xì)胞和SCL-1細(xì)胞增殖影響的測定結(jié)果見表5。

    4 討論

    當(dāng)前,皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療方法主要是手術(shù)、放化療結(jié)合等[1-2]。然而,患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率較高,且存在較多的并發(fā)癥[13]。中藥在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中晚期甚至是術(shù)后恢復(fù)不良患者的治療中發(fā)揮著重要作用,其具有毒副作用小等優(yōu)勢,能夠適當(dāng)?shù)匮娱L患者的生存期等[14]。本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、EDU染色實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),使用5、10、20 μmol/L的ST處理后,SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著減弱,且其作用具有一定的濃度依賴性趨勢。EMT過程中常見的標(biāo)志物改變有上皮性蛋白(如E-cadherin、緊密連接蛋白、細(xì)胞角蛋白)表達(dá)下調(diào),間質(zhì)性蛋白(如N-cadherin、纖維連接蛋白、波形蛋白)表達(dá)上調(diào)[15]。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)及免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ST能夠顯著上調(diào)SCL-1細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá),并下調(diào)N-cadherin蛋白的表達(dá),且其作用具有一定的濃度依賴性趨勢。

    相關(guān)臨床研究顯示,2例患有慢性粒細(xì)胞白血病且同時(shí)患有皮膚鱗狀細(xì)胞癌的患者在使用EGFR抑制劑伊馬替尼治療后疾病得到了緩解,提示EGFR可能與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[16]。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ST能夠抑制SCL-1細(xì)胞中EGFR蛋白的表達(dá)。EGFR信號通路可影響PI3K/Akt等多種下游效應(yīng)分子的活化,由EGFR介導(dǎo)的p-PI3K(PI3K的活化形式)及其下游分子p-Akt(Akt的活化形式)增多能夠顯著促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的多種惡性生物學(xué)行為(如異常增殖、EMT以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等)[17-18]。本研究結(jié)果顯示,ST還能夠顯著抑制SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)。

    為進(jìn)一步探討ST對SCL-1細(xì)胞惡性生物行為學(xué)的抑制是否是通過EGFR/PI3K/Akt信號通路來介導(dǎo)的,本課題組以認(rèn)可度高的EGFR激動劑NSC228155和PI3K/Akt激動劑SC79為研究工具[19],通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NSC228155、SC79均能夠減弱ST對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。此外,與最為經(jīng)典的EGFR通路抑制劑ZD1839和PI3K/Akt通路抑制劑LY294002相比[15],ST對SCL-1細(xì)胞增殖的抑制作用沒有差異,但其對正常WS1細(xì)胞的毒副作用明顯要小。

    綜上所述,ST對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞的增殖、EMT和轉(zhuǎn)移均有明顯的抑制作用,且其對正常WS1細(xì)胞的毒副作用較小;ST抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用可能是與抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路的活化有關(guān),但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

    參考文獻(xiàn)

    [ 1 ] WALDMAN A,SCHMULTS C. Cutaneous squamous cell carcinoma[J]. Hematol Oncol Clin North Am,2019,33(1):1-12.

    [ 2 ] QUE S,ZWALD F O,SCHMULTS C D. Cutaneous squamous cell carcinoma:incidence,risk factors,diagnosis,and staging[J]. J Am Acad Dermatol,2018,78(2):237- 247.

    [ 3 ] 楊惠鈴,李繼功,溫寧.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與口腔鱗狀細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,11(13):352-359.

    [ 4 ] 劉海霞,陳必良,李佳,等. EMT參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(14):2790-2793.

    [ 5 ] 龐翠,張菊,劉文超,等. EMT研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2016,24(15):2484-2487.

    [ 6 ] SABBAH D A,HAJJO R,SWEIDAN K. Review on epidermal growth factor receptor(EGFR)structure,signaling pathways,interactions,and recent updates of EGFR inhibitors[J]. Curr Top Med Chem,2020,20(10):815-834.

    [ 7 ] MEI X L,ZHONG S. Long noncoding RNA LINC00520 prevents the progression of cutaneous squamous cell carcinoma through the inactivation of the PI3K/Akt signa- ling pathway by downregulating EGFR[J]. Chin Med J(Engl),2019,132(4):454-465.

    [ 8 ] LEE M S,JEONG M,LEE H,et al. PI3K/Akt activation induces PTEN ubiquitination and destabilization accele- rating tumourigenesis[J]. Nat Commun,2015,143(4):444- 455.

    [ 9 ] CHEN S,JIN Y,ZHU Z,et al. In vivo study on site of action of sinapine thiocyanate following acupoint herbal patching[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2019,14(23):175-179.

    [10] LI Y,ZHANG X,YANG W,et al. Mechanism of the protective effects of the combined treatment with rhynchophylla total alkaloids and sinapine thiocyanate against a prothrombotic state caused by vascular endothelial cell inflammatory damage[J]. Exp Ther Med,2017,13(6):3081- 3088.

    [11] 黃涵檉,張祝,張希洲,等.芥子堿硫氰酸鹽抑制IR小鼠血脂血糖升高、動脈粥樣硬化及肝細(xì)胞脂肪變性[J].中國病理生理雜志,2018,34(1):1-8.

    [12] 陳騰祥,王婧雅,曾智銳,等.芥子堿硫氰酸鹽對肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2020,6(12):1731-1738.

    [13] VASILIKI A P,STEVEN J,et al. Phase Ⅰ study of vandetanib with radiation therapy with or without cisplatin in locally advanced head and neck squamous cell carcinoma[J].Head Neck,2016,38(3):439-447.

    [14] ASLAM A M,PATEL A N. Facial cutaneous squamous cell carcinoma[J]. BMJ,2016,352(1):1513-1517.

    [15] SINGH D,ATTRI B,GILL R,et al. Review on EGFR inhibitors:critical updates[J]. Mini Rev Med Chem,2016,16(14):1134-1166.

    [16] BASKAYNA G,KREUZER K,SCHWARZ M,et al. Squamous cutaneous epithelial cell carcinoma in two CML patients with progressive disease under imatinib treatment[J]. Eur J Haematol,2003,70(4):231-234.

    [17] URIBE P,GONZALEZ S. Epidermal growth factor receptor(EGFR)and squamous cell carcinoma of the skin:molecular bases for EGFR-targeted therapy[J]. Pathol Res Pract,2011,207(6):337-342.

    [18] 薛迪,劉宇超,賈永明,等.基于PI3K/Akt/GSK3信號通路的芥子酸抗Aβ1-42致PC12細(xì)胞損傷的機(jī)制研究[J].中國藥房,2020,31(20):519-523.

    [19] 趙思婷,王洋洋,陳玉甜,等. PI3K-Akt激動劑對INS-1細(xì)胞的作用及機(jī)制研究[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào),2019,13(17):223-229.

    (收稿日期:2020-10-13 修回日期:2021-02-01)

    (編輯:林 靜)

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