化痰活血方通過(guò)IL?13 信號(hào)通路對(duì)哮喘小鼠肺組織MUC5AC 分泌的影響

魏義杰毛曉健傅榕冰伍林澤胡旭紅童曉云黃 豐*

（1.騰沖市中醫(yī)醫(yī)院，云南 騰沖679100； 2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明650500； 3.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明650021）

支氣管哮喘是以氣道炎癥為代表的多種病理因素參與的慢性呼吸道疾病，最新報(bào)道顯示，我國(guó)患者已有4 750萬(wàn)［1］，因此，相關(guān)工作的推進(jìn)日益緊迫。正常人體也會(huì)分泌黏液，黏液作為固有免疫系統(tǒng)的第一道屏障，具有保護(hù)和濕潤(rùn)氣道的作用，然而在某些病理狀態(tài)下，氣道粘液分泌異常是哮喘病死率居高不下的重要原因［2?3］。因此，藥物有效的干預(yù)其生成有積極地臨床意義。

化痰活血方由三子養(yǎng)親湯加桃紅四物湯組成，本課題組前期研究顯示，該方可抑制哮喘小鼠肺泡灌洗液中多種炎性因子的生成，并且能明顯抑制與黏蛋白MUC5AC 生成密切相關(guān)的IL?13 的生成［4?6］。因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察化痰活血方調(diào)節(jié)哮喘小鼠肺組織IL?13／MUC5AC 通路中各分子的變化，探討其可能作用的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Balb／c 雌性小鼠，6 周齡，購(gòu)自長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)［SCXK（遼）2015?0001］。

1.2 儀器 超聲霧化儀（德國(guó)百瑞有限公司）；酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；RT?qPCR 儀（美國(guó)羅氏公司）；離心機(jī)（德國(guó)海蒂斯公司）。

1.3 試劑 OVA（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)A5253，Grade II）；Al（OH）3（上海阿拉丁生化科技有限公司，批號(hào)38701）；地塞米松（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)D1756）；抗MUC5AC 抗體（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號(hào)E?AB?40037）；抗IL?13 抗體（批號(hào)bs?0560R）、抗IL?4Rα 抗體（批號(hào)bs?23579R）、抗GAB2 抗體（批號(hào)bs?2885R）、抗Phospho?GAB2 抗體（批號(hào)bs?3177R）、抗FOXA2 抗體（批號(hào)bs?2358R）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；抗Phospho?IL?4Rα 抗體（批號(hào)PA5?38614）、抗Phospho?IL?13Rα1 抗體（批號(hào)PA5?38607）（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；抗IL?13Rα1抗體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)ab79277）；RNA 抽提液（武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)G3013）；cDNA 合成試劑盒（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)K1622）；熒光定量試劑盒（瑞士Roche 公司，批號(hào)04913914001）。

2 方法

2.1 分組、造模 小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松組及化痰活血方高、中、低劑量組，造模及各給藥組小鼠腹腔注射3 次OVA 以致敏 ［第1、8、15 天，OVA 1 mg／mL，Al（OH）35 mg／mL］，0.2 mL／只；正常組予同體積生理鹽水注射。3 周后，連續(xù)1 周（30 min／次）2%OVA 霧化，正常組小鼠給予同體積生理鹽水處理。

2.2 給藥 于第21 天開始灌胃給藥，連續(xù)7 d。正常組、模型組均給予生理鹽水（0.1 mL／10 g），陽(yáng)性藥物組給予地塞米松（1 mg／kg），化痰活血方高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)劑量化痰活血方（30、15、7.5 g／kg）。

2.3 取材 于實(shí)驗(yàn)第28 天處死小鼠，取右中肺，石蠟包埋備用。

2.4 免疫組化法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 取小鼠肺組織，分別加入“1.3”項(xiàng)下IL?13／MUC5AC 通路中各抗體，用圖像軟件進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)平均光密度值（IOD／Area）。

2.5 肺組織MUC5AC 基因定量分析 提取各小鼠肺組織Total RNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。引物分別為5′?GGACTTCAATATCCAGCTACGC?3′（正向）、5′?GGACT?TCAATATCCAGCTACGC?3′（反向），對(duì)照基因?yàn)镚APDH。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)肺組織中MUC5AC 表達(dá)的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中MUC5AC 的表達(dá)（P＜0.01），見圖1。

圖1 化痰活血方對(duì)MUC5AC 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.2 對(duì)肺組織中IL?13 表達(dá)的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可降低小鼠肺組織中IL?13 的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

圖2 化痰活血方對(duì)IL?13 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.3 對(duì)小鼠肺組織中IL?4Rα 表達(dá)的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可降低小鼠肺組織中IL?4Rα 的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

圖3 化痰活血方對(duì)IL?4Rα 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.4 對(duì)小鼠肺組織中P?IL?4Rα 表達(dá)的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中P?IL?4Rα 的表達(dá)（P＜0.01），見圖4。

圖4 化痰活血方對(duì)P?IL?4Rα 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.5 對(duì)小鼠肺組織中IL?13Rα1 表達(dá)的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中IL?13Rα1 的表達(dá)（P＜0.01），見圖5。

圖5 化痰活血方對(duì)IL?13Rα1 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.6 對(duì)小鼠肺組織中p?IL?13Rα1 表達(dá)的影響 化痰活血方高、中、低劑量組可降低小鼠肺組織中p?IL?13Rα1 的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），見圖6。

圖6 化痰活血方對(duì)p?IL?13Rα1 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.7 對(duì)小鼠肺組織中GAB2 表達(dá)的影響 化痰活血高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中GAB2 的表達(dá)（P＜0.01），見圖7。

圖7 化痰活血方對(duì)GAB2 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.8 對(duì)小鼠肺組織中p?GAB2 表達(dá)的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中p?GAB2 的表達(dá)（P＜0.01），見圖8。

圖8 化痰活血方對(duì)p?GAB2 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.9 對(duì)小鼠肺組織中FOXA2 表達(dá)的影響 化痰活血方高、中、低劑量組均可升高小鼠肺組織中MUC5AC 抑制子FOXA2 蛋白的表達(dá)（P＜0.01），見圖9。

圖9 化痰活血方對(duì)FOXA2 表達(dá)的影響（IHC×400）

3.10 各組小鼠肺組織MUC5AC基因的變化 化痰活血方高、中、低劑量組均可抑制小鼠肺組織中MUC5AC基因的表達(dá)（P＜0.01），見圖10。

圖10 化痰活血方對(duì)MUC5AC 基因表達(dá)的影響

4 討論

哮喘屬于中醫(yī)哮證范疇，《丹溪纂要·喘》 一書中提及“痰者凡喘，便有痰聲”，同時(shí)，臨床大量患者往往“久病入絡(luò)”。此外，痰瘀皆為津血化生，痰瘀常相互為患［4，7?8］。在此理論指導(dǎo)下，前期研究了化痰活血方防干預(yù)哮喘的多種機(jī)制，其可明顯抑制與黏蛋白生成密切相關(guān)的IL?13 上下游分子，為進(jìn)一步闡釋其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)從IL?13／MUC5AC通路入手，觀察化痰活血方對(duì)其中各個(gè)環(huán)節(jié)的作用。

MUC5AC 的異常分泌是哮喘患者臨床導(dǎo)致氣道阻塞的重要成分，并與哮喘氣道炎癥相關(guān)［9］。比如，IL?13 異常產(chǎn)生可導(dǎo)致氣道杯狀細(xì)胞化生（黏蛋白主要分泌細(xì)胞）［10］。Haj 等［11］人采用免疫組化檢測(cè)哮喘患者肺組織中MUC5AC和IL?13 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)較高。從圖1～2 中可知，經(jīng)化痰活血方干預(yù)后，MUC5AC 和IL?13 表達(dá)明顯下降，說(shuō)明化痰活血方能明顯抑制哮喘狀態(tài)下MUC5AC 的生成，其作用途徑可能與IL?13 通路相關(guān)，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)通路上的各蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。

IL?13R 是由IL?4Rα 和IL?13Rα1 鏈共同組成的異源二聚體［12?13］，本實(shí)驗(yàn)中采用免疫組化對(duì)哮喘小鼠肺組織中IL?13 受體IL?4Rα 和IL?13Rα1 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化痰活血方能夠顯著降低IL?4Rα 和IL?13Rα1 在哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)，說(shuō)明化痰活血方可以抑制二者的表達(dá)，可能存在抑制性成分抑制其受體（圖3、圖5）。同時(shí)，檢測(cè)了p?IL?4Rα 和p?IL?13Rα1（圖4、圖6），結(jié)果顯示，化痰活血方能明顯降低p?IL?4Rα 和p?IL?13Rα1 的表達(dá)。IL?13R 是氣道上皮細(xì)胞膜表面受體，在各種因子的刺激下，可激活并上調(diào)MUC5AC［14］?；祷钛侥芤种艻L?13R的各蛋白磷酸及非磷酸化蛋白的表達(dá)，說(shuō)明化痰活血方對(duì)杯狀細(xì)胞該通路的上游分子可能有抑制作用，繼而抑制MUC5AC 的分泌。

近年相關(guān)研究顯示，GAB2 的表達(dá)與MUC5AC 的分泌呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系［15］。在炎癥因子的刺激下，IL?4Rα 與IL?13Rα1 可活化并形成異二聚體，接著活化絡(luò)氨酸蛋白激酶TYK2，進(jìn)一步導(dǎo)致STAT6 磷酸化，然后下調(diào)MUC5AC 基因負(fù)反饋因子FOXA2 基因，從而上調(diào)MUC5AC 的基因表達(dá)［16?18］。哮喘氣道黏液分泌過(guò)程調(diào)節(jié)中，F(xiàn)OXA2 直接作用于氣道上皮細(xì)胞抑制MUC5AC 基因的轉(zhuǎn)錄，是多條調(diào)節(jié)黏液分泌信號(hào)通路的匯合點(diǎn)［19?20］。免疫組化法對(duì)哮喘小鼠GAB2、P?GAB2、FOXA2 蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，化痰活血方能顯著降低哮喘小鼠肺組織中GAB2、p?GAB2 的表達(dá)（圖7～8），升高FOXA2 水平（圖9）。采用熒光定量PCR 結(jié)果顯示，化痰活血方能從基因水平抑制MUC5AC的表達(dá)（圖10）。

綜上所述，化痰活血方高劑量對(duì)IL?13 信號(hào)通路各蛋白及黏蛋白MUC5AC 的調(diào)控作用較強(qiáng)，中劑量次之，低劑量較次之，存在一定的濃度依賴性?；祷钛娇赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)IL?13 信號(hào)通路來(lái)下調(diào)黏蛋白MUC5AC基因表達(dá)，繼而減少哮喘小鼠的黏液分泌情況，從而達(dá)到改善哮喘肺部病理情況。但化痰活血方針對(duì)IL?13 信號(hào)通路干預(yù)MUC5AC生成的機(jī)制研究需進(jìn)一步深入研究，比如要借助基因干擾技術(shù)進(jìn)一步明確其作用的特異靶點(diǎn)。