HPLC?MS／MS 法分析中華常春藤與洋常春藤化學(xué)成分

倪力軍諸葛 敏高麗麗胡江寧金漢臺(tái)金志文

（1.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海200237； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京100050；3.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水323400）

中華常春藤Hedera nepalensisvarK.Koch var.sinensis（Tobl.）Rehder 和洋常春藤Hedera helixL 為五加科常春藤屬的2 個(gè)亞種，兩者在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布。中華常春藤藥用價(jià)值被許多中藥典籍記載［1］，功能主治祛風(fēng)利濕、活血化瘀、平肝、解毒，可用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)急性結(jié)膜炎等病癥。洋常春藤原產(chǎn)于歐洲和北非［2］，已被列入歐洲藥典［3］，其乙醇提取物具有止咳解痙、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等作用［4?5］，但國(guó)內(nèi)對(duì)其藥用研究較少。文獻(xiàn)記載表明中華常春藤和洋常春藤的臨床適應(yīng)癥不同。對(duì)比研究?jī)烧呋瘜W(xué)成分的異同對(duì)于開發(fā)以常春藤為原料的植物新藥具有重要意義。

常春藤屬植物主要含五環(huán)三萜皂苷、黃酮類、多酚類和有機(jī)酸等成分。Kanwal 等［6］、Saleem 等［7］、Jafri 等［8］研究中華常春藤時(shí)分別使用甲醇、正己烷、乙酸乙酯、水進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)各相提取物中主要含有黃酮、固醇、三萜皂苷和強(qiáng)心苷類成分。洋常春藤中被研究最多、生物活性較好的成分主要為三萜皂苷類（占比2.5%～6%）［5］，洋常春藤還含有其他成分［9］，如黃酮類、酚酸類、花色苷類、香豆素類、生物堿、揮發(fā)油、維他命、碳水化合物。但對(duì)比中華常春藤和洋常春藤化學(xué)成分的研究尚未見報(bào)道。本研究使用HPLC?MS／MS 對(duì)2 種常春藤中化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別和對(duì)比分析，從成分種類和化學(xué)結(jié)構(gòu)層面上了解其化學(xué)成分的異同。

1 材料與方法

1.1 儀器 XSE105DU 電子天平［十萬分之一，梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；Mili?Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；Thermo UltiMate 3000 高效液相色譜儀、Thermo Q?Exactive Plus MS／MS 質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；DS?3510 DTH 超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；甲酸（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；超純水采用純水儀自制。對(duì)照品隱綠原酸（色譜純，上海柏卡化學(xué)技術(shù)有限公司）；常春藤皂苷C（色譜純，浙江康恩貝制藥股份有限公司）；α?常春藤皂苷、秦皮甲素（色譜純，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；綠原酸、蘆丁、煙花苷、常春藤皂苷B、常春藤皂苷D（色譜純，南京春秋生物工程有限公司）。

洋常春藤干燥葉批號(hào)為HZ170402，于2017 年4 月1日采摘于浙江杭州市；中華常春藤干燥葉批號(hào)為ZH180423，于2018 年4 月23 日采摘于浙江省松陽縣，均由浙江康恩貝中藥有限公司提供，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所陳士林教授鑒定為五加科常春藤屬洋常春藤Hedera helixL.、中華常春藤Hedera nepalensisvarK.Koch var.sinensis（Tobl.）Rehder。

1.3 供試品溶液制備 精密稱量洋常春藤、中華常春藤干燥葉（40 目）0.5 g，以料液比1 ∶100 加入80% 甲醇，80 ℃水浴回流提取1 h，補(bǔ)足減失質(zhì)量，過0.22 μm 微孔有機(jī)相濾膜，取續(xù)濾液，即得。

1.4 對(duì)照品溶液制備 精密稱定各對(duì)照品適量于量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放冷，甲醇定容至刻度，即得。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜 Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相0.05% 甲酸（A）?甲醇（B），梯度洗脫（0～1.5 min，5% B；1.5～5 min，5%～20% B；5～15 min，20%～40%B；15～30 min，40%～70%B；30～34 min，70%～90%B；34～37 min，90%B；37～40 min，90%～5%B）；體積流量0.3 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；進(jìn)樣量2 μL。

1.5.2 質(zhì)譜 采用電噴霧離子化源（ESI）；正負(fù)離子模式檢測(cè)；Full MS 一級(jí)掃描，分辨率70 000；dd?MS2模式二級(jí)掃描，分辨率17 500；鞘氣體積流量45 μL／min；噴霧電壓3.50 kV；輔助氣體積流量15 μL／min；輔助氣溫度250 ℃；毛細(xì)管溫度375 ℃；質(zhì)量掃描范圍m／z150～2 000。

2 結(jié)果

洋常春藤和中華常春藤的正、負(fù)總離子流圖見圖1～2，正離子模式相對(duì)負(fù)離子模式出峰更多且信號(hào)更強(qiáng)，故解析化學(xué)成分以正離子模式信息為主。正離子模式下，共從2種常春藤中鑒定或推斷出48 種成分，見表1，可大致將其分為有機(jī)酸、黃酮苷、皂苷3 個(gè)結(jié)構(gòu)大類；負(fù)離子模式下，補(bǔ)充推斷出5 種成分，見表2。解析時(shí)使用Xcalibur 軟件打開數(shù)據(jù)文件，由一級(jí)譜數(shù)據(jù)獲得準(zhǔn)分子離子峰，隨后將準(zhǔn)分子離子峰二級(jí)譜的碎片信息與文獻(xiàn)［6?17］、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站對(duì)比進(jìn)行深入鑒定。

圖1 正離子模式下中華常春藤、洋常春藤總離子流圖

表1 正離子模式下洋常春藤、中華常春藤葉中化學(xué)成分

表2 負(fù)離子模式下洋常春藤、中華常春藤葉中化學(xué)成分

一般來說，中藥中的類似成分通常具有相似的結(jié)構(gòu)，特征化合物通過連接不同的化學(xué)基團(tuán)，包括羥基、甲氧基、乙?；?、甲基以及與糖基脫水縮合形成新的化合物［10］。糖基通常為葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸。

圖2 負(fù)離子模式下中華常春藤、洋常春藤總離子流圖

2.1 有機(jī)酸類化合物鑒定 液質(zhì)分析表明，2 種常春藤中均含有綠原酸異構(gòu)體，它是由咖啡酸和奎尼酸縮合而成的一種酯類化合物［14］，因其縮合位置不同有多種同分異構(gòu)體。綠原酸類化合物有3 個(gè)保留時(shí)間，分別為6.78、7.44、7.70 min，一級(jí)碎片信息有m／z355.102 4 ［M＋H］＋、m／z377.084 1 ［M＋Na］＋、353.087 4 ［M?H］－，正離子模式二級(jí)碎片信息m／z193.049 4、m／z163.038 8 分別是［M ＋H］＋脫去咖啡酸、奎尼酸的碎片。結(jié)合參考文獻(xiàn)［11］ 并根據(jù)分子空間對(duì)稱結(jié)構(gòu)判斷極性大小為新綠原酸＞綠原酸＞隱綠原酸，并由對(duì)照品比對(duì)出綠原酸和隱綠原酸的出峰時(shí)間為7.40、7.80 min，所以保留時(shí)間為6.78 min 的峰為新綠原酸。3 種綠原酸裂解途徑類似，以綠原酸為例，其正離子模式下可能的碎裂途徑見圖3。

圖3 正離子模式下綠原酸的質(zhì)譜圖及可能裂解途徑

中華常春藤在tR為14.84、15.69 min 處檢測(cè)到一級(jí)碎片信息為m／z517.134 0 ［M ＋H］＋、m／z539.115 7 ［M ＋Na］＋、m／z515.118 7 ［M?H］－，洋常春藤中未檢出該成分，推測(cè)其為一分子咖啡酸與兩分子奎尼酸縮合位置不同形成同分異構(gòu)體，可能成分有1，5?dicaffeoylquinic acid、3，4?dicaffeoylquinic acid、3，5? dicaffeoylquinic acid 和4，5?di?caffeoylquinic acid［16］。

2.2 黃酮苷類化合物鑒定 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán)，還常與糖結(jié)合成苷，此類化合物在碎裂時(shí)會(huì)丟失糖基碎片［10］。液質(zhì)結(jié)果表明，常春藤中黃酮苷類化合物有蘆丁、煙花苷、阿福豆苷。蘆丁為槲皮素與一分子鼠李糖和一分子葡萄糖脫水縮合形成，一級(jí)碎片信息有m／z611.160 9 ［M ＋H］＋、m／z633.142 1 ［M＋Na］＋、m／z609.145 3 ［M?H］－，正離子模式二級(jí)碎片信息m／z465.102 4 為［M＋H］＋脫去一分子鼠李糖 基（m／z146.058 5）、m／z303.049 5 為 ［M?鼠 李糖＋H］＋進(jìn)一步脫去一分子葡萄糖基（m／z162.052 6）。以蘆丁為例，給出了黃酮苷類成分丟失糖基碎片的可能裂解途徑，見圖4。

圖4 正離子模式下蘆丁的質(zhì)譜圖及可能碎裂途徑

煙花苷（tR17.37 min）為一分子山柰酚與一分子鼠李糖和一分子葡萄糖脫水縮合形成，一級(jí)碎片信息有m／z595.165 7 ［M ＋H］＋、m／z617.147 5 ［M ＋Na］＋、m／z593.149 5 ［M?H］－，二級(jí)碎片信息m／z449.107 5、m／z287.054 7 分別為［M?鼠李糖＋H］＋、［M?鼠李糖?葡萄糖＋H］＋。阿福豆苷（tR8.42 min）為一分子山柰酚和一分子鼠李糖脫水縮合形成，一級(jí)碎片信息有m／z433.134 1 ［M＋H］＋、m／z455.115 9 ［M＋Na］＋、m／z431.118 3 ［M?H］－。

2.3 皂苷類化合物鑒定 皂苷類化合物主要以常春藤皂苷元、齊墩果酸為母核，連接糖鏈而成。其中含量較高、活性較強(qiáng)的皂苷為常春藤皂苷C 和α?常春藤皂苷［5］。對(duì)照品對(duì)比，鑒定tR為27.84 min 的峰為常春藤皂苷C，其由一分子hederagenin、兩分子鼠李糖、一分子阿拉伯糖和兩分子葡萄糖縮合而成，一級(jí)碎片信息有m／z1 221.626 8 ［M＋H］＋、m／z1 243.606 8 ［M ＋Na］＋、m／z121 9.606 8 ［M?H］－、m／z1 265.613 0 ［M＋HCOO］－，正離子模式下常春藤皂苷C 碎片過于破碎，不利于解析，故用負(fù)離子模式下的信息進(jìn)行解釋。負(fù)離子模式下其二級(jí)碎片信息m／z1 073.549 8、749.446 0 分別對(duì)應(yīng)［M?鼠李糖?H］－、［M?鼠李糖?2 葡萄糖?H］－，常春藤皂苷C 可能的碎裂途徑見圖5。

圖5 負(fù)離子模式下常春藤皂苷C 的質(zhì)譜圖及可能碎裂途徑

與α?常春藤皂苷對(duì)照品比對(duì)，鑒定tR34.12 min 的峰為α?常春藤皂苷，由一分子hederagenin、一分子鼠李糖和一分子阿拉伯糖縮合而成，一級(jí)碎片信息有m／z751.462 5［M ＋H］＋、m／z773.444 5 ［M ＋Na］＋、m／z749.446 9［M?H］－，二級(jí)碎片信息有m／z619.419 8、473.362 3、455.351 4、437.340 9、409.346 1 分別對(duì)應(yīng)［M?阿拉伯糖＋H］＋、［hed?eragenin ＋H］＋、［hederagenin?H2O ＋H］＋、［hederagenin?2H2O＋H］＋、［hederagenin?2H2O?CO＋H］＋。

2.4 成分對(duì)比 結(jié)果表明，中華常春藤和洋常春藤在所含化學(xué)成分上有許多共同特征，成分結(jié)構(gòu)也基本相同，51 組峰中共有峰有39 組。中華常春藤中有二咖啡?？崴帷⑴_(tái)灣常春藤XII 等16 種洋常春藤中沒有的成分；洋常春藤中有新綠原酸、常春藤皂苷D 等6 種中華常春藤中沒有的成分。

信號(hào)較強(qiáng)成分，如蘆丁、煙花苷、常春藤皂苷C、α?常春藤皂苷等成分在中華常春藤和洋常春藤中均有分布，且這幾種成分為常春藤主要活性成分，表明這2 種常春藤主要成分相同，特異性分布成分多為含量較低組分。根據(jù)液質(zhì)分析比較，推測(cè)2 種常春藤的主要活性成分含量不同、各自獨(dú)有的成分與其他化合物的協(xié)同作用，可能是2 種藥材體現(xiàn)出不同臨床作用的原因。

3 討論

植物學(xué)上主要是依據(jù)葉片外觀形貌和其顯微圖像的絨毛特征區(qū)分中華常春藤和洋常春藤。本研究較為系統(tǒng)地定性分析、比較了中華常春藤和洋常春藤葉中的化學(xué)成分，結(jié)果表明2 種常春藤中的大類化學(xué)成分相同。由于對(duì)照品的稀缺，一些同分異構(gòu)體成分還需要通過核磁等方法進(jìn)一步研究來佐證。但中華常春藤所含化學(xué)成分相對(duì)較多，表明中華常春藤和洋常春藤存在差異。由于本研究分析樣品有限，進(jìn)一步可收集更多樣品，借鑒文獻(xiàn)［18］ 的做法，對(duì)2 種常春藤進(jìn)行近紅外光譜及HPLC 指紋圖譜分析，采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法根據(jù)分子光譜提供的整體信息進(jìn)行2種藥材的快速區(qū)分與鑒別；根據(jù)指紋圖譜間進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，根據(jù)主要組分含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較其共有成分含量的差異。