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    基于UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術(shù)快速分析杜仲抗補(bǔ)體活性部位的入血成分

    2021-06-15 14:08:16颯賈佳溫泉何明珍閩馮育林楊世林
    中成藥 2021年4期
    關(guān)鍵詞:杜仲正丁醇補(bǔ)體

    郭 颯賈 佳溫 泉何明珍*姚 閩馮育林楊世林

    (1.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌330006; 2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院,江西 南昌330006)

    補(bǔ)體在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,其激活主要通過經(jīng)典和旁路兩條途徑。補(bǔ)體過度激活會導(dǎo)致人體正常的組織產(chǎn)生損傷,在許多疾病的發(fā)病過程中扮演著重要角色,如急性肺損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[1]。目前,對于補(bǔ)體的抑制已成為治療諸多疾病的首要關(guān)注點(diǎn)。據(jù)報(bào)道,中藥材中的諸多成分,如黃酮、多糖、甾體等[2]均具有較好的抗補(bǔ)體活性。

    杜仲Eucommia ulmoidesOliv.,為杜仲科植物,為名貴的中藥材,主要分布于陜西、甘肅、河南、湖北、江西、安徽等省區(qū)[3]?,F(xiàn)代研究表明,杜仲的主要成分包括黃酮、苯丙素、木脂素等,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有降血壓、降血糖、保肝、抗炎等活性[4]。同時,現(xiàn)代研究表明,抗炎活性與抗補(bǔ)體活性息息相關(guān)[5],然而杜仲的抗補(bǔ)體活性研究卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先對杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位進(jìn)行補(bǔ)體抑制活性檢測,結(jié)果顯示乙酸乙酯與正丁醇部位均具有較好的抗補(bǔ)體活性;其次,在前期實(shí)驗(yàn)中課題組對乙酸乙酯部位和正丁醇部位的成分進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)2 個部位有相交的部分,只是含量不同,因此,基于UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術(shù),對相交部分含量較高的正丁醇部位的入血成分進(jìn)行研究,并快速鑒別了體內(nèi)12 種原型入血成分,以期為杜仲的進(jìn)一步利用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司);Triple TOFTM5600+高分辨質(zhì)譜儀(美國Sciex 公司);Analyst TF 1.6 和peakview 1.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Sciex公司);LC?30A 超高液相色譜儀(日本島津公司),配置LC?30AD 高壓輸液泵、CBM?20A 系統(tǒng)控制器、SIL?30AC 自動進(jìn)樣器(美國Molecular Devices 公司);Sartorious BT25S型分析天平(十萬分之一,德國賽多利斯公司);N?1001D?OSB2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(南京泰諾施格科學(xué)儀器有限公司);KQ250DB 型數(shù)控超聲清洗器(鞏義市予華儀器有限公司)。

    京尼平苷(批號J?028?161216)、京尼平(批號10080?201409)、異綠原酸C(批號PRF8060542)對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司。水(廣東屈臣氏食品飲料有限公司);巴比妥緩沖液(pH 7.4,北京雷根生物技術(shù)有限公司);肝素鈉和綿羊血(北京索萊寶科技有限公司);溶血素(上海延慕有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國Fisher 公司);甲酸(色譜純,美國Sigma 公司);其余試劑為分析純。

    杜仲采自江西吉水縣,經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院高級工程師姚閩鑒定為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥樹皮。

    2 方法

    2.1 藥材提取 取杜仲藥材500 g,粉碎后用80%乙醇加熱回流提取2 次,每次1 h,分別依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取,減壓回收溶劑后,即得相應(yīng)部位萃取物,減壓干燥,備用。

    2.2 補(bǔ)體經(jīng)典途徑CH50測定

    2.2.1 供試品溶液制備 稱取杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物適量。依次用30 μL DMSO、770 μL BBS 溶液超聲溶解。用BBS 溶液對倍稀釋成8 個濃度的供試品溶液(1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256)。

    2.2.2 補(bǔ)體的效價測定 參考文獻(xiàn)[6],取一定的豚鼠血清(補(bǔ)體),制備成1 ∶2 的溶液,并對倍稀釋成1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 溶液。取1 ∶3 000溶血素100 μL、上述各濃度補(bǔ)體200 μL 和2%SRBC 溶液100 μL,溶于200 μL BBS 溶液中,混勻,置于37 ℃水浴溫育30 min,離心后取上清在405 nm 處測定吸光度(A)。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn),選擇達(dá)到相似吸光度的最低補(bǔ)體濃度作為正常溶血所需要的臨界補(bǔ)體濃度。

    2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測定 吸取“2.2.2”項(xiàng)下確定的臨界補(bǔ)體濃度與供試品溶液,分別加入100 μL 溶血素和2% SRBC 溶液,于37 ℃水浴反應(yīng)30 min,離心,取上清液,405 nm 處測定吸光度(A)。

    2.3 液相條件 參考文獻(xiàn)[7],Welch Ultimate XB?C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相0.1% 甲酸(A)?乙腈(B),梯度洗脫(0.01~4 min,5% B;4~10 min,5%~10% B;10~25 min,10%~13% B;25~37 min,13%~27% B;37~45 min,2%~90% B;45~49 min,90%B;49~50 min,90%~5%B;50~56 min,5%B);柱溫40 ℃;體積流量0.3 mL/min;進(jìn)樣量2 μL。

    2.4 質(zhì)譜條件 在負(fù)離子模式下采用電噴霧電離源(ESI);噴霧電壓(ISVF)-4 500 V;霧化器(GS1)和輔助器(GS2)均為50 psi(1 psi=6.895 kPa);質(zhì)量掃描范圍為m/z50~1 250;數(shù)據(jù)采集時間為56 min;采用母離子觸發(fā)的子離子(TOF?MS?IDA?MS/MS)掃描方式;碰撞能量(CE)-35 eV;碰撞能量疊加(CES)15 eV。

    2.5 生物樣品采集 取SD 大鼠7 只,隨機(jī)分為杜仲給藥組(5 只)和正常組(2 只),杜仲給藥組給藥劑量為12 g/kg,空白組按12 g/kg 劑量給予生理鹽水。分別于給藥后0.5、1、2、4、6 h 對各組大鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢取血約300 μL,離心,取上清,保存于-40 ℃冰箱中備用。

    2.6 生物樣品處理 取0.5、1、2、4、6 h 待測血漿各30 μL 混合于4 mL 離心管中,加入50 μL 甲酸,再加入5倍量甲醇沉淀蛋白,渦旋,離心,取上清液,氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇100 μL 復(fù)溶,渦旋,離心,取2 μL 上清液進(jìn)行UHPLC?Q?TOF?MS/MS 分析。

    3 結(jié)果

    3.1 經(jīng)典途徑補(bǔ)體效價測定 將補(bǔ)體用BBS 溶液對倍稀釋成8 個濃度后加到溶血體系中,用于評價其效價,見圖1。當(dāng)稀釋度為1 ∶2~1 ∶32 時,溶血率為100%,顯示達(dá)到全溶血狀態(tài);當(dāng)補(bǔ)體稀釋度為1 ∶64 時,全溶血率為(68.49±6.1)%,未引起全溶血,表明個體之間有一定的差異性。因此,稀釋度為1 ∶32 的豚鼠血清作為經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)中所使用的補(bǔ)體濃度。

    圖1 經(jīng)典途徑不同稀釋度豚鼠血清的效價(%,,n=3)

    3.2 抗補(bǔ)體活性部位確定 以肝素鈉為陽性對照藥[CH50為(0.028±0.006)mg/mL],分別對杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物進(jìn)行經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體抑制活性測試,得到乙酸乙酯和正丁醇部位萃取物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性CH50值分別為0.072、0.049 mg/mL,石油醚和水部位萃取物無活性。結(jié)果見圖2。

    圖2 杜仲各部位抗補(bǔ)體活性

    3.3 入血成分 采用UHPLC?Q?TOF?MS/MS 技術(shù)對大鼠血漿進(jìn)行入血成分分析,通過與對照品進(jìn)行對比,綜合對照品的保留時間及質(zhì)譜信息,對本實(shí)驗(yàn)所得圖譜進(jìn)行篩查和鑒定。在大鼠空白血漿中未出現(xiàn)而在大鼠給藥血漿和杜仲正丁醇部位萃取物中相對應(yīng)位置共同存在的色譜峰,即為杜仲正丁醇部位萃取物原型吸收入血成分,通過此方法共鑒定出12 種原型入血成分。見圖3、表1。

    表1 杜仲正丁醇部位萃取物原型入血成分鑒定

    圖3 各樣品總離子流圖

    3.4 入血成分解析 化合物1 為檸檬酸,一級質(zhì)譜保留時間在1.32 min 時,出現(xiàn)m/z為173.008 9 的峰,推測為[M?H2O]-的峰,以其作為母離子進(jìn)行全掃描,產(chǎn)生2 個主要的碎片離子,碎片m/z129.019 1 為母離子失去一個CO2分子的[M?CO2]-峰,碎片m/z111.009 4 為母離子失去一個H2O 分子和CO2分子的[M?CO2?H2O]-峰,經(jīng)對照品對照,鑒定為檸檬酸,其分子式C6H8O7,為有機(jī)酸類。

    化合物2 為4?glucopyranosyloxy?3?benzoic acid,一級質(zhì)譜保留時間為3.32,PeakView 中XIC Manager 軟件推測其分子式C14H18O9,該化合物二級質(zhì)譜中,產(chǎn)生碎片離子m/z167.034 4、152.010 8、123.044 5、108.021 5 母離子丟失162 Da 后得到167.034 4 碎片離子,可能含有香草醛結(jié)構(gòu)。因此,推測該化合物為4?glucopyranosyloxy?3?benzoic acid。

    化合物3 為京尼平苷,一級質(zhì)譜保留時間在3.69 min時,出現(xiàn)m/z為211.061 2 的峰,推測為[M?Glu]-的峰,以其作為母離子進(jìn)行全掃描,產(chǎn)生了2 個主要的碎片離子,分別為碎片m/z193.050 4 為母離子失去一個水分子[M?H2O]-峰和碎片m/z167.071 5 為母離子失去一個甲基分子的[M?CO2]-峰,經(jīng)對照品對照,鑒定為京尼平苷,分子式C16H22O10,為環(huán)烯醚萜類。

    化合物4 為京尼平,一級質(zhì)譜保留時間在15.33 min時,出現(xiàn)m/z為207.066 1 的峰,推測為[M?H2O]-的峰,以其作為母離子進(jìn)行全掃描,產(chǎn)生2 個主要的碎片離子,碎片m/z177.054 7 為母離子失去一個甲氧基分子的[M?CH3O]-峰,經(jīng)對照品對照,鑒定為京尼平,分子式C11H14O5,為環(huán)烯醚萜苷類。

    化合物5 為異綠原酸C,一級質(zhì)譜保留時間在33.14 min時,出現(xiàn)m/z為353.088 0 的峰,推測為 [M?Glu]-的峰,以其作為母離子進(jìn)行全掃描,產(chǎn)生了1 個主要的碎片離子,即為碎片m/z353.088 0 為母離子失去一個葡萄糖分子的[M?Glu]-峰,經(jīng)對照品對照,鑒定為異綠原酸C,分子式C25H24O12,為苯丙素類。

    4 討論

    杜仲是我國傳承千年的名貴藥材,其用途廣泛,被稱為“植物黃金”[8]。本實(shí)驗(yàn)通過抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑研究了杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物的抗補(bǔ)體活性,結(jié)果表明,杜仲石油醚和水部位萃取物無明顯抗補(bǔ)體活性,而正丁醇部位萃取物的抗補(bǔ)體活性最好,為杜仲的最佳抗補(bǔ)體活性部位。

    UHPLC?Q?TOF?MS/MS 具有分 析快速、分辨率 高、靈敏度好、重復(fù)性好等特點(diǎn),是天然產(chǎn)物鑒定復(fù)雜成分的有力手段[9?10]。本實(shí)驗(yàn)采用此分析技術(shù)對杜仲入血成分進(jìn)行研究,共鑒定出12 種原型入血成分。根據(jù)入血成分可能是中藥的有效活性成分[11]這一觀點(diǎn),結(jié)合參考文獻(xiàn)[12?13] 分析推測其可能為潛在的抗補(bǔ)體活性成分。

    本實(shí)驗(yàn)從抗補(bǔ)體活性與入血成分兩方面對杜仲進(jìn)行研究,以期有助于拓寬對杜仲藥用功效的認(rèn)知,同時也為進(jìn)一步討論杜仲的藥效活性提供參考。

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