基于UHPLC?Q?TOF?MS／MS 技術(shù)快速分析杜仲抗補(bǔ)體活性部位的入血成分

郭 颯賈 佳溫 泉何明珍*姚 閩馮育林楊世林

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330006； 2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，江西 南昌330006）

補(bǔ)體在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，其激活主要通過經(jīng)典和旁路兩條途徑。補(bǔ)體過度激活會導(dǎo)致人體正常的組織產(chǎn)生損傷，在許多疾病的發(fā)病過程中扮演著重要角色，如急性肺損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等［1］。目前，對于補(bǔ)體的抑制已成為治療諸多疾病的首要關(guān)注點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，中藥材中的諸多成分，如黃酮、多糖、甾體等［2］均具有較好的抗補(bǔ)體活性。

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.，為杜仲科植物，為名貴的中藥材，主要分布于陜西、甘肅、河南、湖北、江西、安徽等省區(qū)［3］?，F(xiàn)代研究表明，杜仲的主要成分包括黃酮、苯丙素、木脂素等，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有降血壓、降血糖、保肝、抗炎等活性［4］。同時，現(xiàn)代研究表明，抗炎活性與抗補(bǔ)體活性息息相關(guān)［5］，然而杜仲的抗補(bǔ)體活性研究卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先對杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位進(jìn)行補(bǔ)體抑制活性檢測，結(jié)果顯示乙酸乙酯與正丁醇部位均具有較好的抗補(bǔ)體活性；其次，在前期實(shí)驗(yàn)中課題組對乙酸乙酯部位和正丁醇部位的成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)2 個部位有相交的部分，只是含量不同，因此，基于UHPLC?Q?TOF?MS／MS 技術(shù)，對相交部分含量較高的正丁醇部位的入血成分進(jìn)行研究，并快速鑒別了體內(nèi)12 種原型入血成分，以期為杜仲的進(jìn)一步利用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；Triple TOFTM5600＋高分辨質(zhì)譜儀（美國Sciex 公司）；Analyst TF 1.6 和peakview 1.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Sciex公司）；LC?30A 超高液相色譜儀（日本島津公司），配置LC?30AD 高壓輸液泵、CBM?20A 系統(tǒng)控制器、SIL?30AC 自動進(jìn)樣器（美國Molecular Devices 公司）；Sartorious BT25S型分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；N?1001D?OSB2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（南京泰諾施格科學(xué)儀器有限公司）；KQ250DB 型數(shù)控超聲清洗器（鞏義市予華儀器有限公司）。

京尼平苷（批號J?028?161216）、京尼平（批號10080?201409）、異綠原酸C（批號PRF8060542）對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司。水（廣東屈臣氏食品飲料有限公司）；巴比妥緩沖液（pH 7.4，北京雷根生物技術(shù)有限公司）；肝素鈉和綿羊血（北京索萊寶科技有限公司）；溶血素（上海延慕有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma 公司）；其余試劑為分析純。

杜仲采自江西吉水縣，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院高級工程師姚閩鑒定為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥樹皮。

2 方法

2.1 藥材提取 取杜仲藥材500 g，粉碎后用80%乙醇加熱回流提取2 次，每次1 h，分別依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，減壓回收溶劑后，即得相應(yīng)部位萃取物，減壓干燥，備用。

2.2 補(bǔ)體經(jīng)典途徑CH50測定

2.2.1 供試品溶液制備 稱取杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物適量。依次用30 μL DMSO、770 μL BBS 溶液超聲溶解。用BBS 溶液對倍稀釋成8 個濃度的供試品溶液（1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256）。

2.2.2 補(bǔ)體的效價測定 參考文獻(xiàn)［6］，取一定的豚鼠血清（補(bǔ)體），制備成1 ∶2 的溶液，并對倍稀釋成1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 溶液。取1 ∶3 000溶血素100 μL、上述各濃度補(bǔ)體200 μL 和2%SRBC 溶液100 μL，溶于200 μL BBS 溶液中，混勻，置于37 ℃水浴溫育30 min，離心后取上清在405 nm 處測定吸光度（A）。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，選擇達(dá)到相似吸光度的最低補(bǔ)體濃度作為正常溶血所需要的臨界補(bǔ)體濃度。

2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測定 吸取“2.2.2”項(xiàng)下確定的臨界補(bǔ)體濃度與供試品溶液，分別加入100 μL 溶血素和2% SRBC 溶液，于37 ℃水浴反應(yīng)30 min，離心，取上清液，405 nm 處測定吸光度（A）。

2.3 液相條件 參考文獻(xiàn)［7］，Welch Ultimate XB?C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0.01～4 min，5% B；4～10 min，5%～10% B；10～25 min，10%～13% B；25～37 min，13%～27% B；37～45 min，2%～90% B；45～49 min，90%B；49～50 min，90%～5%B；50～56 min，5%B）；柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL／min；進(jìn)樣量2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 在負(fù)離子模式下采用電噴霧電離源（ESI）；噴霧電壓（ISVF）－4 500 V；霧化器（GS1）和輔助器（GS2）均為50 psi（1 psi＝6.895 kPa）；質(zhì)量掃描范圍為m／z50～1 250；數(shù)據(jù)采集時間為56 min；采用母離子觸發(fā)的子離子（TOF?MS?IDA?MS／MS）掃描方式；碰撞能量（CE）－35 eV；碰撞能量疊加（CES）15 eV。

2.5 生物樣品采集 取SD 大鼠7 只，隨機(jī)分為杜仲給藥組（5 只）和正常組（2 只），杜仲給藥組給藥劑量為12 g／kg，空白組按12 g／kg 劑量給予生理鹽水。分別于給藥后0.5、1、2、4、6 h 對各組大鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢取血約300 μL，離心，取上清，保存于－40 ℃冰箱中備用。

2.6 生物樣品處理 取0.5、1、2、4、6 h 待測血漿各30 μL 混合于4 mL 離心管中，加入50 μL 甲酸，再加入5倍量甲醇沉淀蛋白，渦旋，離心，取上清液，氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇100 μL 復(fù)溶，渦旋，離心，取2 μL 上清液進(jìn)行UHPLC?Q?TOF?MS／MS 分析。

3 結(jié)果

3.1 經(jīng)典途徑補(bǔ)體效價測定 將補(bǔ)體用BBS 溶液對倍稀釋成8 個濃度后加到溶血體系中，用于評價其效價，見圖1。當(dāng)稀釋度為1 ∶2～1 ∶32 時，溶血率為100%，顯示達(dá)到全溶血狀態(tài)；當(dāng)補(bǔ)體稀釋度為1 ∶64 時，全溶血率為（68.49±6.1）%，未引起全溶血，表明個體之間有一定的差異性。因此，稀釋度為1 ∶32 的豚鼠血清作為經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)中所使用的補(bǔ)體濃度。

圖1 經(jīng)典途徑不同稀釋度豚鼠血清的效價（%，，n＝3）

3.2 抗補(bǔ)體活性部位確定 以肝素鈉為陽性對照藥［CH50為（0.028±0.006）mg／mL］，分別對杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物進(jìn)行經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體抑制活性測試，得到乙酸乙酯和正丁醇部位萃取物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性CH50值分別為0.072、0.049 mg／mL，石油醚和水部位萃取物無活性。結(jié)果見圖2。

圖2 杜仲各部位抗補(bǔ)體活性

3.3 入血成分 采用UHPLC?Q?TOF?MS／MS 技術(shù)對大鼠血漿進(jìn)行入血成分分析，通過與對照品進(jìn)行對比，綜合對照品的保留時間及質(zhì)譜信息，對本實(shí)驗(yàn)所得圖譜進(jìn)行篩查和鑒定。在大鼠空白血漿中未出現(xiàn)而在大鼠給藥血漿和杜仲正丁醇部位萃取物中相對應(yīng)位置共同存在的色譜峰，即為杜仲正丁醇部位萃取物原型吸收入血成分，通過此方法共鑒定出12 種原型入血成分。見圖3、表1。

表1 杜仲正丁醇部位萃取物原型入血成分鑒定

圖3 各樣品總離子流圖

3.4 入血成分解析 化合物1 為檸檬酸，一級質(zhì)譜保留時間在1.32 min 時，出現(xiàn)m／z為173.008 9 的峰，推測為［M?H2O］－的峰，以其作為母離子進(jìn)行全掃描，產(chǎn)生2 個主要的碎片離子，碎片m／z129.019 1 為母離子失去一個CO2分子的［M?CO2］－峰，碎片m／z111.009 4 為母離子失去一個H2O 分子和CO2分子的［M?CO2?H2O］－峰，經(jīng)對照品對照，鑒定為檸檬酸，其分子式C6H8O7，為有機(jī)酸類。

化合物2 為4?glucopyranosyloxy?3?benzoic acid，一級質(zhì)譜保留時間為3.32，PeakView 中XIC Manager 軟件推測其分子式C14H18O9，該化合物二級質(zhì)譜中，產(chǎn)生碎片離子m／z167.034 4、152.010 8、123.044 5、108.021 5 母離子丟失162 Da 后得到167.034 4 碎片離子，可能含有香草醛結(jié)構(gòu)。因此，推測該化合物為4?glucopyranosyloxy?3?benzoic acid。

化合物3 為京尼平苷，一級質(zhì)譜保留時間在3.69 min時，出現(xiàn)m／z為211.061 2 的峰，推測為［M?Glu］－的峰，以其作為母離子進(jìn)行全掃描，產(chǎn)生了2 個主要的碎片離子，分別為碎片m／z193.050 4 為母離子失去一個水分子［M?H2O］－峰和碎片m／z167.071 5 為母離子失去一個甲基分子的［M?CO2］－峰，經(jīng)對照品對照，鑒定為京尼平苷，分子式C16H22O10，為環(huán)烯醚萜類。

化合物4 為京尼平，一級質(zhì)譜保留時間在15.33 min時，出現(xiàn)m／z為207.066 1 的峰，推測為［M?H2O］－的峰，以其作為母離子進(jìn)行全掃描，產(chǎn)生2 個主要的碎片離子，碎片m／z177.054 7 為母離子失去一個甲氧基分子的［M?CH3O］－峰，經(jīng)對照品對照，鑒定為京尼平，分子式C11H14O5，為環(huán)烯醚萜苷類。

化合物5 為異綠原酸C，一級質(zhì)譜保留時間在33.14 min時，出現(xiàn)m／z為353.088 0 的峰，推測為 ［M?Glu］－的峰，以其作為母離子進(jìn)行全掃描，產(chǎn)生了1 個主要的碎片離子，即為碎片m／z353.088 0 為母離子失去一個葡萄糖分子的［M?Glu］－峰，經(jīng)對照品對照，鑒定為異綠原酸C，分子式C25H24O12，為苯丙素類。

4 討論

杜仲是我國傳承千年的名貴藥材，其用途廣泛，被稱為“植物黃金”［8］。本實(shí)驗(yàn)通過抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑研究了杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 個部位萃取物的抗補(bǔ)體活性，結(jié)果表明，杜仲石油醚和水部位萃取物無明顯抗補(bǔ)體活性，而正丁醇部位萃取物的抗補(bǔ)體活性最好，為杜仲的最佳抗補(bǔ)體活性部位。

UHPLC?Q?TOF?MS／MS 具有分 析快速、分辨率 高、靈敏度好、重復(fù)性好等特點(diǎn)，是天然產(chǎn)物鑒定復(fù)雜成分的有力手段［9?10］。本實(shí)驗(yàn)采用此分析技術(shù)對杜仲入血成分進(jìn)行研究，共鑒定出12 種原型入血成分。根據(jù)入血成分可能是中藥的有效活性成分［11］這一觀點(diǎn)，結(jié)合參考文獻(xiàn)［12?13］ 分析推測其可能為潛在的抗補(bǔ)體活性成分。

本實(shí)驗(yàn)從抗補(bǔ)體活性與入血成分兩方面對杜仲進(jìn)行研究，以期有助于拓寬對杜仲藥用功效的認(rèn)知，同時也為進(jìn)一步討論杜仲的藥效活性提供參考。