大豆苷元對(duì)人成骨樣MG-63細(xì)胞OPG及RANKL表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

王 川，祁 琳，陳雨萌，王 越，黃宗堂

(1.天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院、天津市內(nèi)分泌研究所、國(guó)家衛(wèi)健委激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.武警特色醫(yī)學(xué)中心藥劑科，天津 300162；3.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 天津 300050；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 天津 301617；5.深圳豐澤康生物科技有限公司， 廣東 深圳 518000)

在口腔種植手術(shù)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到因頜骨骨質(zhì)疏松致種植區(qū)骨密度降低而影響種植體植入后的初期穩(wěn)定性。在牙種植體植入時(shí)種植體能夠獲得初期穩(wěn)定性是至關(guān)重要的，而對(duì)于絕經(jīng)后女性，不僅雌激素分泌較少，還會(huì)導(dǎo)致護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)水平下降，核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)水平升高。這些影響骨代謝因子改變，即OPG降低，RANKL和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)升高會(huì)導(dǎo)致成骨功能下降，破骨細(xì)胞功能上升，骨小梁稀疏，引起骨質(zhì)流失，骨量減少。所以，雌激素的缺乏是導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的根本原因。因而，尋找切實(shí)有效的藥物用于治療PMOP以提高牙種植體植入術(shù)的成功率成為現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)。

雌激素替代治療PMOP療效較好，但毒副作用明顯[1]。植物激素是一類(lèi)與雌激素結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似，能選擇性的與雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，從而發(fā)揮弱雌激素樣活性。近年來(lái)，大豆異黃酮抗骨質(zhì)疏松作用引起廣泛關(guān)注。大豆苷元是大豆異黃酮的的主要成分之一，與17β-雌二醇(17 β-estradiol，E2)具有相似的結(jié)構(gòu)，能與ER結(jié)合發(fā)揮弱雌激素樣作用。有研究表明，大豆苷元能夠增加小鼠成骨細(xì)胞中ALP活性，顯著減少去卵巢大鼠的骨質(zhì)流失，增加骨密度[2]。而且我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[3]，大豆苷元可以通過(guò)抑制人成骨樣MG-63細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，阻止破骨細(xì)胞形成，以產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松的作用。本研究仍以人成骨樣MG-63細(xì)胞為研究對(duì)象，繼續(xù)探索大豆苷元對(duì)OPG及RANKL表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，旨在進(jìn)一步探究大豆苷元抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑大豆苷元(純度>98%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(北京)(批號(hào)：27394)；人成骨樣MG-63細(xì)胞系購(gòu)自ATCC(美國(guó))；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自中美合資蘭州民海生物工程有限公司(批號(hào)：27394)；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))(批號(hào)：1645780)、純ER阻斷劑ICI 182780(批號(hào)：D0005215)、E2購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))批號(hào)：012K9810V)；文中所用引物購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司(南京)；瓊脂糖購(gòu)自Promega公司(美國(guó))(批號(hào)：172155)；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000DE(批號(hào)：947027)、TRIzol購(gòu)自Invitrogen(美國(guó))；2×Premix Taq(批號(hào)：AK5004)、2×PCR Mixture 購(gòu)自TaKaRa(批號(hào)：F0910038)；BCA試劑盒購(gòu)自Pierce公司(美國(guó))(批號(hào)：OB184645)等。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨樣MG-63細(xì)胞使用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，平均2 d更換1次培養(yǎng)液，3-4 d進(jìn)行1次傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM2000DE說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將pGenesil-ERα shRNA、pGenesil-ERβ shRNA、pGenesil-scra-mbled shRNA分別轉(zhuǎn)染至成人成骨樣MG-63細(xì)胞中，按照文獻(xiàn)[4]所述，經(jīng)過(guò)G418加壓篩選構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG-63/ERα shRNA、MG-63/ERβ shRNA、MG-63/scrambled shRNA 細(xì)胞株。

1.2.3藥物處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，換含1%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h同步化細(xì)胞，分別加入不同終濃度的大豆苷元(0.01、0.1、1 μmol·L-1)、Raloxifene(0.1 μmol·L-1)、E2(0.1 μmol·L-1)、DMSO，恒溫箱培養(yǎng)48 h。

ER阻斷劑處理細(xì)胞：先使用10 μmol·L-1的ER阻斷劑ICI 182780，37 ℃孵育30 min，然后加入大豆苷元(0.1 μmol·L-1)，并設(shè)ICI 182,780對(duì)照組。

1.2.4RT-PCR 細(xì)胞接種于6孔板中(2.5×108個(gè)·L-1)，2 mL/孔，按上述方法處理細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為20 μL，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火59 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，Quantity One軟件進(jìn)行分析，以靶基因/β-actin光密度比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5Western blot 調(diào)整細(xì)胞濃度至7.5×108·L-1，取2 mL接種于60 mm培養(yǎng)皿中，按照上述方法處理細(xì)胞，提取蛋白，按照BCA蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行蛋白定量，蛋白SDS-PAGE電泳，然后將蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜免疫檢測(cè)，經(jīng)X-ray底片曝光，Scion Image軟件分析，以β- actin作內(nèi)參，以靶基因/β-actin的灰度值作蛋白相對(duì)表達(dá)豐度。

1.2.6引物序列 OPG：Sense：5′-GCTAACCTCAC CTTCGAG-3′，Antisense：5′-TGATTGGACCTGGTT ACC-3′；RANKL ：Sense：5′-AACAGGCCTTTCAAGG AGCTGTGC-3′,Antisense：5′-AAGAGGACAGACTCA CTTTATGGGG-3′；β-actin：Sense：5′-ACACTGTGTT CAACTACCCCGAG-3′,Antisense：5′-TAAAACGCA GCTCAGTAACAGTCC-3′；ERα：Sense：5′-ACACTGT GTTCAACTACCCCGAG-3′,Antisense：5′-CAGGCTG TTGGGACTGAAGG-3′；ERβ：Sense：5′-TCTGTCC AGCCACGAATCAG-3′,Antisense：5′-AGCTTTTACG CCGGTTCTTG-3′。

1.2.7質(zhì)粒 pGenesil-ERα-siRNA、pGenesil-ERβ-siRNA、pGenesil-scramble—siRNA 3種質(zhì)粒均由武漢晶賽生物科技公司設(shè)計(jì)、合成，都是以pGenesil-1為載體，載體帶有CMV啟動(dòng)子，能表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的真核表達(dá)。3種質(zhì)粒的DNA模板序列如下： pGenesil-ERα-siRNA：Sense：CTCATCCTCTC CCACATCA，Loop：TTCAAGACG，Antisense：TGATG TGGGAGAGGATGAG；pGenesil-ERβ-siRNA：Sense：GCCCTGCTGTGATGAATTA，Loop：TTCAAGACG，Antisense：TA ATTCATCACAGCAGGGC；pGenesil-scramble-siRNA：Sense：GACTTCATAAGGCGCATGC，Loop：TTCAAGACG，Antisense：GCATGCGCCTTATGAAGTC。

1.2.8抗體 OPG：小鼠單克隆抗體，購(gòu)自Santa Cruz，稀釋比，1 ∶200；RANKL：小鼠單克隆抗體，購(gòu)自Santa Cruz，稀釋比，1 ∶200；β-actin：小鼠單克隆抗體，購(gòu)自Sigma USA，稀釋比，1 ∶2 000。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖表處理。

2 結(jié)果

2.1 大豆苷元促進(jìn)MG-63細(xì)胞OPG mRNA和蛋白的表達(dá)與Control組相比較，使用大豆苷元(0.01、0.1、1 μmol·L-1)及陽(yáng)性對(duì)照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)處理MG-63細(xì)胞觀察OPG mRNA和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)不同濃度的大豆苷元均可促進(jìn)MG-63細(xì)胞OPG mRNA和蛋白的表達(dá)水平，其中以0.1 μmol·L-1濃度促進(jìn)效果最為明顯(P<0.05)。同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)均能明顯促進(jìn)MG-63細(xì)胞OPG mRNA和蛋白的表達(dá)水平。見(jiàn)Fig 1,2。

Fig 1 Expression of OPG mRNA detected by

Fig 2 Expression of OPG protein detected by

2.2 大豆苷元抑制MG-63細(xì)胞RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)與Control組相比較，使用大豆苷元(0.01、0.1、1 μmol·L-1)及陽(yáng)性對(duì)照藥物(0.1μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)處理MG-63細(xì)胞觀察RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)不同濃度的大豆苷元均可抑制MG-63細(xì)胞RANKL mRNA的表達(dá)水平，其中以0.1 μmol·L-1濃度抑制效果最為明顯(P<0.01)，而大豆苷元濃度為1 μmol·L-1時(shí)蛋白的表達(dá)水平最低(P<0.01)。同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1μmol·L-1E2)也均能抑制RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，見(jiàn)Fig 3,4。

Fig 3 Expression of RANKL mRNA detected by

Fig 4 Expression of RANKL protein detected by

上述結(jié)果提示，大豆苷元可以促進(jìn)OPG mRNA和蛋白的表達(dá)并抑制RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)，其作用效果與Raloxifene和E2類(lèi)似。

2.3 經(jīng)大豆苷元作用后MG-63細(xì)胞OPG/RANKL比值與Control組相比較，大豆苷元處理組(0.01、0.1、1 μmol·L-1)及陽(yáng)性對(duì)照藥物Raloxifene(0.1 μmol·L-1)及E2(0.1 μmol·L-1)處理組OPG/RANKL比值升高,見(jiàn)Fig 5,6。

Fig 5 Ratio of OPG / RANKL mRNA

Fig 6 Ratio of OPG / RANKL protein

2.4 ER阻斷劑對(duì)大豆苷元OPG和RANKL轉(zhuǎn)錄活性的阻斷作用為了觀察大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的調(diào)節(jié)作用是否由ER途徑介導(dǎo)，本研究在加入大豆苷元(0.1 μmol·L-1)前30 min，先加入ER阻斷劑ICI 182780(100 μmol·L-1)處理MG-63細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR和Western blot方法來(lái)檢測(cè)OPG和RANKL的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。如Fig 7-10所示，ICI 182780可阻斷大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG表達(dá)的上調(diào)作用(P<0.05)，可阻斷大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞RANKL表達(dá)的下調(diào)作用(P<0.05)，單獨(dú)ICI 182780作用不影響大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG及RANKL的表達(dá)水平(P>0.05)。

Fig 7 The blocking effect of ER blocker on Daidzein induced OPG mRNA expression detected by RT-PCR

Fig 8 The blocking effect of ER blocker on Daidzein induced OPG protein expression detected by Western blot

Fig 9 The blocking effect of ER blocker on Daidzein induced RANKL mRNA expression detected by RT-PCR

Fig 10 The blocking effect of ER blocker on Daidzein induced RANKL protein expression detected by Western blot

2.5 大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG的促進(jìn)作用、RANKL的抑制作用是由ERα 和ERβ共同介導(dǎo)的如Fig 11,12所示，與parental對(duì)照組、scrambled shRNA對(duì)照組(scrambled shRNA細(xì)胞是向MG-63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載體，作為干擾的空白對(duì)照)相比，大豆苷元對(duì)MG-63/ERα shRNA和MG-63/ERβ shRNA細(xì)胞OPG和RANKL的mRNA和蛋白的表達(dá)水平無(wú)影響(P>0.05)，見(jiàn)Fig 11,12。

Fig 11 Effects of Daidzein on expression of OPG and RANKL mRNA in MG-63/ERα shRNA and MG-63/ERβ shRNA cells detected by RT-PCR

Fig 12 Effects of Daidzein on OPG and RANKL protein expression in MG-63 / ERα shRNA and MG-63/ERβ shRNA cells detected by Western blot

3 討論

腫瘤壞死因子家族的NF-κB受體激活子RANKL在口腔的牙胚、牙囊、牙周組織、骨組織及慢性炎癥組織區(qū)域中可檢出，其受體RANK和OPG組成的RANKL-RANK-OPG軸參與調(diào)節(jié)骨吸收與骨生成平衡。RANKL與破骨前體細(xì)胞或成熟破骨細(xì)胞膜上的RANKL結(jié)合，刺激破骨細(xì)胞分化、活化及抑制破骨細(xì)胞凋亡[5]，引起骨吸收的發(fā)生。OPG是TNF超家族成員，可作為RANKL的誘騙受體與RANK結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性的抑制RANKL與RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞分化、成熟及骨量增加。

本研究以人成骨樣MG-63細(xì)胞作為研究對(duì)象，因其具有特征性成骨細(xì)胞功能，并能同時(shí)表達(dá)ERα和ERβ。絕經(jīng)后不僅雌激素分泌減少，還會(huì)導(dǎo)致OPG水平下降，RANKL水平升高，導(dǎo)致骨質(zhì)流失，骨量減少，骨小梁稀疏。雌激素替代治療PMOP療效較好，但毒副作用明顯[6]。植物激素是一類(lèi)與雌激素結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似，能選擇性的與ER結(jié)合，從而發(fā)揮弱雌激素樣活性。大豆苷元是大豆異黃酮的的主要成分之一，與17β-雌二醇(E2)擁有相似的結(jié)構(gòu)，能與ER結(jié)合發(fā)揮弱雌激素樣作用。經(jīng)研究，大豆苷元具有抗炎[7]、抗氧化[8-9]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及遷移[8, 10]。因此，我們實(shí)驗(yàn)用大豆苷元作用于MG-63細(xì)胞，觀察OPG、RANKL的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，探索大豆苷元抗骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，大豆苷元能促進(jìn)MG-63細(xì)胞OPG mRNA和蛋白的表達(dá)且能抑制MG-63細(xì)胞RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的大豆苷元及陽(yáng)性對(duì)照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)均可促進(jìn)MG-63細(xì)胞OPG mRNA和蛋白的表達(dá)水平，其中濃度為0.1 μmol·L-1大豆苷元促進(jìn)效果最為明顯。不同濃度的大豆苷元及陽(yáng)性對(duì)照藥物(0.1 μmol·L-1Raloxifene及0.1 μmol·L-1E2)均可抑制MG-63細(xì)胞RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)水平，其中以0.1 μmol·L-1濃度抑制效果最為明顯(P<0.01)，而大豆苷元濃度為1 μmol·L-1時(shí)蛋白的表達(dá)水平最低(P<0.01)。因此，我們認(rèn)為大豆苷元能夠通過(guò)促進(jìn)MG-63細(xì)胞OPG表達(dá)、抑制RANKL表達(dá)，從而能夠?qū)崿F(xiàn)抗骨質(zhì)疏松的作用。

OPG/RANKL比值可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞成骨作用的指標(biāo)。骨質(zhì)疏松癥患者骨組織OPG與RANKL的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常骨組織。根據(jù)Liu等[11]、Kapasa等[12]研究表明，OPG可顯著增加種植體周?chē)墙Y(jié)合，通過(guò)增加種植體周?chē)鶲PG的表達(dá)或提高OPG/RANKL的比值可顯著增加口腔種植的成功率。因此，我們計(jì)算了經(jīng)大豆苷元作用后MG-63細(xì)胞OPG/RANKL比值。結(jié)果顯示，與Control組相比較，大豆苷元處理組(0.01、0.1、1 μmol·L-1)及陽(yáng)性對(duì)照藥物Raloxifene(0.1 μmol·L-1)及E2(0.1 μmol·L-1)處理組OPG/RANKL比值升高。這提示，加入大豆苷元可增加成骨細(xì)胞介導(dǎo)能力，能起到抑制骨質(zhì)疏松的作用。

有研究表明[13]，E2能與ER結(jié)合發(fā)揮弱雌激素樣作用，其抗骨質(zhì)疏松機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG表達(dá)、抑制RANKL表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。最近有研究表明[14]，大豆苷元可以通過(guò)ER途徑激活mTOR上調(diào)Cyclin D1和SREBP-1c的表達(dá)。那么大豆苷元是否也是通過(guò)ER途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)MG-63細(xì)胞OPG、RANKL mRNA及蛋白的表達(dá)的影響呢？為了觀察大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)的調(diào)節(jié)作用是否由ER途徑介導(dǎo)，我們?cè)诩尤氪蠖管赵?0.1μmol·L-1)前30min，先加入ER阻斷劑ICI 182780 (100 μmol·L-1)處理MG-63細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR和Western blot方法來(lái)檢測(cè)OPG和RANKL的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，ICI 182780可阻斷大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG表達(dá)的上調(diào)作用，可阻斷大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞RANKL表達(dá)的下調(diào)作用，單獨(dú)ICI 182780作用不影響大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG及RANKL的表達(dá)水平，這提示大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG和RANKL的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用是經(jīng)ER途徑介導(dǎo)的。

為進(jìn)一步確認(rèn)大豆苷元是經(jīng)過(guò)ER何種亞型發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的，本研究采用shRNA技術(shù)分別沉默了ERα 和ERβ的表達(dá)，然后采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆的OPG和RANKL的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與parental對(duì)照組、scrambled shRNA對(duì)照組相比，大豆苷元對(duì)MG-63/ERα shRNA和MG-63/ERβ shRNA細(xì)胞OPG、RANKL的mRNA和蛋白的表達(dá)水平影響差異無(wú)顯著性。因此，大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG的促進(jìn)作用、RANKL的抑制作用是由ERα和ERβ共同介導(dǎo)的。

綜上，本研究對(duì)大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)及其作用機(jī)制作了初步探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆苷元可以通過(guò)ERα 和ERβ途徑促進(jìn)MG-63細(xì)胞OPG的mRNA和蛋白的表達(dá)、抑制RANKL的mRNA和蛋白的表達(dá)，從而減少骨質(zhì)吸收，改善骨密度，緩解骨質(zhì)疏松。因此，大豆苷元可為防治骨質(zhì)疏松提供理論基礎(chǔ)，為新藥的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，進(jìn)而為中老年骨質(zhì)疏松患者提供口腔種植體植入適合的條件，以增加口腔種植義齒修復(fù)的成功率。