沙棘籽粕蛋白控制酶解富含精氨酸肽的工藝優(yōu)化

歐陽(yáng)道福，相歡，崔春*

1. 完美（廣東）日用品有限公司（中山 528400）；2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（廣州 510640）

沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn.）為胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬（Hippophae），是一種落葉性灌木，為中國(guó)西部地區(qū)最具代表性的經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。沙棘中含有多種生物活性物質(zhì)，如維生素、黃酮、三萜、蛋白質(zhì)、脂肪酸類(lèi)、有機(jī)酸和糖等[2]。

沙棘籽粕是提取沙棘籽油后的副產(chǎn)物，脫脂沙棘籽粕是沙棘超臨界二氧化碳提取沙棘油后的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量豐富，為25%～30%[3]，且氨基酸種類(lèi)齊全，包含人體全部的必需氨基酸[4]。如果可以將這部分蛋白質(zhì)充分利用，酶解加工成小分子活性肽，可以提高沙棘蛋白的消化利用率[5]。對(duì)于沙棘籽粕及沙棘籽粕蛋白的酶解較多[6]。連偉帥等[7]采用堿性蛋白酶對(duì)沙棘籽渣進(jìn)行酶解，結(jié)合超濾膜超濾分別得到分子質(zhì)量500～2 000 Da的促生長(zhǎng)發(fā)育多肽以及2 000～

3 500 Da的免疫抗病多肽。王茂廣[8]研究堿性蛋白酶酶解制備沙棘籽粕蛋白抗氧化肽，結(jié)果表明沙棘籽粕蛋白酶解物具有較強(qiáng)的還原能力。陳彤[9]采用木瓜蛋白酶水解沙棘蛋白制備醒酒肽。研究表明，沙棘蛋白中精氨酸含量較高，且精氨酸對(duì)于糖脂代謝有很大作用[10]。Hu等[11]的研究表明，精氨酸通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮信號(hào)通路從而起到減肥的作用。另外，L-精氨酸是動(dòng)物體內(nèi)一種具有特殊營(yíng)養(yǎng)活性的堿性氨基酸，其代謝產(chǎn)物肌酸、胍丁胺、NO和多胺等在動(dòng)物機(jī)體能量與脂肪代謝、肌肉發(fā)育與蛋白合成等動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方面發(fā)揮著非常重要的作用[12]，尤其是NO和多胺途徑對(duì)動(dòng)物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要的意義。而富含精氨酸的肽通過(guò)消化進(jìn)入胃腸道可以起到以上作用。但是尚未見(jiàn)到關(guān)于沙棘籽粕蛋白控制酶解制備富含精氨酸功能性肽的報(bào)道。

因此，以實(shí)驗(yàn)室自提的沙棘籽粕蛋白為原料，以蛋白回收率、水解度和精氨酸含量為指標(biāo)，篩選酶解效果較好的酶制劑；通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面模型優(yōu)化沙棘蛋白酶解的最優(yōu)工藝，并測(cè)定其肽分子質(zhì)量分布和苦味值，以期為沙棘籽粕蛋白深加工及利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘籽粕蛋白（實(shí)驗(yàn)室從完美康普高原特色植物研究中心提供的沙棘籽粕原料中自行提取獲得[13]）；堿性蛋白酶（Acalase，2 500 U/g）；胰蛋白酶（Trypsin，8 000 U/g）；復(fù)合蛋白酶（Protamex，8 500 U/g）；風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme，5 000 U/g，諾維信中國(guó)有限公司）；α-萘酚；次氯酸鈉；氫氧化鈉；無(wú)水乙醇（廣州從源儀器有限公司）；精氨酸（純度98%，上海博奧生物科技有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma試劑公司）：牛血清蛋白（MW=68 000），細(xì)胞色素C（MW=12 500），抑酞酶（MW=6 500），桿菌肽（MW=1 450），Gly-Gly-Tyr-Arg（MW=451），Gly-Gly（MW=123.5）。

色譜柱TSKgel G2000SWXL（Tosoh Bioscience LLC，德國(guó)）；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UV765，上海佑科儀器有限公司）；氨基酸分析儀（日立L8900，廈門(mén)慶期壹貿(mào)易有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（GL21M，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 指標(biāo)測(cè)定

1.2.1.1 蛋白質(zhì)回收率與水解度的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法[14-15]，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)為6.25。氨氮含量測(cè)定采用甲醛滴定法[16]。蛋白質(zhì)回收率按式（1）計(jì)算，水解度按式（2）計(jì)算。

1.2.1.2 精氨酸含量測(cè)定

采用坂口反應(yīng)[17]測(cè)定精氨酸含量。精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：分別配制10，20，40，60，80和100 μg/mL的精氨酸溶液。分別加入5 mL精氨酸溶液（1 mg/mL）、0.2%的α-萘酚（500 μL）、10%氫氧化鈉（500 μL）、500 μL有效氯為1%的次氯酸鈉和500 μL 40%的尿素，加入后反應(yīng)80 s，全波長(zhǎng)掃描之后其最大吸收波長(zhǎng)為501 nm。精氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=0.006 1X+0.006 8，其中X表示精氨酸濃度（μg/mL），Y表示吸光度，R2=0.997 6。精氨酸含量按式（3）計(jì)算。

1.2.2 沙棘蛋白酶解工藝中酶的篩選

稱(chēng)取4 g沙棘蛋白，加入100 g超純水，調(diào)節(jié)pH 8.0，分別加入堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶（0.2%，以蛋白含量計(jì)），于55 ℃反應(yīng)不同時(shí)間（10，30，60，120，180，240和300min），取樣測(cè)定蛋白質(zhì)回收率和精氨酸含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以蛋白質(zhì)回收率和精氨酸含量為指標(biāo)，以pH、酶解溫度、酶添加量為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。具體步驟：（1）配制4%蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH 7，8，9，10，11和12，堿性蛋白酶和胰蛋白酶添加量0.25%，于55 ℃反應(yīng)3 h；（2）配制4%蛋白溶液，調(diào)節(jié)至pH 11，酶添加量0.25%，于45，50，55和60 ℃反應(yīng)3 h；（3）配制4%蛋白溶液，調(diào)節(jié)至pH 11，添加不同濃度的酶（0.05%，0.10%，0.20%和0.30%），于50 ℃反應(yīng)3 h。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素試驗(yàn)測(cè)定的水平范圍，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件，以蛋白質(zhì)回收率和精氨酸含量為響應(yīng)面指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，確定沙棘籽粕蛋白最佳酶解工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平

1.2.5 氨基酸組成分析

氨基酸測(cè)定參考Su等[18]的方法。采用日立L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定樣品中氨基酸的含量。樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg樣品，小心加入專(zhuān)用水解管中，加入5 mL 1︰1的分析純鹽酸（約6 mol/L）。酒精噴燈封管后置烘箱中于110 ℃水解22～24 h；樣品過(guò)濾和定容。水解后的樣品取出冷卻至室溫，開(kāi)管后用小漏斗和濾紙過(guò)濾到25或50 mL容量瓶中，水解管用去離子水洗滌3次，洗滌液過(guò)濾到容量瓶中，用去離子水洗滌濾紙，洗滌液也收集到小容量瓶中。定容至刻度線(xiàn)；吸取1～2 mL定容后的樣品，置烘箱中脫酸。溫度60 ℃，脫至干燥，底部留有少許固體或痕漬為止；脫酸后的樣品，加入1～3 mL樣品緩沖液，置震蕩混合器上混合均勻，針管吸取少量，經(jīng)0.22～0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾后裝入試劑瓶中上機(jī)分析。

1.2.6 肽相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

參考Zheng等[19]的方法，稍作修改。測(cè)定沙棘籽粕蛋白及其酶解產(chǎn)物的肽相對(duì)分子質(zhì)量分布。流動(dòng)相（V（乙腈）︰V（水）=20︰80，0.1%三氟乙酸），流速0.5 mL/min。相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)：分別用流動(dòng)相配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的不同相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品溶液（牛血清蛋白、細(xì)胞色素C、抑酞酶、桿菌肽、Gly-Gly-Tyr-Arg，Gly-Gly），經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，分別進(jìn)樣（進(jìn)樣量20 μL），得到系列標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（lgMW）對(duì)保留時(shí)間作圖，得到分子校正曲線(xiàn)及其方程。

1.2.7 酶解產(chǎn)物的苦味鑒定

苦味評(píng)定參照文獻(xiàn)[20-21]的方法，稍作修改。分別由8名（男女各4名）受過(guò)專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練的感官評(píng)定員對(duì)酶解液的苦味進(jìn)行品評(píng)，將苦味分為強(qiáng)（4～6分）、中（1～3分）、弱（0～1分）3個(gè)等級(jí)，以去離子水作為參照（分值為0分），對(duì)試驗(yàn)樣品的苦味打分，酶解液苦味的最終得分為8位感官評(píng)定員打分的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3遍，數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定的平均值，響應(yīng)面采用Design-Expert 8.0軟件分析處理，顯著性分析采用Minitab 17.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對(duì)沙棘蛋白酶解效果的影響

分別采用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)沙棘蛋白進(jìn)行酶解，蛋白質(zhì)回收率及水解度的結(jié)果如圖1（A）所示。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)回收率和水解度均呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。蛋白質(zhì)回收率的大小為堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶。堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的蛋白回收率明顯高于其他2種酶。反應(yīng)時(shí)間超過(guò)3 h后，蛋白回收率沒(méi)有顯著性增長(zhǎng)。

如圖1（B）所示，對(duì)4種酶而言，精氨酸含量大小為復(fù)合蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶。隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，除風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物外，其余3種酶解產(chǎn)物的精氨酸含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間延長(zhǎng)，上清液中蛋白質(zhì)含量不斷增加，而精氨酸部分可能會(huì)出現(xiàn)在沉淀中，從而導(dǎo)致精氨酸含量整體下降。結(jié)合蛋白質(zhì)回收率和精氨酸含量，選擇堿性蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

圖1 不同蛋白酶對(duì)沙棘籽粕蛋白的酶解效果

2.2 不同pH對(duì)沙棘蛋白酶解效果的影響

如圖2所示，隨著pH增加，蛋白質(zhì)回收率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，并且胰蛋白酶整體高于堿性蛋白酶，且pH 11時(shí)蛋白質(zhì)回收率最大，繼續(xù)增加pH對(duì)蛋白回收率沒(méi)有顯著性提高。同時(shí)精氨酸含量隨著pH增加呈現(xiàn)波動(dòng)，但整體并未呈現(xiàn)大幅下降，因此，結(jié)合蛋白質(zhì)回收率，選擇pH 11作為后續(xù)試驗(yàn)的最佳pH。

2.3 酶解溫度對(duì)沙棘蛋白酶解效果的影響

如圖3所示，隨著酶解溫度增加，蛋白質(zhì)回收率呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)，且在50 ℃時(shí)出現(xiàn)較大值，胰蛋白酶酶解的蛋白質(zhì)回收率整體大于堿性蛋白酶，同時(shí)精氨酸含量隨著溫度的增加呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)，因此，結(jié)合蛋白質(zhì)回收率，選擇50 ℃作為后續(xù)試驗(yàn)的最佳反應(yīng)溫度。

圖2 不同pH對(duì)沙棘籽粕蛋白酶解的影響

圖3 不同酶解溫度對(duì)沙棘蛋白酶解的影響

2.4 酶添加量對(duì)沙棘蛋白酶解效果的影響

如圖4所示，隨著酶添加量增加，蛋白質(zhì)回收率和精氨酸含量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，且加酶量高于0.2%時(shí)，蛋白質(zhì)回收率和精氨酸含量未呈現(xiàn)顯著性增長(zhǎng)。胰蛋白酶酶解效果整體優(yōu)于堿性蛋白酶，選擇酶添加量0.2%作為后續(xù)試驗(yàn)的最佳酶添加量。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇胰蛋白酶進(jìn)行響應(yīng)面模型驗(yàn)證。

圖4 不同加酶量對(duì)沙棘籽粕蛋白酶解的影響

2.5 胰蛋白酶酶解工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.5.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

通過(guò)響應(yīng)面法，對(duì)初始pH、溫度、加酶量3個(gè)單因素進(jìn)行分析，得到試驗(yàn)方案及結(jié)果，見(jiàn)表2。應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到分析結(jié)果，如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

酶解條件與沙棘籽粕蛋白回收率之間的二次多項(xiàng)模型為

蛋白質(zhì)回收率=88.36-8.60A+0.66B+2.38C-5.35AB-0.10AC+1.89BC-54.92A2-9.29B2-9.89C2

酶解條件與精氨酸含量之間的二次多項(xiàng)模型為

精氨酸含量=0.16+(2.276E-003)A+(3.072E-003)B+(1.828E-003)C-(2.428E-003)AB+(2.229E-003)AC-0.012BC-(9.405E-003)A2-0.024B2-0.016C2

由表3可以得出，蛋白質(zhì)回收率的回歸模型具有高度顯著性（p＜0.000 1），而失擬項(xiàng)（p=0.203＞0.05）不顯著。A、C達(dá)到顯著水平，表明試驗(yàn)?zāi)M擬合度較好。AB，A2，B2，C2對(duì)沙棘籽粕蛋白回收率有顯著影響（p＜0.05），而其他因素影響不顯著。由方差分析F值可知，各因素對(duì)沙棘籽粕蛋白酶解蛋白回收率的影響依次為pH＞酶添加量＞溫度。

另外，精氨酸含量的回歸模型也具有高度顯著性（p＜0.01），失擬項(xiàng)（p=0.127＞0.05）不顯著。A、C達(dá)到顯著水平，表明試驗(yàn)?zāi)M擬合度較好。AC，A2，B2，C2對(duì)沙棘籽粕蛋白回收率有顯著影響（p＜0.05），而其他因素影響不顯著。由方差分析F值可知，各因素對(duì)沙棘籽粕蛋白酶解蛋白回收率的影響依次為溫度＞pH＞酶添加量。

表3 方差分析

2.5.2 最佳工藝的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

通過(guò)二次多項(xiàng)回歸分析預(yù)測(cè)，采用響應(yīng)面回歸模型確定沙棘籽籽粕蛋白酶解的最佳工藝：pH 11.16，溫度50.26 ℃，酶添加量0.18%。在此條件下，蛋白質(zhì)回收率為88.75%，精氨酸含量為0.155 g/g。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，工藝參數(shù)修正為pH 11，溫度50 ℃，酶添加量0.18%。在此條件下，測(cè)得蛋白質(zhì)回收率為88.01%，精氨酸含量為0.158 g/g，與模型預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異。因此，所得最佳工藝合理可靠。

2.6 沙棘蛋白酶解產(chǎn)物氨基酸含量測(cè)定

由表4可知，酶解前和酶解后的氨基酸種類(lèi)相同，均被檢測(cè)出17種氨基酸；酶解之后的水解氨基酸總量降低，這可能是因?yàn)槊附膺^(guò)程中，部分肽段因相互作用而聚集形成沉淀。酶解前與酶解后的氨基酸的百分比差異較小。沙棘蛋白中含量較高的氨基酸分別是谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，分別占總量的23.72%，16.16%和11.48%，酶解產(chǎn)物中這3種氨基酸的比例分別為23.5%，16.5%和11.85%。

表4 沙棘籽粕蛋白及酶解產(chǎn)物氨基酸含量

2.7 肽分子質(zhì)量分布以及苦味評(píng)價(jià)

分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)為Y=-3.193 8X+26.724，其中X表示分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值，Y表示出峰時(shí)間。樣品經(jīng)過(guò)液相處理之后，根據(jù)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)計(jì)算相應(yīng)的分子質(zhì)量，并得出相應(yīng)的峰面積，得到樣品的肽分子質(zhì)量分布。如表3所示，沙棘蛋白原料的分子質(zhì)量較大，而經(jīng)過(guò)酶解之后，分子質(zhì)量明顯降低。堿性蛋白酶酶解之后的肽分子質(zhì)量中小于1 kDa的部分占到49%，多屬于小分子肽；而胰蛋白酶酶解之后的肽分子質(zhì)量5～10 kDa居多，且具有較多的大分子質(zhì)量的肽段，所以胰蛋白酶酶解之后的樣品的味道較好。

表5 沙棘籽粕蛋白及酶解液的肽分子質(zhì)量分布單位：%

3 結(jié)論

試驗(yàn)以沙棘籽粕蛋白為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法水解工藝，為其高值化利用提供理論指導(dǎo)。不同蛋白酶對(duì)沙棘蛋白的酶解效率不同，其中胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解效果較好，且胰蛋白酶酶解產(chǎn)物可以有效降低苦味，減少后期工藝生產(chǎn)中的脫苦環(huán)節(jié)。結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面模型驗(yàn)證，確定胰蛋白酶酶解沙棘蛋白的最優(yōu)工藝：pH 11，溫度50 ℃，酶添加量0.18%。在此條件下，最大蛋白質(zhì)回收率為88.75%，精氨酸含量為0.155 g/g。實(shí)際測(cè)得蛋白質(zhì)回收率為88.01%，精氨酸含量為15.8%，與模型預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異。氨基酸測(cè)定結(jié)果表明，沙棘蛋白中含量較高的氨基酸分別是谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，分別占總量的23.72%，16.16%和11.48%。胰蛋白酶控制酶解對(duì)于精氨酸的含量起到富集作用。分子質(zhì)量分布表明，經(jīng)過(guò)酶解之后，大相對(duì)分子質(zhì)量蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性的小分子肽，且富含精氨酸，為后期開(kāi)發(fā)富含精氨酸肽的產(chǎn)品提供工藝基礎(chǔ)。