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    牡丹籽粕酶解多肽飼料工藝研究

    2021-04-06 11:56:28張惠喜宋紅衛(wèi)孫啟亮袁國良
    飼料博覽 2021年1期
    關(guān)鍵詞:籽粕蛋白酶解牡丹

    張惠喜,宋紅衛(wèi),肖 猛,孫啟亮,袁國良

    (菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院,山東 菏澤274000)

    油用牡丹是我國新型的木本油料植物,2011年國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)牡丹籽油為新資源食品[1]。牡丹籽粕是壓榨牡丹籽油的副產(chǎn)物,在牡丹籽油制備過程中牡丹籽粕產(chǎn)出率為25%~30%[2],每年大量用于榨油后的牡丹籽粕被廢棄,經(jīng)檢測牡丹籽粕中蛋白質(zhì)含量在30%左右,而且氨基酸種類全面,可以開發(fā)為一種蛋白質(zhì)飼料原料[3-4]。

    研究表明,生物機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收并不全是以氨基酸形式,小分子多肽因具有重要的生理功效而被機(jī)體吸收利用[5]。通過水解蛋白質(zhì)可以得到易于機(jī)體消化吸收的小分子多肽,由于酸或堿水解法對蛋白質(zhì)破壞程度大,一般不用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)品[6],而酶水解法作用條件溫和,能夠保持蛋白質(zhì)的活性,常常用于制備具有生物活性的多肽類產(chǎn)品[7]。

    本試驗(yàn)利用堿性蛋白酶水解牡丹籽粕制備蛋白質(zhì)多肽飼料產(chǎn)品,以期為牡丹籽粕在畜禽養(yǎng)殖上的利用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 原料與試劑

    牡丹籽粕,菏澤天寶牡丹有限公司產(chǎn)品;堿性蛋白酶(批號為S101054),上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;氫氧化鈉、鹽酸等,均分析純級。

    1.2 儀器與設(shè)備

    K9870型凱氏定氮儀,濟(jì)南海能儀器股份有限公司產(chǎn)品;SHA-C型水浴恒溫振蕩器,天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠產(chǎn)品;SK15型離心機(jī),Sigma公司產(chǎn)品;FE20K型臺式酸度計(jì),梅特勒-托利公司產(chǎn)品。

    2 方法

    2.1 牡丹籽粕多肽的提取工藝流程

    按1:20(W/V)的料液比配制牡丹籽粕懸混液,用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值,加入設(shè)定比例的堿性蛋白酶,于水浴中恒溫酶解。在此期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變,并記錄NaOH溶液的消耗量。反應(yīng)完成后,將酶解液于95℃沸水浴中滅活10 min,冷卻至室溫,再6 000 r·min-1離心10 min,過濾后即得牡丹籽粕酶解多肽。

    2.2 牡丹籽粕蛋白水解度的測定

    根據(jù)pH-state法[8]計(jì)算牡丹籽粕蛋白水解度(DH)。具體公式如下[9]:

    式 中:C為NaOH溶 液 濃 度(mol·L-1),V為NaOH溶液消耗體積(mL),α為氨基的離解度;m為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量(g),h為每克原料牡丹籽粕蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù),h=7.84 mmol·g-1,T為試驗(yàn)溫度(K)。

    2.3 單因素試驗(yàn)

    2.3.1 溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果影響

    按1:20(W/V)的料液比配制牡丹籽粕懸混液,用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5,加入1.0%的堿性蛋白酶,分別在50℃、55℃、60℃、65℃水浴鍋中保溫酶解2.0 h,期間不斷加入0.5 mol·L-1的NaOH溶液以保持溶液的pH不變,記錄消耗的加堿量,分析酶解溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

    2.3.2 pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

    按1:20(W/V)的料液比配制牡丹籽粕懸混液,在60℃水浴鍋中保溫,加入1.0%的堿性蛋白酶,用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0,酶解2.0 h,期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變,記錄消耗的堿量,分析pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

    2.3.3 酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

    按1:20(W/V)的料液比配制牡丹籽粕懸混液,用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5,并在60℃水浴鍋中保溫,分別加入濃度為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的堿性蛋白酶,酶解2.0 h,期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變,記錄消耗的堿量,分析酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

    2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

    按1:20(W/V)的料液比配制牡丹籽粕懸混液,用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5,并在60℃水浴鍋中保溫,此時(shí)加入1.0%的堿性蛋白酶,分別酶解1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h,期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變,記錄消耗的加堿量,分析反應(yīng)時(shí)間對牡丹籽粕蛋白酶解工藝的影響。

    2.4 正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件

    依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以水解度為指標(biāo),進(jìn)行正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)因素水平見表1。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平

    3 結(jié)果與分析

    3.1 單因素試驗(yàn)

    3.1.1 溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

    溫度是影響蛋白酶解最重要的因素之一,過高或過低均會(huì)影響酶的活力,進(jìn)而影響酶解過程。當(dāng)溫度升高時(shí),反應(yīng)速度也加快,另一方面,溫度過高也會(huì)使蛋白質(zhì)變性沉降,阻礙蛋白質(zhì)與酶的接觸,從而影響酶解效果[10]。本試驗(yàn)中,隨著酶解溫度從50℃升高到60℃時(shí),牡丹籽粕蛋白DH逐漸升高,從開始的10.02%增大到17.25%,當(dāng)酶解溫度超過60℃后,DH逐漸降低,酶解溫度從60℃升高到65℃時(shí),牡丹籽粕蛋白DH從17.25%降低到14.36%,結(jié)果見圖1。

    3.1.2 pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

    堿性蛋白酶的活性很大程度上取決于pH,因?yàn)閜H能顯著影響堿性蛋白酶活性位點(diǎn)的氨基酸電離狀態(tài),而且在維持酶的正常構(gòu)象方面起著重要作用[11-12]。本試驗(yàn)中,隨著酶解液pH從6.5增加到7.5,牡丹籽粕蛋白的DH從8.08%增大到19.53%,當(dāng)pH值從7.5繼續(xù)增加到8.0時(shí),牡丹籽粕蛋白DH從19.53%顯著降低到14.40%,結(jié)果見圖2。

    圖1 不同酶解溫度下牡丹籽粕的蛋白酶解度

    圖2 不同pH時(shí)牡丹籽粕的蛋白酶解度

    3.1.3 酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

    蛋白酶解時(shí),底物濃度確定時(shí),隨著酶濃度的增加,水解度隨著提高,當(dāng)酶濃度超過一定量時(shí),DH趨于平緩。本試驗(yàn)中,隨著酶濃度從0.6%增加到1.0%,牡丹籽粕蛋白DH從12.58%增加到17.84%,當(dāng)酶濃度從1.0%繼續(xù)增加到1.2%時(shí),牡丹籽粕蛋白DH從17.84%變?yōu)?7.90%,結(jié)果見圖3。

    圖3 不同酶濃度下牡丹籽粕蛋白的酶解度

    3.1.4 反應(yīng)時(shí)間對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

    本試驗(yàn)中,隨著反應(yīng)時(shí)間從1 h增大到3 h,牡丹籽粕蛋白DH從8.24%顯著地增加到15.86%,再繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間,牡丹籽粕蛋白DH趨于平穩(wěn),可能3 h的反應(yīng)時(shí)間已經(jīng)能夠確保底物與酶充分反應(yīng),再繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間,DH的變化幅度很小,結(jié)果見圖4。

    圖4 不同反應(yīng)時(shí)間時(shí)牡丹籽粕的蛋白酶解度

    3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝

    結(jié)果見表2和表3。

    表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及牡丹籽粕蛋白DH測定結(jié)果

    表3 牡丹籽粕蛋白DH方差分析結(jié)果

    由表2、表3方差分析結(jié)果可知,溫度、pH、酶濃度對牡丹籽粕蛋白水解度的影響差異極顯著(P<0.01),反應(yīng)時(shí)間對牡丹籽粕蛋白水解度的影響差異顯著(P<0.05);影響因素主次順序?yàn)閜H>酶解溫度>酶濃度>反應(yīng)時(shí)間。最佳酶解工藝組合為pH=7.5、酶解溫度60℃,酶濃度為1.2%,反應(yīng)時(shí)間為3 h。

    4 結(jié) 論

    牡丹籽粕是壓榨牡丹籽油的副產(chǎn)物,由于對牡丹籽粕的研究主要集中在其化學(xué)成分方面,因此大量榨油后的牡丹籽粕被廢棄。研究表明,在肉雞飼料中添加一定比例牡丹籽粕,能顯著提高21 d肉雞血漿IgG、IgM含量(P<0.05);在產(chǎn)蛋雞飼料中添加5%牡丹籽粕能夠提高蛋殼質(zhì)量、蛋黃等級、蛋白高度、哈氏單位[13]。牡丹籽粕蛋白質(zhì)含量為30%左右,且是一種營養(yǎng)健康安全的植物蛋白。小肽能夠促進(jìn)動(dòng)物腸道系統(tǒng)的早期快速發(fā)育,對患有胃腸疾病動(dòng)物的營養(yǎng)吸收、維護(hù)腸道健康、補(bǔ)充動(dòng)物在快速生長期和高產(chǎn)期對氨基酸的需求具有重要意義[14],將牡丹籽粕蛋白降解為更容易被吸收利用的小肽同時(shí)可解決適口性問題。本試驗(yàn)借鑒大豆肽的生產(chǎn)工藝,采用堿性蛋白酶直接酶解牡丹籽粕蛋白,制備牡丹籽粕小肽飼料。通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)對影響牡丹籽粕蛋白酶解的因素進(jìn)行考察,獲得最佳工藝條件為:pH=7.5,酶解溫度為60℃,酶濃度為1.2%,反應(yīng)時(shí)間為3.0 h,牡丹籽粕蛋白水解度為17.18%。

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