花生根際土壤細(xì)菌群落多樣性對鹽脅迫的響應(yīng)

戴良香 徐 揚(yáng) 張冠初 史曉龍 秦斐斐 丁 紅,* 張智猛,*

花生根際土壤細(xì)菌群落多樣性對鹽脅迫的響應(yīng)

戴良香1,**徐 揚(yáng)1,**張冠初1史曉龍2秦斐斐1丁 紅1,*張智猛1,*

1山東省花生研究所, 山東青島 266100;2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 遼寧沈陽 110866

為明確鹽脅迫條件下花生根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化, 采用盆栽試驗設(shè)置不同鹽脅迫強(qiáng)度處理, 以開花下針期和成熟期花生根際土壤為研究對象, 提取其總DNA并構(gòu)建細(xì)菌16S rRNA基因文庫, 利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序, 并對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示, 各處理樣本根際土壤優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、Patescibacteria、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)。優(yōu)勢菌目分別為(Saccharimonadales)、β-變形菌目(Betaproteobacteria)、鞘脂單胞菌目(sphingomonadales)、芽單胞菌目(Gemmatimonadales)和根瘤菌目(Rhizobiales)。鹽脅迫提高了變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度, 但降低了放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度, 且均隨鹽脅迫強(qiáng)度提高其升降幅度增大。鹽脅迫下基施鈣肥使β-變形菌目(Betaproteobacteria)、芽單胞菌目(Gemmatimonadales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)相對豐度顯著升高, 并均受鹽脅迫強(qiáng)度、生育時期和外源施鈣肥的影響。聚類分析結(jié)果表明, 較高濃度鹽脅迫處理樣本的優(yōu)勢菌屬組成相似而聚為一組, 非鹽脅迫處理樣本屬水平豐度依生育時期相同而相近, 各聚為一組。鹽脅迫強(qiáng)度、生育時期對花生根際土壤微生物菌群類型影響較大, 基施鈣肥影響較小。土壤微生物功能預(yù)測分析顯示, 高鹽脅迫可明顯降低次生代謝產(chǎn)物、聚糖的生物合成與代謝, 以及氨基酸和脂肪酸代謝等功能基因在根際土壤中的富集?；ㄉ⑸L期、低鹽脅迫和基施鈣肥處理使得功能基因豐度大幅提高, 可能對花生生長及脅迫應(yīng)答具有重要功能。根際土壤微生物菌群多樣性的研究將為通過改良土壤微生物環(huán)境來提高植物脅迫耐受性提供重要途徑。

花生; 鹽脅迫; 根際; 土壤微生物群落; 16S rRNA基因

土地鹽漬化已經(jīng)成為世界性的資源環(huán)境問題之一, 是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的巨大環(huán)境壓力, 每年造成數(shù)十億農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失[1]。我國土壤鹽堿化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重, 鹽堿地面積約9.91×107hm2, 主要分布于氣候比較干旱的山東、河北、河南、新疆等省區(qū), 大部分處于待開發(fā)狀態(tài), 是制約該區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的首要因素[2]?；ㄉ俏覈匾挠土献魑锖徒?jīng)濟(jì)作物, 具有耐瘠、固氮、培肥地力和中度耐鹽堿等特性, 可作為鹽堿土區(qū)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中較為適宜的替代作物; 同時, 限制鹽堿地花生高產(chǎn)的關(guān)鍵是缺苗、早衰和養(yǎng)分失衡。因此, 擴(kuò)大鹽堿地花生種植面積, 提高產(chǎn)量, 加強(qiáng)花生抗鹽生理機(jī)制研究顯得更為迫切。鹽堿土壤性質(zhì)的改善主要通過減少土壤中鹽離子含量、改善土壤結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)土壤酸堿度、增加土壤中可被植物利用營養(yǎng)元素含量等途徑, 提高土壤肥力, 通常以石膏、磷石膏、硅酸鈣和工業(yè)生產(chǎn)中含鈣廢棄物等為主要原料, 或配施有機(jī)物料為改良劑進(jìn)行鹽堿地改良。微生物菌劑與磷石膏聯(lián)合施用改良鹽堿土能夠增強(qiáng)鹽堿土的改良效果[3]。目前國內(nèi)外改良鹽堿土技術(shù)主要包括物理改良、水利工程改良、化學(xué)改良和生物改良等, 但費(fèi)用高、見效慢、推廣難, 嚴(yán)重制約了鹽堿土區(qū)種植業(yè)結(jié)構(gòu)的抗風(fēng)險能力和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。

植物根際微生境是土壤中活性最強(qiáng)的微生境, 也是植物獲取養(yǎng)分的主要區(qū)域。在此微域里, 植物—微生物—土壤—環(huán)境間相互作用, 共同維持著根際微生態(tài)系統(tǒng)的平衡, 影響作物生產(chǎn)[4]。研究表明, 鹽脅迫使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化, 植物根際微生態(tài)區(qū)系失衡, 可能涉及到某些功能菌群、有益菌群和有害菌群比例的平衡失調(diào)[5]。根際微生物類型和其群落組成受鹽脅迫及程度的影響, 其數(shù)量和群落組成與環(huán)境和植物種類有關(guān)[6], 施用鈣肥可改善鹽堿土壤結(jié)構(gòu)、降低Na+含量、調(diào)節(jié)pH[3]。關(guān)于鹽堿土壤微生物群落的研究主要集中在不同植物群落土壤微生物的時空動態(tài)和區(qū)系特征[7-8]、微生物量與土壤酶[9]、不同改良措施及植被類型對鹽堿土壤微生物的影響效果等[9-12], 有關(guān)不同鹽脅迫強(qiáng)度下配施鈣肥對花生根際微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)及其生態(tài)關(guān)系的研究鮮見報道, 為此, 本試驗以不同鹽脅迫強(qiáng)度下配施鈣肥處理的花生根際土壤為研究對象, 利用高通量測序技術(shù)對土壤中細(xì)菌種類及多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析, 探討鹽脅迫下不同生育時期花生根際土壤細(xì)菌群落組成和多樣性的變化, 有助于認(rèn)識鹽堿地花生根際土壤微生物群落功能調(diào)節(jié)并發(fā)掘新的功能類群, 對改良鹽堿土壤和開發(fā)利用鹽堿土區(qū)資源、提高鹽堿土區(qū)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)抗風(fēng)險能力及鹽堿地花生高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培均具重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用山東省花生研究所萊西試驗站耕層土壤(0~30 cm)作為供試土壤, 含土壤有機(jī)質(zhì)含量13.23 g kg-1、全磷(P2O5) 0.84 g kg-1、全鉀(K2O) 11.53 g kg-1、全氮1.70 g kg-1、水解氮(N) 92.1 mg kg-1、速效磷(P2O5) 11.7 mg kg-1、速效鉀(K2O) 112.2 mg kg-1, 土壤pH 7.1, 土壤交換性Na+0.82 cmol kg-1, Cl–28.5 mg kg-1, 土壤含水量9.72%。選擇花生品種花育25號(HY25)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于山東省花生研究所試驗站防雨棚中進(jìn)行,土壤風(fēng)干、過篩(1 cm)后裝入同批次、同規(guī)格塑料盆中(底部直徑為36 cm, 高為26 cm), 每盆裝土量為18 kg。設(shè)置0 (Y0)、1.5 (Y1)、3.0 g kg-1(Y2) 3個鹽脅迫梯度, 采用分析純NaCl重量法控制鹽脅迫梯度。各處理均配合基施鈣肥(分析純CaO) 150 kg hm-2(C, 150 kg hm-2CaO), 以過篩后不施鈣肥的土壤為對照, 隨機(jī)排列, 6次重復(fù)。播種前將供試肥料按N∶P2O5∶K2O = 1.0∶1.5∶1.5 (15.0、22.5、22.5 kg hm-2)比例連同CaO以基肥形式均勻施入盆中。隨后各處理均澆入2 L清水沉實(shí), 待土壤墑情適宜時再次混勻每盆中的土壤, 以使土壤含鹽量和施入的鈣肥均勻分布。選取飽滿均勻的種子, 每盆播6粒, 播深均為3 cm, 留4株長勢一致的幼苗。

分別于開花下針期(播后75 d)和收獲期(播后125 d)以處理和重復(fù)為單位采集花生植株根際土壤樣本。根際土壤樣本的采集以處理為單元進(jìn)行, 采用多點(diǎn)混合樣本采集方法, 以盆為單位分別小心地從盆中取出植株, 去除根際附著不緊密的土壤, 然后用無菌刷收集附著緊密的土壤, 混合每盆中植株根際土壤, 每3重復(fù)根際土壤樣品混合為1個生物學(xué)樣本重復(fù), 每處理均獲取2個生物學(xué)重復(fù), 封入無菌袋, 置于冰盒帶回實(shí)驗室, 保存于-80℃冰箱備用。于收獲期, 各處理收獲實(shí)測計產(chǎn), 室內(nèi)考察花生出米率、百果質(zhì)量、百仁質(zhì)量和莢果產(chǎn)量。

開花下針期各處理土壤樣本分別表示為CK、CY0、CY1、CY2, 收獲期各處理土壤樣本分別表示為HCK、HCY0、HCY1、HCY2。由北京諾賽基因公司進(jìn)行相關(guān)測試。

1.3 土壤DNA提取

收集所得土壤樣品, 利用OMEGA土壤總DNA提取試劑(OMEGA soil DNA kit)盒提取DNA。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

1.4 16srRNA文庫構(gòu)建及高通量測序

以提取的土壤樣本DNA為模板, 利用引物340F: 5￠-CCTACGGGNBGCASCAG-3￠以及805R: 5￠-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3￠, 對土壤細(xì)菌16s rRNA基因V3~V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃30 s, 50℃30 s, 72℃60 s, 30個循環(huán); 72℃7 min。使用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物; 根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣, 充分混勻后, 使用0.5×TBE濃度1.5%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物, 割膠回收目標(biāo)條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用QIAGEN公司的MinElute膠回收試劑盒。最后使用HiSeq2500進(jìn)行250PE測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

對花生根際土壤微生物的多樣性和豐富度進(jìn)行樣本內(nèi)物種多樣性即Alpha多樣性和樣本間Beta多樣性分析, 包括繪制稀釋性曲線(Rarefaction curve)和分析Alpha多樣性指數(shù)(包括Chao、Shannon、ACE、Simpson、coverage和sobs等指數(shù))。同時進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析和基于OTUs的物種組成聚類分析(heatmap分析), 最后, 進(jìn)行反映樣本間的多樣性距離關(guān)系和生物群落間分化程度的Beta多樣性分析(PCA統(tǒng)計分析), 挖掘樣本間物種組成差異和生物功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對莢果性狀和產(chǎn)量的影響

由表1可知, 鹽脅迫處理明顯影響花生出米率、百果質(zhì)量、百仁質(zhì)量和莢果產(chǎn)量, 并隨鹽脅迫程度的提高作用顯著, 施用鈣肥可顯著提高無鹽脅迫處理下的百果質(zhì)量和莢果產(chǎn)量, 對出米率和百仁質(zhì)量有促進(jìn)作用但不顯著。鹽脅迫處理下百仁質(zhì)量較CK和CY0分別降低12.94%、20.44%和38.70%、43.98%, 較高鹽脅迫處理的莢果產(chǎn)量僅為CK處理的1/2, CY0處理下產(chǎn)量是CY2處理2.5倍。表明鹽脅迫嚴(yán)重抑制花生籽仁發(fā)育和產(chǎn)量形成。

表1 施鈣對鹽脅迫下花生產(chǎn)量及構(gòu)成因素的影響

CK、CY0、CY1、CY2分別表示開花下針期對照和各鹽脅迫梯度下施鈣肥各處理根際樣本; HCK、HCY0、HCY1、HCY2分別表示收獲期相應(yīng)鹽脅迫下各處理土壤樣本。同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(< 0.05)。

CK, CY0, CY1, and CY2 represent the rhizosphere samples of each treatment with calcium fertilizer under each salt stress gradient at the needle stage at the flowering and needle stage, respectively; HCK, HCY0, HCY1, and HCY2 represent the soil samples of each treatment under the corresponding salt stress at the harvest stage, respectively. Values within a column followed by different lowercase letters mean significant differences among the treatments at the 0.05 probability level.

2.2 花生根際微生物群落測序數(shù)據(jù)分析

供試的16個根際土壤樣本共檢測出細(xì)菌30個門、73個綱、204個目、351個科、650個屬和1279個種。獲得有效序列1,187,782.5條, 其中HCY2樣本有效序列條數(shù)最小為127,455.5條, CY0樣本最大為174,409.0條, 多數(shù)樣本序列平均長度在445.0~452.0 bp之間, 平均長度482.0 bp (表2)。通過維恩圖分析, 各處理根際土壤樣本共有2446個OTUs, 存在于CY1、CK、CY2中的OTUs數(shù)分別為29、25和23個, 而HCK、HCY0和HCY2處理樣本中均不足10個, 表明各處理樣本微生物組成相似, 鹽脅迫強(qiáng)度、外源施鈣肥和生育時期對根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均無顯著影響(圖1)。

表2 花生根際微生物群落測序質(zhì)量

處理同表1。Treatments are the same as those given in Table 1.

處理同表1。Treatments are the same as those given in Table 1.

2.3 Alpha多樣性分析

2.3.1 稀釋曲線 由圖2可知, 隨測序數(shù)據(jù)量的增加, 物種豐富度呈現(xiàn)前期迅速增加的趨勢, 各處理樣本在測序量達(dá)到30,000條以上時, 稀釋曲線趨近平緩, 各樣本微生物群落測序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和, 測序量能夠覆蓋花生根際微生物組群落的絕大部分物種。各處理樣本重復(fù)間取其均值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn), 對照、鹽脅迫強(qiáng)度和生育時期及外源施用鈣肥各處理OTUs數(shù)量基本一致, 相互間均無顯著差異。

2.3.2 多樣性指數(shù) 由表3可知, 供試樣本的coverage測序深度指數(shù)均在98.90%以上, 樣本微生物群落中OTUs的chao和ACE菌群豐富度指數(shù)分別在3522.40~3762.58和3448.57~3685.00之間, Shannon多樣性指數(shù)為6.57~7.11, Simpson和sobs指數(shù)分別在0.001,946~0.005,682和3113.00~3428.50之間。ACE、chao和sobs指數(shù)均以CK處理最小, ACE、chao豐富度指數(shù)以CY2處理最大, 而Shannon和sobs指數(shù)則均以CY0最高?？梢? 配施鈣肥可提高鹽脅迫下花生根際微生物群落豐富度和多樣性, 且對開花下針期的影響作用優(yōu)于收獲期, 無鹽脅迫下施用鈣肥處理根際土壤細(xì)菌多樣性更為豐富。

2.4 物種群落組成分析

2.4.1 全樣本門水平菌落結(jié)構(gòu)分析 所有樣本細(xì)菌群落組成的30個門中, 其Top10 (others合并< 0.025)相對豐度之和達(dá)93.40%。優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、Patescibacteria、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等8種, 其相對豐度均在5.17%以上, 其中以變形菌門(Proteobacteria)平均相對豐度最高(31.70%), 放線菌門(Actinobacteria)次之(16.12%), 綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)分別為8.23%、8.65%。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)僅為變形菌門(Proteobacteria)的16.32% (圖3-A)。鹽脅迫提高根際變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度, 降低放線菌門(Actinobacteria)豐度且均隨鹽脅迫強(qiáng)度提高其升降幅度增大, 尤以開花下針期作用明顯, 并均受外源配施鈣肥的正向調(diào)節(jié), 開花下針期和收獲期不施鈣肥和施鈣肥高鹽脅迫處理的變形菌門(Proteobacteria)相對豐度較其對照分別提高27.00%、10.46%和32.44%%、50.09%, 而放線菌門(Actinobacteria)豐度較其對照分別降低55.58%、48.83%和40.90%、28.87%。較高鹽脅迫處理的擬桿菌門豐度明顯升高, 并以收獲期較為明顯。

處理同表1。Treatments are the same as those given in Table 1.

處理同表1。Treatments are the same as those given in Table 1.

對各處理根際樣本進(jìn)行優(yōu)勢門(Top10) (圖3-B)組間差異顯著性檢驗分析表明, 各處理間均呈顯著或極顯著差異。生育時期、施用鈣肥和鹽脅迫各因子均使得花生根際微生物群落分異明顯。

2.4.2 全樣本目水平菌落結(jié)構(gòu)分析 所有樣本共包含204個菌目, 其中Top16 (others合并<0.03)相對豐度之和達(dá)60.40%, 相對豐度在5.0%以上的優(yōu)勢菌目分別為Saccharimonadales (7.94%)、β-變形菌目(Betaproteobacteria, 7.42%)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales, 6.41%)、芽單胞菌目(Gemmatimonadales, 5.08%)和根瘤菌目(Rhizobiales, 5.00%)。除優(yōu)勢菌目β-變形菌目(Betaproteobacteria)和外, 其他優(yōu)勢菌目開花下針期樣品的相對豐度均明顯低于收獲期。鹽脅迫下基施鈣肥使β-變形菌目(Betaproteobacteria)、芽單胞菌目(Gemmatimonadales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)豐度顯著升高, 而Saccharimonadales、微球菌目()菌目相對豐度顯著降低, 并隨鹽脅迫強(qiáng)度升高其相對豐度呈降低趨勢, 且收獲期降幅較大(圖4-A)。

處理同表1。*、**、***分別表示處理間達(dá)0.05、0.01和0.001顯著性水平。

Treatments are the same as those given in Table 1. *, **, and *** indicate significant differencesatthe 0.05, 0.01, and 0.001 levels, respectively.

處理同表1。*、**、***分別表示處理間達(dá)0.05、0.01和0.001顯著性水平。

Treatments are the same as those given in Table 1. *, **, and *** indicatesignificant differences at the 0.05, 0.01, and 0.001levels, respectively.

各樣本細(xì)菌群落目水平物種組成heatmap圖顯示, 不同處理根際樣本細(xì)菌目水平豐度高低有異, CY1處理的β-變形菌目、土圈菌目(Pedosphaerales)和unclassified_k__norank_d__Bacteria菌目豐度均顯著升高, CY2、HCY2兩處理均使β-變形菌目和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)豐度明顯升高, 而HCY0和HCK則使Saccharimonadales菌目豐度升幅極為明顯。聚類樹分析結(jié)果表明, 同一生育時期根際樣本優(yōu)勢菌目組成較為相似聚為一類, 鹽脅迫處理與非鹽脅迫處理根際樣本中的優(yōu)勢菌目組成存在差異各聚為一類(圖4-B)。對各處理根際樣本進(jìn)行優(yōu)勢目(Top10) (圖4-C)組間差異顯著性檢驗分析表明, 除根瘤菌目(Rhizobiales)外各處理間均呈顯著或極顯著差異。

2.4.3 全樣本屬水平菌落結(jié)構(gòu)分析 各樣本共包含650個菌屬, 其中、鞘氨醇單胞菌屬)、、、芽單胞桿菌屬()、等6種為優(yōu)勢菌屬。各處理樣本中的和兩優(yōu)勢菌屬豐度隨鹽脅迫強(qiáng)度升高而升高,、、和非優(yōu)勢菌屬菌屬則均隨脅迫強(qiáng)度升高而降低,和兩生育時期分別較其相應(yīng)對照降低72.27%、67.08%和81.20%、51.75%, 非優(yōu)勢菌屬羅河桿菌屬()和豐祐菌屬()相對豐度則均隨鹽脅迫強(qiáng)度增加顯著升高, 分別是相應(yīng)對照的1.31、4.23倍和3.02、2.55倍。鹽脅迫顯著影響不同生育時期根際土壤細(xì)菌群落組成, 尤以收獲期優(yōu)勢菌群豐度降低顯著, 而非優(yōu)勢菌群豐度往往升幅明顯(圖5-A)。

各樣本細(xì)菌群落屬水平物種組成heatmap圖和聚類樹分析結(jié)果表明, 較高濃度鹽脅迫處理樣本優(yōu)勢菌屬組成相似聚為一組, 非鹽脅迫處理樣本屬豐度依生育時期相同而相近, 各聚為一組, 1.5 g kg-1較低鹽脅迫處理根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌屬較為豐富(圖5-B)。

2.5 樣本間Beta多樣性分析

通過PCA分析發(fā)現(xiàn), 各處理樣本分布于不同象限, 其細(xì)菌群落組成具有明顯差異, PC1和PC2對結(jié)果的解釋度分別為25.88%和15.87%, 二者分別由生育時期因子和鹽脅迫因子貢獻(xiàn)。HCK和HCY0與第1、第2主成分均呈正相關(guān)關(guān)系, CY2和CY1則與第1、第2主成分均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, HCY1和HCY2與第1主成分為正相關(guān)關(guān)系而與第2主成分為負(fù)相關(guān)關(guān)系, 而CY0和CK則與之相反(圖6-A)。說明鹽脅迫、生育時期和施鈣肥與否對根際土壤微生物菌群類型影響較大。層級聚類分析表明, 依生育時期聚為兩大類的同時, 又以鹽脅迫及其強(qiáng)度各聚一簇, 開花下針期受鹽脅迫強(qiáng)度影響較小, 成熟期根際土壤微生物菌群類型影響較大(圖6-B)。對種水平上菌群分型分析結(jié)果亦表明, 鹽脅迫強(qiáng)度、生育時期對花生根際土壤微生物菌群類型影響較大, 基施鈣肥影響較小(圖6-C)。

處理同表1。Treatments are the same as those given in Table 1.

處理同表1。Treatments are the same as those given in Table 1.

2.6 16S功能預(yù)測分析

通過KEGG代謝途徑的預(yù)測差異分析發(fā)現(xiàn), CK、HCK、HCY2處理樣本中微生物群落的功能豐度均明顯降低, 尤以次生代謝產(chǎn)物的代謝與合成(丙酸酯代謝、2-氧代羧酸代謝、乙醛酸和二羧酸酯代謝、氨酰基-tRNA的生物合成)、聚糖的生物合成與代謝(糖酵解/糖異生、氨基糖和核苷酸糖代謝)、氨基酸代謝(半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、甘氨酸, 絲氨酸和蘇氨酸的代謝)、脂肪酸代謝等功能基因的豐度降低顯著。CY0、CY1、CY2、HCY0和HCY1樣本中各功能基因豐度均相對升高, 尤以CY1和HCY0升高明顯(圖7)。表明無鹽脅迫和全生育期高強(qiáng)度鹽脅迫可明顯降低次生代謝產(chǎn)物的代謝與合成、聚糖的生物合成與代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝等功能基因在根際土壤中的富集, 花生旺盛生長期、低鹽脅迫和基施鈣肥處理使得功能基因豐度大幅提高。

處理同表1。Treatments are the same as those given in Table 1.

3 討論

根際微生物是土壤—根系間養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)器, 土壤微生物群落多樣性反映了群落總體的動態(tài)變化。植被對土壤微生物群落的數(shù)量具有顯著正向的影響, 鹽脅迫下, 除土壤微生物生長受到抑制, 植物本身的生理機(jī)能也迅速遭到破壞, 根際土壤細(xì)菌群落的豐富度顯著降低[13-14], 隨鹽脅迫強(qiáng)度增加微生物種群數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性明顯降低[15-17]。耐鹽植物根際土壤微生物量隨種植時間的延長而增加并顯著高于非根際土壤[18-19]。但不同鹽堿地類型花生根際土壤微生物種類、優(yōu)勢種群數(shù)量和群落功能多樣性存在差異, 含鹽量較高土壤更為豐富。黃河三角洲濱海鹽堿土和不同含鹽量的鹽堿土花生根際土壤微生物優(yōu)勢菌門均以變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)等4種菌群為優(yōu)勢菌群[20]。鹽堿土花生根際芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度顯著高于非鹽堿土壤約2倍[21]。本試驗條件下, 鹽脅迫強(qiáng)度和花生生長期不影響花生根際細(xì)菌群落多樣性和豐富度, 各處理微生物種群數(shù)量和優(yōu)勢菌群無差異, 但對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成有影響。各處理優(yōu)勢菌門均為變形菌門、放線菌門、Patescibacteria、酸桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門和擬桿菌門。優(yōu)勢菌目為Saccharimonadales、β-變形菌目、鞘脂單胞菌目、芽單胞菌目和根瘤菌目。鹽脅迫使根際微生物優(yōu)勢菌群數(shù)量明顯增加, 旺盛生長的開花下針期較為明顯。

耐鹽植物根際環(huán)境中細(xì)菌群落組成與耐鹽性有關(guān), 鹽生植物根際細(xì)菌群落受土壤鹽分的影響較小[22]。鹽脅迫顯著提高可加快碳氮循環(huán)的藍(lán)藻菌門的含量, 而益于花生抵御逆境脅迫[20]。中度耐鹽植物根際環(huán)境中耐鹽性較高的變形菌門和厚壁菌門豐度較高, 輕度耐鹽植物根際環(huán)境中酸桿菌門和芽單胞菌門較豐富, 說明酸桿菌門和芽單胞菌門不具耐鹽性或更易受高鹽影響。本試驗條件下, 花生根際土壤優(yōu)勢菌群除變形菌門和酸桿菌門外, 還包括放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和疣微菌門。酸桿菌門在土壤生態(tài)過程中起著重要作用, 變形菌門的增多可更有效固定氮源。放線菌門具有共生固氮和解磷作用[23-26], 綠彎菌存在于根際土壤樣本中, 通過光合作用產(chǎn)生能量但不能固氮, 但具有較好的生物解磷作用[27-28]。擬桿菌門具有非常強(qiáng)的營養(yǎng)物質(zhì)代謝能力, 如復(fù)雜有機(jī)物、蛋白質(zhì)和脂類等[29]。解磷菌懸液可顯著增加鹽堿土壤酶活性和土壤微生物數(shù)量, 促進(jìn)與土壤營養(yǎng)元素循環(huán)相關(guān)的菌屬酸桿菌(Acidobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)等微生物群落富集, 全面改善鹽堿土性質(zhì), 促進(jìn)植株生長[3]。本試驗結(jié)果表明, 鹽脅迫顯著影響不同生育時期根際土壤細(xì)菌群落組成, 尤以收獲期優(yōu)勢菌屬豐度降低顯著, 而非優(yōu)勢菌屬豐度往往升幅明顯。開花下針期β-變形菌目(Betaproteobacteria)和芽單胞菌目(Gemmatimonadales)明顯高于收獲期。表明花生不同生長期和外源施鈣對鹽脅迫下花生根際微生物群落具有適應(yīng)性和調(diào)節(jié)功能, 根際土壤較高的變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門可能有助于維持根系養(yǎng)分吸收和微環(huán)境的平衡, 以改善土壤環(huán)境, 增強(qiáng)抵御鹽脅迫的能力, 是鹽堿土區(qū)生物改良鹽脅迫的寶貴資源。同時, 鹽脅迫可大幅提高變形菌門、擬桿菌門的相對豐度, 且配施鈣肥的調(diào)節(jié)作用明顯增強(qiáng)并保持花生全生育期, 從而改善了花生根際氮磷及營養(yǎng)物質(zhì)代謝的動態(tài)平衡而增強(qiáng)了對鹽脅迫的抵御作用。

土壤類型和花生根系分布密集程度對土壤微生物菌群類型影響較大, 鹽堿土壤花生根際微生物菌群類型依據(jù)土壤含鹽量高低和根系分布深度不同而聚為不同簇, 非鹽堿土壤、鹽堿土壤根系分布不同密集程度層0~20 cm、20~40 cm各歸為一類。非根際土壤與根際微生物群落分離明顯, 非根際土壤群落之間, 以及根際土壤群落之間各具有較高的相似性[20,30-31]。本試驗條件下層級聚類分析表明, 生育時期、鹽脅迫及強(qiáng)度各聚為一簇, 花生根際土壤微生物菌群類型受鹽脅迫強(qiáng)度和生育時期影響較大, 基施鈣肥影響較小, 并以花生生育末期根際微生物菌群類型受影響較大。

16S功能預(yù)測顯示, 鹽脅迫影響花生根際微生物群落的功能豐度譜, 尤以某些代謝與合成相關(guān)功能如次生代謝產(chǎn)物的代謝與合成、聚糖生物合成與代謝、氨基酸代謝等功能基因豐度變化明顯。在非鹽脅迫和全生育期高強(qiáng)度鹽脅迫處理下, 這些次生代謝產(chǎn)物的代謝與合成、聚糖生物合成與代謝、氨基酸代謝等功能基因豐度顯著降低, 而在花生旺盛生長期、低鹽脅迫和基施鈣肥處理均使得這些功能基因豐度大幅提高。說明花生旺盛生長時期、較低的鹽脅迫強(qiáng)度和外源鈣肥均可提高花生根際微生物與代謝與合成相關(guān)功能基因豐度, 以抵御鹽脅迫逆境。然而, 花生根際微生物的富集與代謝和合成相關(guān)的功能基因不足以抵抗全生育期內(nèi)高強(qiáng)度鹽脅迫逆境, 致使花生產(chǎn)量顯著降低。

4 結(jié)論

花生根際土壤微生物優(yōu)勢菌群組成結(jié)構(gòu)不受鹽脅迫和生育時期影響, 但其相對豐度與鹽脅迫強(qiáng)度有關(guān), 隨鹽脅迫強(qiáng)度的提高, 變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度和放線菌門(Actinobacteria)豐度升降幅度增大。鹽脅迫強(qiáng)度、生育時期對花生根際土壤微生物菌群類型影響程度大于基施鈣肥處理?；ㄉ⑸L時期和基施鈣肥使得鹽脅迫下花生根際微生物菌群功能基因豐度大幅提高, 高鹽脅迫明顯降低次生代謝產(chǎn)物、聚糖的生物合成與代謝, 以及氨基酸和脂肪酸代謝等功能基因在根際土壤中的富集。通過改良根際土壤微生物環(huán)境提高植物耐鹽脅迫能力是生物改良鹽堿脅迫的可行途徑。

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Response of rhizosphere bacterial community diversity to salt stress in peanut

DAI Liang-Xiang1,**, XU Yang1,**, ZHANG Guan-Chu1, SHI Xiao-Long2, QIN Fei-Fei1, DING Hong1,*, and ZHANG Zhi-Meng1,*

1Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong, China;2College of Agronomy, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China

To characterize the peanut rhizosphere bacteria community in response to salt stress, a pot experiment was performed with different salt concentrations. The peanut rhizosphere soils at flowering and mature stages were sampled to extract DNA for constructing bacterial 16S rRNA gene library, and then high-throughput sequencing was performed for sequencing and bioinformatics analysis. The results showed thatProteobacteria, Actinobacteria, Patescibacteria, Acidobacteria, and Chloroflexi were the dominant phyla, and the orders Saccharimonadales, Betaproteobacteria, Sphingomonadales, Gemmatimonadales, and Rhizobiales were dominated in the peanut rhizosphere soils. Comparisons of the bacterial community structure of peanuts revealed that the relative abundance of Proteobacteria dramatically increased, while that of Actinobacteria decreased in salt-treated soils, and the fluctuation increased with the increase of the salt concentration. Moreover, applying calcium fertilizer under salt stress increased the abundance of Betaproteobacteria, Gemmatimonadales, and Sphingomonadales, which were affected by salt stress, growth stages, and exogenous calcium application. Cluster analysis revealed that the dominant bacteria of soil groups with high salt concentration were similar and clustered together, while the soil samples of the same growth period were similar and clustered together according to the bacterial structure at the genus level under non-salt stress conditions. Bacterial community structure differed in the growth stages and soil salt concentrations, whereas the differences of soil groups with or without calcium application were relatively small. Function prediction analysis indicated that the sequences related to secondary metabolites, glycan biosynthesis and metabolism, and amino acid and lipid metabolism were enriched in high salt-treated soils. The functional groups increased significantly during the fast-growth period, low salt stress, and basal calcium fertilizer treatments, which may play an important role on the growth and stress response in peanut. This study of microbial communities could lay the foundation for future improvement of stress tolerance of peanuts via modification of the soil microbes.

peanut (); salt stress; rhizosphere; soil microbial community; 16S rRNA gene

10.3724/SP.J.1006.2021.04160

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31971856,31971854, 31901574), 山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(花生)項目(SDAIT-04-06), 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項目(CXGC2018B05)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31971856, 31971854, 31901574), the Modern Agricultural Industry Technical System of Shandong Province (SDAIT-04-06), and the Agricultural Scientific and Technological Innovation Project of Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2018B05).

張智猛, E-mail: qinhdao@126.com; 丁紅, E-mail: dingpeanut@163.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

戴良香, E-mail: liangxiangd@163.com

2020-07-17;

2021-01-13;

2021-02-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210216.1438.004.html