復合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵香腸中N-亞硝胺形成的抑制作用

孫學穎，辛曉琦，劉建林，靳 燁，趙麗華

（內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院 呼和浩特010018）

發(fā)酵香腸是指將去除筋膜的動物肉和脂肪絞碎，添加發(fā)酵劑、食鹽、香辛料等充分攪拌均勻后灌腸，在自然或人工控制條件下，經(jīng)發(fā)酵制成的具有獨特風味、可長期貯藏的發(fā)酵肉制品[1]。為了賦予香腸更好的色澤、風味及安全性，通常加入硝酸鹽或亞硝酸鹽進行腌制。硝酸鹽可被還原生成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽可與二級胺經(jīng)亞硝基化作用，在體內、體外結合生成亞硝胺[2-3]。目前已證實90%N-亞硝基化合物中可誘導不同器官的腫瘤，嚴重危害健康[4]。長時間小劑量攝入或者一次高劑量攝入亞硝胺類化合物，均可導致癌癥的發(fā)生，而且它們誘發(fā)的腫瘤可以在任何器官，甚至還能通過胎盤和乳汁引起后代癌變[5]。由于原料肉中富含蛋白質和氨基酸，經(jīng)蛋白酶和氨基酸脫羧酶作用會生成某些胺類物質，香腸在發(fā)酵階段溫度升高導致酶活升高，促進胺類物質的生成，而胺類物質為N-亞硝胺形成的底物[6]，因此在發(fā)酵香腸制作過程中控制N-亞硝胺含量對于食品安全和品質控制具有十分重要的意義。

目前亞硝胺的控制研究主要集中在阻斷N-亞硝胺的形成、促進N-亞硝胺的分解、減少N-亞硝胺的前體物質3 個方面，主要從原料及加工工藝[7]、發(fā)酵劑[8]、外源添加物（香辛料及植物提取物等）進行控制[8-10]。其中，接種優(yōu)良發(fā)酵劑和添加香辛料是目前控制發(fā)酵肉制品中亞硝胺最常見、最有效的方法。研究表明，接種發(fā)酵劑可有效控制亞硝酸鹽、生物胺和亞硝胺含量[11]。接種發(fā)酵劑菌株可降低亞硝酸鹽殘留量[12]，如商業(yè)發(fā)酵劑PROMIX5 和LC 單菌均能顯著降低9 種N-亞硝胺總量[13]。研究表明，香辛料提取物對風干腸中亞硝酸鹽和亞硝胺具有明顯的清除和阻斷作用，由強到弱的依次是桂皮、丁香和花椒[14]，這是由于香辛料提取物通過氧化-還原反應降低亞硝酸鹽積累，從而阻斷亞硝胺的形成。發(fā)酵劑種類和不同香辛料均會對肉制品中N-亞硝胺的抑制效果產(chǎn)生很大的影響，目前發(fā)酵劑和香辛料共同作用的研究報道較少。

在本試驗腌制過程中分別添加香辛料、接種復合發(fā)酵劑或將二者同時添加，經(jīng)發(fā)酵、干燥、成熟制得發(fā)酵劑組、沙蔥+孜然組和沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組4 組發(fā)酵香腸產(chǎn)品，通過對產(chǎn)品的pH 值、水分活度、微生物指標、亞硝酸鹽、生物胺和N-亞硝胺等相關指標的測定，同時與對照組相比，分析復合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵羊肉香腸安全品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇尼特羊后腿肉、羊尾脂肪采于內蒙古烏拉特中旗。復合發(fā)酵劑配比為V木糖葡萄球菌∶V肉葡萄球菌∶V37X-3∶V37X-6=1∶1∶2∶1[15]；木糖葡萄球菌（編號CICC 22943），中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；肉葡萄球菌（編號CIMT.044），廣東省微生物菌種保藏中心；戊糖片球菌（37X-3）和植物乳桿菌（37X-6），內蒙古農業(yè)大學“肉品科學與技術”團隊提供。孜然粉，購于呼和浩特市華聯(lián)超市；沙蔥，購于鄂爾多斯市，于60℃條件下烘干，粉碎后過40 目篩得沙蔥粉，備用。

N-亞硝胺標品、生物胺標品，美國Sigma 公司；乙腈、丙酮、乙酸銨、冰乙酸、亞硝酸鈉、甲醇、正己烷、丹磺酰氯，呼和浩特市達音商貿有限公司。乙腈、丙酮、乙酸銨、冰乙酸、甲醇為色譜純級，其余為分析純級。

1.2 儀器與設備

Agilent1260vwd 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-1800 型紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；日本EYELA MGS-2200C 氮吹儀，上海旦鼎國際貿易有限公司；ZWYR-240 臺式真彩觸摸屏搖床，南京依貝儀器設備有限公司；DSH-300A 回旋式水域恒溫振蕩器，上海雅榮生化設備儀器有限公司；ZXMP-A1430 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；KDC-14DHR 離心機，Eppendorf 中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵羊肉香腸的加工方法 各試驗組發(fā)酵香腸的工藝流程如下：

原料肉→將瘦肉絞碎、肥肉切丁→攪拌均勻（加入輔料）→腌制→灌腸→發(fā)酵→干燥→成熟（成品）。具體步驟是：

1）腌制 各組分別稱取攪碎的羊后腿肉1 600 g 和大小為1 cm×1 cm×1 cm 左右的羊尾脂肪400 g，對照組加入蔗糖8 g，葡萄糖8 g，食鹽40 g，硝酸鈉112 mg，亞硝酸鈉112 mg。發(fā)酵劑組按107CFU/g 接種復合發(fā)酵劑，沙蔥+孜然組添加沙蔥32 g、孜然48 g，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組接種復合發(fā)酵劑并添加沙蔥32 g、孜然48 g。攪拌均勻后在4℃條件下腌制12 h；

2）灌腸 將每組腸餡分別灌入直徑為26 mm 的膠原蛋白腸衣中，制成10 cm 長的香腸；

3）發(fā)酵 將制好的香腸轉移到恒溫恒濕箱中，于溫度30℃、相對濕度95%的條件下發(fā)酵48 h；

4）干燥 在溫度14℃、相對濕度85%條件下干燥72 h；

5）成熟 在溫度13℃、相對濕度75%條件下成熟72 h。

1.3.2 試驗設計本試驗設計分為4 組發(fā)酵香腸；對照組：不接種發(fā)酵劑、不添加沙蔥和孜然；發(fā)酵劑組：只接種復合發(fā)酵劑；沙蔥+孜然組：只加入沙蔥、孜然；沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組：接種復合發(fā)酵劑、添加沙蔥和孜然。

分別于腌制（0 d）、發(fā)酵（2 d）、干燥（5 d）、成熟（8 d）階段結束時取樣，測定pH 值、水分活度、微生物指標、亞硝酸鹽、生物胺和N-亞硝胺。

1.3.3 pH 值、水分活度的測定pH 值參照GB 5009.237-2016《食品pH 值的測定》[16]測定；水分活度參照GB 5009.238-2016《食品水分活度的測定》[17]測定。

1.3.4 亞硝酸鹽含量的測定 按照GB 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定發(fā)酵羊肉香腸中亞硝酸鹽的含量[18]。

1.3.5 生物胺含量的測定 按照GB 5009.208-2016《食品中生物胺的測定》測定羊肉發(fā)酵香腸中生物胺含量[19]。采用高效液相色譜儀聯(lián)合C18 柱子（柱長250 mm，柱內徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm）和紫外檢測器檢測生物胺的含量。樣品進樣量20 μL，流動相流速0.8 mL/min，柱溫35℃，紫外檢測波長254 nm。梯度洗脫程序：流動相A、B起始質量分數(shù)分別為60%，40%，保持22 min；第22 分鐘流動相A、B 分別為85%，15%，保持3 min；第25 分鐘流動相A 升至100%，保持7 min；第32.01 分鐘流動相A、B 質量分數(shù)為60%，40%，保持至第37 分鐘。色流動相A 為90%乙腈-10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液），流動相B 為10%乙腈-90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液）。

1.3.6 亞硝胺含量的測定 參照的溫演慶等[20]的方法略作改進。采用高效液相色譜儀聯(lián)合C18 柱子（柱長250 mm，柱內徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm）和紫外檢測器檢測。樣品進樣量10 μL，流動相流速0.8 mL/min，柱溫40℃，紫外檢測波長230 nm。梯度洗脫程序：流動相A、B 起始質量分數(shù)分別為90%，10%，保持5 min；第5 分鐘流動相A、B分別為80%，20%，保持15 min；第20 分鐘流動相A 降至30%，保持10 min；第30 分鐘流動相A 降至20%，保持10 min；第40 分鐘流動相A、B 質量分數(shù)為90%，10%，保持至第45 分鐘。流動相A 為緩沖液溶液，流動相B 為甲醇。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用軟件SPSS 18.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和顯著性差異分析，每個試驗重復3 次。統(tǒng)計學顯著性分析P＜0.05 表示差異性顯著。采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 復合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵羊肉香腸pH 值的影響

由圖1可看出，腌制結束后0 d，各組pH 值均在5.5 左右，無顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵結束后2 d，各組的pH 值降為最低值（P＜0.05）。其中發(fā)酵劑組pH 值降為4.69，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組pH 值最低為4.43。這可能是由于在發(fā)酵過程中，溫度升高，發(fā)酵劑迅速生長為香腸中的優(yōu)勢菌，增大了發(fā)酵速度，發(fā)酵劑代謝大量乳酸促使發(fā)酵香腸pH值下降。干燥階段（5 d）各組pH 值均升高且差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵劑組pH 值由4.64 升到4.84，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組pH 值由4.43 升到4.60?？赡苁巧呈[和孜然中的有效成分促進微生物及肉組織中的酶發(fā)揮作用，使發(fā)酵香腸中產(chǎn)生了一些堿性的含氮物質[21]。成熟后（8 d）各組pH 值均有適當回升，可能是由于碳水化合物被消耗，乳酸菌利用含氮化合物以及蛋白酶發(fā)生降解，形成蛋白質使堿性物質濃度增加所引起[18]?？傮w來說，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組發(fā)酵香腸加工過程中pH 值顯著降低（P＜0.05），可以一定程度上抑制腐敗菌的生長，保證產(chǎn)品的安全性[22]。

圖1 加工過程中復合發(fā)酵劑和香辛料處理組的發(fā)酵香腸pH 值的變化Fig.1 Changes of pH value on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.2 復合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵羊肉香腸水分活度的影響

低水分活度可提高發(fā)酵香腸貨架期和食用安全性。由圖2可知，隨著加工時間的變化，各組的aw值逐漸降低。腌制結束后0 d，各組發(fā)酵香腸的水分活度值在0.92 左右（P＜0.05）。發(fā)酵結束后2 d，發(fā)酵劑組的aw值為0.909，顯著低于其它組（P＜0.05）。在干燥結束后5 d，各組的aw值明顯下降（P＜0.05），且aw值均低于0.9。香腸成熟后8 d，各組的aw值明顯下降至0.8 左右（P＜0.05），可有效抑制腐敗微生物的生長。發(fā)酵劑組和沙蔥+孜然組的水分活度均低于對照組，水分活度的降低與pH值有關，pH 值的降低會使蛋白質發(fā)生凝膠化，香腸表面的水分會分散到空氣中，導致水分活度值降低[23]。

圖2 加工過程中復合發(fā)酵劑和香辛料處理組發(fā)酵香腸水分活度的變化Fig.2 Changes of water activity on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.3 復合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵羊肉香腸亞硝酸鹽的影響

由圖3可知，在香腸加工階段，隨著時間的延長，亞硝酸鹽含量逐漸降低，這與賈仁勇等[24]研究結果一致。在腌制結束后0 d，對照組和試驗組的亞硝酸鹽的含量差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵結束后2 d，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組亞硝酸鹽的含量顯著下降（P＜0.05）。在成熟結束8 d，試驗組亞硝酸鹽含量均低于對照組（P＜0.05），其中，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組為5.66 mg/kg，此時的aw值較低，微生物的作用小，亞硝酸鹽可能轉變成硝酸鹽，使亞硝酸鹽含量降低。以上說明孜然、沙蔥和發(fā)酵劑的共同作用使亞硝酸鹽減少效果最好。在試驗中添加的植物乳桿菌和戊糖片球菌起到關鍵作用，隨著pH 值的降低，亞硝酸鹽殘留量也降低，與梁鵬等[25]的研究結果一致。整個試驗過程中，各組的亞硝酸鹽殘留量低于國家規(guī)定30 mg/kg，亞硝酸鹽沒有超標，保障了香腸的安全問題[26]。

圖3 加工過程中復合發(fā)酵劑和香辛料處理組發(fā)酵香腸亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes in the contents of nitrite on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.4 復合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵香腸加工過程中生物胺含量的影響

由圖4a所示，酪胺含量呈先升后降的趨勢，添加復合發(fā)酵劑和香辛料可以抑制酪胺含量。在發(fā)酵結束2 d，各組的酪胺含量上升的速率明顯，說明這是具有酪氨酸脫羧酶活性菌株的活躍時期，可能是發(fā)酵階段環(huán)境溫度高，使具有脫羧酶的微生物活性增強，其中對照組酪胺含量顯著高于試驗組（P＜0.05）。干燥階段各組酪胺含量開始下降。至香腸成熟后8 d，發(fā)酵劑組、沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組發(fā)酵香腸酪胺含量顯著低于對照組（P＜0.05），其中發(fā)酵劑組的含量最低為9.746 mg/kg。前期研究表明，復合發(fā)酵劑菌株中的戊糖片球菌（37X-3）和植物乳桿菌（37X-6）具有降解酪胺的能力，減少發(fā)酵香腸中酪胺含量的積累[27]。與本研究類似，許女等[28]研究發(fā)現(xiàn)，接種植物乳桿菌到魚肉香腸中，可顯著降低生物胺的含量。有報道，香辛料對腐敗微生物具有一定的抑菌作用，而發(fā)酵肉制品中的生物胺一般由腐敗微生物（如腸桿菌、假單胞桿菌等）產(chǎn)生。沙蔥中存在著多糖、黃酮類化合物、生物堿和香精油等多種生物活性物質，對微生物的生長具有很強的抑制作用[29]。馬夢梅等[30]研究表明孜然中特征成分有孜然精油、蛋白、多酚、膳食纖維等，其中孜然精油、多酚均有抑菌作用。李偉等[31]研究表明孜然精油成分主要有枯茗醛和2-蒈烯-10-醛、3-蒈烯-10-醛、γ-松油烯等，均具有較強的抑菌能力。因此，將發(fā)酵劑和香辛料添加到發(fā)酵肉制品中可有效降低酪胺的含量。

組胺是發(fā)酵肉制品常見的8 種生物胺中毒性最大的生物胺。由圖4b所示，組胺的含量總體上呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵階段（2 d）是組胺迅速積累的時期，干燥階段（5 d）各組的組胺含量顯著下降，發(fā)酵劑組的組胺含量最低為3.376 mg/kg。香腸成熟后（8 d），各組的組胺含量持續(xù)下降，發(fā)酵劑組未檢出組胺。前期研究表明，復合發(fā)酵劑菌株中的戊糖片球菌（37X-3）和植物乳桿菌（37X-6）具有降解組胺的能力，減少發(fā)酵香腸中組胺含量的積累[27]。沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組的組胺含量為3.289 mg/kg，顯著低于其它組（P＜0.05），說明添加發(fā)酵劑和香辛料降低發(fā)酵香腸中組胺含量的作用明顯。

腐胺和尸胺是發(fā)酵肉制品中最常見的生物胺。由圖4c 和圖4d 可看出，發(fā)酵階段（2 d）是腐胺和尸胺迅速積累的時期。香腸成熟后（8 d），各組腐胺、尸胺含量顯著下降（P＜0.05），發(fā)酵劑組腐胺、尸胺含量最低，顯著低于對照組（P＜0.05），且發(fā)酵劑組色胺未檢出，而香辛料對腐胺、尸胺沒有抑制作用。與本研究相類似，王德寶等[32]將復配發(fā)酵劑菌株接種到香腸中，可有效抑制尸胺、苯乙胺的形成。

發(fā)酵階段（2 d）是色胺（圖4e）和苯乙胺（圖4f）含量極具積累的階段，干燥階段（5 d）色胺含量緩慢增加，苯乙胺含量緩慢下降。添加發(fā)酵劑和香辛料對抑制苯乙胺和色胺的形成有明顯作用，成熟階段（8 d），各試驗組苯乙胺和色胺的含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。其中發(fā)酵劑組對苯乙胺、色胺抑制作用最明顯。精胺和亞精胺為肉中所固有胺類物質，且在香腸加工過程含量變化小[33]，未對其加以分析。

圖4 加工過程中復合發(fā)酵劑和香辛料處理組發(fā)酵香腸6 種生物胺含量的變化Fig.4 Changes in the contents of eight BAs on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.5 復合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵香腸加工過程中亞硝胺含量的影響

目前NDMA 為肉制品中最主要的N-亞硝胺[34]。國級標準僅限量肉制品中NDMA 含量為3 μg/kg[35]。4 組發(fā)酵紅腸中7 種N-亞硝胺總量隨加工時間的變化如圖5a所示。本試驗中對照組成品中NDMA 含量6.125 μg/kg，超過國家標準，而試驗組未超過限量標準。NDMA 的含量總體呈先升高后降低的趨勢，添加復合發(fā)酵劑和香辛料均可抑制NDMA 含量。腌制結束（0 d），對照組顯著高于試驗組（P＜0.05），沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組含量最低為2.698 μg/kg。干燥結束（5 d），NDMA 含量上升，而試驗組NDMA 含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。成熟結束（8d），各試驗組NDMA 含量均顯著低于對照組（P＜0.05），其中發(fā)酵劑組NDMA 含量最低為1.284 μg/kg、沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組NDMA 含量為1.605 μg/kg、沙蔥+孜然組NDMA 含量為1.656 μg/kg，說明添加發(fā)酵劑和香辛料可不同程度地減少NDMA 的含量，且發(fā)酵劑效果最好，這可能是由于發(fā)酵劑菌株產(chǎn)生可降解NDMA 的酶系[36]，或者菌體對NDMA 有吸附作用[37]。

對于除NDMA 以外的6 種N-亞硝胺，目前無國際限量標準。對于NDEA（圖5d），發(fā)酵后（2 d），發(fā)酵劑組NDEA 的最低含量為0.929 μg/kg，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組、沙蔥+孜然組、對照組含量依次為1.143，1.197，2.414 μg/kg?？赡苁窃诎l(fā)酵階段，pH 值降到最低，乳酸菌對亞硝胺起到降解作用。香腸成熟后（8 d），對照組含量升高，試驗組NDEA 含量顯著低于對照組（P＜0.05），且沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組的最低含量為0.362 μg/kg，說明添加沙蔥+孜然和發(fā)酵劑的共同作用可減少NDEA 的含量。由圖5b 可知，成熟后各組NMOR 的含量降低，試驗組NMOR 含量均低于對照組，其中沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組NMOR 最低含量為1.160 μg/kg，可見發(fā)酵劑和香辛料共同作用下效果最好。由圖5e 可知，成熟后（8 d），試驗組NPIP 含量均顯著低于對照組（P＜0.05），說明發(fā)酵劑組和香辛料均可減少NPIP 的含量。而對于NPYR（圖5c）、NDPA（圖5f）和NDBA（圖5g），在不同加工階段各組的含量并未呈較一致的規(guī)律性。

圖5 加工過程中復合發(fā)酵劑和香辛料不同處理組發(fā)酵香腸7 種亞硝胺含量的變化Fig.5 Changes in the contents of seven nitrosamine on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

3 結論

添加復合發(fā)酵劑和香辛料可有效抑制發(fā)酵香腸加工過程中4 種N-亞硝胺（NDMA、NDEA、NMOR 和NPIP）以及6 種生物胺（酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺）的積累，且沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組效果最好。發(fā)酵劑和香辛料共同作用還可促進發(fā)酵香腸pH 值和水分活度的降低，亞硝酸鹽含量降至5.66 mg/kg。將復合發(fā)酵劑和香辛料應用到發(fā)酵香腸的生產(chǎn)中，既可抑制發(fā)酵香腸中生物胺的積累又可改善發(fā)酵香腸品質。