基于氯化血紅素模擬酶活性的熒光分析法檢測牛奶中膽固醇含量

王令臣，洪誠毅，黃志勇

（集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門361021）

膽固醇（Cholesterol）又稱膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲衍生物[1]。膽固醇作為人體一種重要的脂質(zhì)，是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要部分，可維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定并調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動性[2]。人體自身可以合成膽固醇，也可從食物中攝取膽固醇，然而過度攝入膽固醇會引起諸如心肌缺血、冠狀動脈粥樣硬化和冠心病等疾病[3]。人體每日膽固醇的攝入量不應(yīng)該超過200 mg/dL[4]。目前膽固醇的檢測方法主要有：高效液相色譜法（HPLC）[5]、電化學(xué)法[6]和比色法[7-8]。HPLC 法需要大型的儀器、設(shè)備，而且依賴專業(yè)技術(shù)人員操作。比色法通常采用3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）進(jìn)行顯色，然而其在空氣中易被氧化且難溶于水，導(dǎo)致檢測限高、穩(wěn)定性差。研究一種簡便、快速、準(zhǔn)確性強(qiáng)的膽固醇檢測方法很有必要。

氯化血紅素作為過氧化物模擬酶，相較于辣根過氧化物酶（HRP）獲取成本低、易儲存、不易變性，應(yīng)用廣泛[9]。酪胺是過氧化物酶的理想供氫熒光底物[10-11]，在波長426 nm 處有最大熒光峰，由于其反應(yīng)快速、靈敏，因此常被用于過氧化氫等物質(zhì)的檢測[12]。本試驗采用酪胺作為供氫底物檢測熒光強(qiáng)度，可以降低檢測限，提高檢測靈敏度，檢測原理如圖1所示。膽固醇被膽固醇氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫在氯化血紅素催化下氧化酪胺產(chǎn)生熒光。通過測定反應(yīng)體系在波長426 nm處的熒光強(qiáng)度，可測定樣品中的膽固醇含量。

圖1 試驗原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the detection method principle

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

牛奶、低脂牛奶、脫脂牛奶和酸奶購于當(dāng)?shù)爻?；膽固醇（?9%）、膽固醇酶（Cholesterol oxidase，ChOx），西格瑪試劑公司；葡萄糖、尿素、抗壞血酸、氯化鈣、氯化鐵、無水乙醇（分析純級），西隴試劑公司；二甲亞砜（分析純級），國藥集團(tuán)；氯化血紅素，上海麥克林生化科技有限公司；曲拉通，阿拉丁試劑公司；乙腈（色譜純級）、甲醇（色譜純級），德國默克公司。

超純水機(jī)（電阻率18.2 MΩ·cm），德國賽多利斯；離心機(jī)，于凱達(dá)湘儀；MS7-H550-Pro 數(shù)控加熱磁力攪拌器，美國賽洛捷克儀器公司；熒光分光光度計，美國Perkins Elmer 儀器有限公司；HPLC，美國安捷倫有限公司。

1.2 檢測方法

用無水乙醇配制1 mmol/L 的膽固醇儲備液，再用含有0.4%曲拉通的PBS 緩沖液稀釋膽固醇，稀釋液在60℃下加熱10 min，冷卻至室溫，加入膽固醇氧化酶，混勻并置于37℃搖床中孵育30 min。加入酪胺和氯化血紅素溶液，室溫下孵育15 min 后測量波長426 nm 處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長320 nm。

1.3 條件優(yōu)化

試驗對膽固醇氧化酶含量（0，4，12，20，28，40 mU/mL）、氯化血紅素濃度（0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mmol/L）、酪胺濃度（0，0.1，0.35，0.7，1.05，1.25 mmol/L）、酪胺氧化時間（0，5，15，20，30 min）進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的反應(yīng)條件。

1.4 選擇性試驗

選擇葡萄糖、尿素、抗壞血酸、氯化鈣和氯化鐵作為干擾組分，將膽固醇氧化酶與膽固醇及干擾物混勻，在37℃搖床中孵育30 min，加入酪胺（0.7 mmol/L）和氯化血紅素（0.1 μmol/L），室溫下孵育15 min，測量波長426 nm 處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長320 nm。

1.5 線性范圍與檢出限

分別配制濃度為0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，5，10，15 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)膽固醇溶液，按照檢測方法分析熒光強(qiáng)度與膽固醇濃度的線性關(guān)系，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，根據(jù)3σ/k（σ為9 次檢測膽固醇標(biāo)準(zhǔn)偏差，k 為斜率）確定該方法的檢測限。

1.6 牛奶樣品處理

取5 mL 牛奶樣品于100 mL 圓底燒瓶中，加入30 mL 無水乙醇和10 mL 600 mg/mL 的氫氧化鉀溶液，混勻，100℃下回流1 h，皂化結(jié)束后用流水冷卻至室溫。定量轉(zhuǎn)移全部皂化液于100 mL 離心管中，加入30 mL 正己烷與10 mL 超純水，充分震蕩，靜置分層。取上清液，氮?dú)獯蹈?，殘渣? mL 含有0.4%曲拉通的PBS 緩沖液溶解。

1.7 加標(biāo)回收與HPLC 驗證

對市售的純牛奶、低脂牛奶、脫脂牛奶和酸奶進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，設(shè)置100 μmol/L 和200 μmol/L 2 個加標(biāo)水平，按照樣品處理方法處理并測定膽固醇含量。每種樣品平行測定3 份。計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

使用HPLC 測定方法[13]檢測樣品中的膽固醇含量，HPLC 操作條件：C18 色譜柱（25 cm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈，流速1 mL/min，檢測波長205 nm。

2 結(jié)果

2.1 檢測條件的優(yōu)化

由圖2可知，當(dāng)ChOx、氯化血紅素和酪胺濃度分別為28 mU/mL，0.1 mmol/L 和0.7 mmol/L時，檢測信號最強(qiáng)。此外，隨著酪胺氧化時間的延長，熒光強(qiáng)度逐漸增大，15 min 后，熒光強(qiáng)度基本不變，故酪胺氧化時間選取15 min。

圖2 膽固醇氧化酶（a）、氯化血紅素（b）、酪胺濃度（c）和酪胺氧化時間（d）對熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effects of ChOx（a），hemin（b），tyramine concentrations（c）and tyramine oxidation time（d）on fluorescence intensity

2.3 方法的線性范圍與檢測限

圖3a 表明，在0.1～16 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，隨著膽固醇濃度的增加，熒光強(qiáng)度也逐漸增加；在0.1～2 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與膽固醇濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為F=34.85C+165.3（R2=0.992）。用3σ/k 計算檢測限為0.08 μmol/L。表1為幾種膽固醇檢測方法的比較，本試驗具有較低的檢測限。

圖3 不同濃度膽固醇對應(yīng)的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence emission spectra of different concentrations of cholesterol

表1 不同膽固醇檢測方法的比較Table 1 Comparison for cholesterol detection method

2.4 膽固醇檢測方法的選擇性

圖4表明，膽固醇的檢測熒光信號強(qiáng)度明顯高于其它5 種干擾物質(zhì)，說明葡萄糖、尿素、抗壞血酸、鈣與鐵對膽固醇的檢測基本無干擾。因此，本試驗方法具有良好的選擇性。

圖4 膽固醇檢測方法的選擇性Fig.4 Specificity of the assay for the detection of cholesterol

2.5 市售牛奶樣品中膽固醇的檢測

將檢測方法用于不同牛奶樣品中膽固醇的檢測。如表3所示，膽固醇的回收率在98.7%～112.7%之間，RSD 為1.0%～3.1%，表明該方法有較好的準(zhǔn)確性和精密度。采用HPLC 驗證方法的準(zhǔn)確性，其結(jié)果與熒光檢測法結(jié)果一致（表4），說明本方法準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論與討論

表2 膽固醇加標(biāo)回收試驗結(jié)果（n=3）Table 2 Results of cholesterol recovery test（n=3）

表3 本試驗方法與HPLC 法檢測結(jié)果的對比（n=3）Table 3 Comparison of detection results between this method and HPLC（n=3）

本試驗利用氯化血紅素作為過氧化物酶的模擬酶，結(jié)合膽固醇氧化酶氧化膽固醇產(chǎn)生過氧化氫的性質(zhì)，建立了一種基于酪胺熒光變化來檢測牛奶中膽固醇含量的方法。通過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗最佳條件為：膽固醇氧化酶含量為28 mU/mL，氯化血紅素濃度為0.1 mmol/L，酪胺濃度為0.7 mmol/L，反應(yīng)時間為15 min。方法的線性范圍為0.1～2 μmol/L，線性方程為F=34.85C+165.3（R2=0.992），檢測限為0.08 μmol/L。與幾種膽固醇的檢測方法相比，本方法具有較低的檢測限。將本方法應(yīng)用到牛奶樣品中膽固醇的加標(biāo)檢測，回收率98.7%～112.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤3.1%，說明本方法具有方便、快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。