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    中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油中大豆異黃酮和大豆皂苷質(zhì)量濃度測(cè)定及抗高血壓功能

    2021-06-07 13:35:56羅興力
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2021年9期
    關(guān)鍵詞:峰高異黃酮高脂

    鐘 寶,羅興力

    (1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林 吉林 132101;2.韓國(guó)全北國(guó)立大學(xué),韓國(guó) 全州全北 54896)

    0 引言

    醬油(Soy sauce)是以大豆為原料制作的一種發(fā)酵食品,在中國(guó)已經(jīng)有近2 500年的歷史,在東亞的中國(guó)、韓國(guó)、日本作為一種調(diào)味料經(jīng)常食用[1]。李紅民等人[2]對(duì)醬油中大豆異黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果證明經(jīng)過(guò)發(fā)酵醬油中的大豆異黃酮含量明顯增加。田晶等人[3]優(yōu)化了醬油中皂苷的提取工藝,并測(cè)定了皂苷的含量。大豆及大豆發(fā)酵食品含有豐富的大豆異黃酮、皂苷等生物活性成分,這些成分對(duì)機(jī)體脂質(zhì)的積累和高血壓都有積極的調(diào)節(jié)作用。馮曉凡等人[4]研究表明,大豆異黃酮對(duì)肥胖大鼠的總膽固醇、甘油三脂和瘦素水平具有積極的調(diào)節(jié)作用。馬增春[5]研究表明,大豆異黃酮對(duì)高血壓造成的內(nèi)皮損傷具有改善功效。羅舒蕾等人[6]研究表明,大豆異黃酮和大豆皂苷對(duì)心血管疾病具有調(diào)節(jié)作用。句連云[7]進(jìn)行了大豆提取復(fù)合物對(duì)脂質(zhì)代謝研究,結(jié)果具有積極調(diào)節(jié)作用。醬油本身也對(duì)高血壓具有調(diào)節(jié)作用。Mun E G等人[8]的研究表明,韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油可以顯著改善大鼠因高鹽飲食誘發(fā)的高血壓。醬油在我國(guó)是日常生活中的重要調(diào)料,2015—2018年我國(guó)醬油產(chǎn)量出現(xiàn)下降趨勢(shì),2019年產(chǎn)量開(kāi)始上升。因此,醬油中有效成分的測(cè)定對(duì)新型醬油的開(kāi)發(fā)和刺激醬油市場(chǎng)具有積極作用。目前,我國(guó)關(guān)于醬油的成分及功效研究報(bào)道相對(duì)較少,醬油中大豆異黃酮和大豆皂苷含量的測(cè)定,對(duì)醬油的功效研究將起到重要的作用。

    2015—2019年中國(guó)醬油產(chǎn)量(數(shù)據(jù)來(lái)源:國(guó)家統(tǒng)計(jì)局)見(jiàn)圖1。

    圖1 2015—2019年中國(guó)醬油產(chǎn)量

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    豆粕、小麥粉、米曲霉,均為市售;大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品、齊果墩酸標(biāo)準(zhǔn)品、香草醛乙醇、硫酸、甲醇,均為分析純。

    Lamda 950 UV/Vis/NIR型紫外-可見(jiàn)-近紅外紅外光譜儀,美國(guó)Perkin Elmer產(chǎn)品;Ultimate3000型高效液相色譜儀,賽默飛世爾產(chǎn)品;KH-3200B型超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品;R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品;HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,濟(jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司產(chǎn)品;索氏提取器;蒸餾水。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 醬油制備

    (1)工藝流程。豆粕→浸潤(rùn)→蒸制→晾涼→混合(小麥粉、米曲霉)→醬油曲→鹽水→發(fā)酵→淋油→過(guò)濾→殺菌→成品。

    (2)操作要點(diǎn)。采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵法制備醬油。豆粕放入水中浸潤(rùn)5 h,于121℃條件下蒸制10 min,趁熱與生面粉拌和,比例為8∶2,涼至40℃,接種曲精(米曲霉)接種量為0.3%,在30℃條件下發(fā)酵2~3 d(每隔6 h翻拌1次,防止溫度過(guò)高),獲得醬油曲,取醬油曲加入體積2.5倍的鹽水,先后于45℃和30℃條件下分別發(fā)酵30 d,再經(jīng)淋油、過(guò)濾、殺菌獲得成品醬油,放入-20℃冰箱中保存待用。

    1.2.2 醬油中大豆異黃酮測(cè)定

    (1)標(biāo)準(zhǔn)品制備。分別精密稱取大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品適量,加入甲醇,配成0.2 mg/mL的儲(chǔ)備液,作為對(duì)照溶液待用。

    (2)大豆異黃酮提取[9-10]。取醬油5 mL,加入5 mL甲醇,超聲處理30 min,以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min,取上清液,經(jīng)0.45μm微孔膜過(guò)濾,裝入HPLC分析瓶待用。

    (3)色譜柱:YMC-Pack型,ODS,250 mm×4.6 mm×5μm;流動(dòng)相A:0.1%醋酸水溶液;流動(dòng)相B:0.1%醋酸乙腈溶液。采用線性梯度洗脫,洗脫程序?yàn)?~25 min,用5-80%B洗脫;25~35 min用80%B洗脫;35~45 min用80-5%B洗脫,體積流量0.8 mL/min,進(jìn)樣量20μL,檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

    1.2.3 醬油中大豆皂苷測(cè)定

    (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密量取1.0 mg/mL的對(duì)照品齊果墩酸溶液20,40,60,80,100,120μL分別置于試管中揮干,精密加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL,72%硫酸5 mL,搖勻;置于60℃恒溫水浴中加熱10 min,取出試管置冰水浴中冷卻15 min,以溶劑甲醇同法操作制備空白溶液,于波長(zhǎng)540 nm處讀取吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    (2)樣品含量測(cè)定[11-12]。取適量樣品放入試管中揮桿,準(zhǔn)確稱取醬油試樣1.000 0 g,用濾紙包好放入索氏提取器中,先用乙醚脫脂2 h。取出濾紙筒晾干,再放回索氏提取器中用甲醇提取6 h。提取液減壓蒸干,蒸干物加水溶解,并在50 mL容量瓶中定容,準(zhǔn)確移取此溶液10 mL于分液漏斗中,用經(jīng)水飽和的正丁醇分4次提取,第1次用15 mL,第2,3,4次各用10 mL。有機(jī)相采用20 mL經(jīng)正丁醇飽和的水洗滌后,加熱蒸發(fā)至正丁醇徹底干燥。殘?jiān)蛹状既芙?,?0 mL容量瓶中定容,于波長(zhǎng)540 nm處讀取吸光度,計(jì)算含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大豆異黃酮含量測(cè)定

    2.2.1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

    4種大豆異黃酮的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2,大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。

    圖2 4種大豆異黃酮的結(jié)構(gòu)

    圖3 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

    依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間得到大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖。其中,大豆苷保留時(shí)間為10.183 min,相對(duì)峰面積為18.76%,相對(duì)峰高為25.51%,標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.901 0 mg/mL;染料木苷的保留時(shí)間為11.605 min,相對(duì)峰面積為21.97%,相對(duì)峰高為20.97%,質(zhì)量濃度為0.772 1 mg/mL;大豆苷元的保留時(shí)間為14.593 min,相對(duì)峰面積為18.72%,相對(duì)峰高為18.55%,質(zhì)量濃度為0.617 5 mg/mL;染料木素的保留時(shí)間為16.677 min,相對(duì)峰面積為37.88%,相對(duì)峰高為33.35%,質(zhì)量濃度為0.848 5 mg/mL。

    2.2.2 樣品中大豆異黃酮含量測(cè)定

    以標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照,對(duì)待測(cè)醬油樣品進(jìn)行HPLC分析。

    醬油中大豆異黃酮含量HPLC色譜圖見(jiàn)圖4。

    圖4 醬油中大豆異黃酮含量HPLC色譜圖

    根據(jù)相對(duì)峰面積和相對(duì)峰高,計(jì)算樣品中4種大豆異黃酮的含量。

    醬油中大豆異黃酮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 醬油中大豆異黃酮含量測(cè)定結(jié)果

    醬油樣品中,大豆苷保留時(shí)間為10.143 min,相對(duì)峰面積為2.46%,相對(duì)峰高為1.68%,質(zhì)量濃度為0.035 4 mg/mL;染料木苷保留時(shí)間為11.623 min,相對(duì)峰面積為0.05%,相對(duì)峰高為0.05%,質(zhì)量濃度為0.000 5 mg/mL;大豆苷元保留時(shí)間為14.605 min,相對(duì)峰面積為0.67%,相對(duì)峰高為0.58%,質(zhì)量濃度為0.006 6 mg/mL;染料木素保留時(shí)間為16.688 min,相對(duì)峰面積為0.09%,相對(duì)峰高為0.10%,質(zhì)量濃度為0.000 6 mg/mL。

    2.3 大豆皂苷質(zhì)量濃度測(cè)定

    以大豆皂苷的苷元類似物齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=1.000 693×10-2X+9.710 601×10-8,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9,樣品測(cè)定經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn),測(cè)定中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油中大豆皂苷質(zhì)量濃度為8.942 4 mg/mL。

    大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5。

    圖5 大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

    3 結(jié)論

    醬油是以大豆為原料制作的發(fā)酵調(diào)味料,很大程度上保留了大豆的功效成分,同時(shí)經(jīng)過(guò)發(fā)酵工藝產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,包括異黃酮、大豆皂苷等[13]。天然的大豆異黃酮通常與糖結(jié)合,會(huì)影響在人體腸道內(nèi)的吸收,使其利用率下降,而大豆發(fā)酵食品可以增加糖苷中異黃酮的含量,從而提高異黃酮的生物利用度[14]。研究表明,高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝釀造的醬油中,大豆苷質(zhì)量濃度為0.035 4 mg/mL,染料木苷質(zhì)量濃度為0.000 5 mg/mL,大豆苷元質(zhì)量濃度為0.006 6 mg/mL,染料木素質(zhì)量濃度為0.000 6 mg/mL,大豆皂苷質(zhì)量濃度為8.942 4 mg/mL。該工藝釀制的醬油發(fā)酵時(shí)間較短,但樣品中大豆異黃酮和皂苷的質(zhì)量濃度較高,因此證明該醬油是具有一定功效的健康食品。高鹽飲食是誘發(fā)高血壓的重要因素之一,任潔等人[15]的研究表明,高鹽飲食喂養(yǎng)大鼠,會(huì)導(dǎo)致大鼠的血壓升高和造成腎臟損傷。醬油中雖然含有較高的鹽分,但是對(duì)血壓具有一定的調(diào)節(jié)作用,Mun E G等人[8]研究表明,韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油對(duì)高鹽飲食誘發(fā)的大鼠高血壓具有顯著的調(diào)節(jié)作用。動(dòng)物試驗(yàn)已經(jīng)證明,中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油對(duì)高脂高鹽飲食誘發(fā)的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠高血壓具有積極的調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)中,大鼠經(jīng)12周灌胃含鹽量為8%的中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油,與高脂高鹽飲食(含鹽8%)攝入組相比,醬油灌胃組血清中的瘦素(高脂+高鹽飲食組含量3 145.9±293.5 pg/mL,高脂+醬油飲食組含量2 435±268.1 pg/mL;含鹽8%);脂聯(lián)素(高脂+高鹽飲食組含量3 741.9±250.7 pg/mL,高脂+醬油飲食組含量5 323.3±181.8 pg/mL;含鹽8%)水平和腎素(高脂+高鹽飲食組含量21.0±0.77 pg/mL,高脂+醬油飲食組含量13.1±2.2 pg/mL;含鹽8%)水平都得到顯著改善。假設(shè)醬油中的大豆異黃酮和皂苷是調(diào)節(jié)脂質(zhì)和瘦素水平的主要功效成分,因此對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)醬油中的大豆異黃酮和大豆皂苷成分的分析,將為進(jìn)一步證明中國(guó)傳統(tǒng)醬油對(duì)高血壓的調(diào)節(jié)機(jī)制提供重要參考。

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