miR?330?3p靶向丙酮酸激酶M2型對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及有氧糖酵解進(jìn)程調(diào)控機(jī)制研究

劉磊 趙羲和 田忠

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1普通外科，2腫瘤科（沈陽110023）

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，我國2015年胃癌新發(fā)及死亡例數(shù)分別為40.3萬、29.1萬人次，分別位居全部惡性腫瘤的第2、3位［1］，盡管外科手術(shù)及其他治療方式有了長足的發(fā)展，但胃癌患者的生存率及預(yù)后仍不樂觀，明確胃癌發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制，從分子水平上尋找早期診斷及靶向治療措施的是當(dāng)前癌癥研究的重點及難點［2］。近年來的研究認(rèn)為，丙酮酸激酶M2 型（PKM2）介導(dǎo)的有氧糖酵解過程在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展中扮演重要角色，瓦伯格效應(yīng)認(rèn)為，癌細(xì)胞需要獲取足夠的能量來維持細(xì)胞生長、增殖，大部分癌組織主要利用有氧糖酵解過程快速供能，有氧糖酵解活性在癌細(xì)胞增殖及血管新生過程均發(fā)揮重要作用［3-4］。臨床研究表明，在包括胃癌的諸多惡性腫瘤組織中均可檢測到PKM2 水平的明顯升高，且其水平與患者低生存密切相關(guān)［5-6］。microRNA 是一種非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而影響一系列生理過程。miR?300?3p 是一種腫瘤標(biāo)記基因，既往已被證實在肝癌［7］、肺癌組織［8］中存在低表達(dá)，且其水平與細(xì)胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)；HWANG 等［9］開展的一項高通量研究顯示，miR?300?3p 在胃癌細(xì)胞系及組織中表達(dá)下降。目前miR?300?3p 與PKM2 及糖酵解途徑的關(guān)系仍較少有研究涉及，本研究采用轉(zhuǎn)染實驗，在胃癌細(xì)胞株中過表達(dá)及干擾miR?300?3p、PKM2 表達(dá)，觀察miR?300?3p 與PKM2 表達(dá)量的變化，并采用增殖、侵襲、凋亡實驗分析細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，探討miR?300?3p 及PKM2 通路在胃癌生長增殖中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人類胃癌細(xì)胞株SGC?7901；人類正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES?1；均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 實驗儀器與試劑細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；紫外分光光度計（美國Thermo公司）；凝膠成像儀（美國BIO?RAD 公司）；PCR 儀（美國BIO?RAD 公司）；實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

胎牛血清（WESTEN 公司）；Trizol（Invitrogen 公司）；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國BIO?RAD 公司）；CCK?8（Dojin DO 公司）；RAPI（Solarbio 公司）；Matrigel 基質(zhì)膠（Solarbio 公司）；Transwell 小室（美國Corning 公司）；葡萄糖含量檢測試劑盒（北京百奧博萊科技有限公司）；乳酸含量檢測試劑盒（艾美捷生物科技有限公司）；HK 試劑盒（武漢博士康生物工程有限公司）；LDH 試劑盒（上海玨博生物科技有限公司）；熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Biovision 公司）；PKM2、GLUT1、HK2、Bax、Caspase?3 單克隆抗體（Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔、兔抗羊單克隆抗體（Santa Cruz 公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)取胃癌細(xì)胞系、正常胃粘膜上皮細(xì)胞置于0 ℃條件下解凍，采用DMEM 培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)24 h（37 ℃、5%CO2）；以3 000 r/min速度（離心半徑8.5 cm）離心5 min，取沉淀放入DMEM 培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；連續(xù)進(jìn)行細(xì)胞傳代3 次后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取4 × 105/孔接種至培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至細(xì)胞融合80%作用，更換不含胎牛血清的培養(yǎng)基。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)期細(xì)胞，將miR?NC、miR?330?3p?inhibitor、miR?330?3p?mimcs 轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，分別記為miR?NC 組、miR?330?3p?inhibitor組、miR?330?3p?mimcs 組，將miR?330?3p?inhibitor 分別與PKM2?NC、PKM2?shRNA 共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，記為miR?330?3p?inhibitor+PKM2?NC 組、miR?330?3p?inhibitor+PKM2?shRNA 組；將miR?330?3p?mimcs 分別與LV?NC、LV?PKM2 共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，記為miR?330?3p?mimcs+LV?NC 組、miR?330?3p?mimcs+LV?PKM2 組。具體轉(zhuǎn)染方法：取對數(shù)期生長的胃癌細(xì)胞系，以1.5 × 105/孔接種于六孔板中，采用DMEM 培養(yǎng)基稀釋序列至200 μmol/L，取2 μL Lipofectamin2000 RNAiMAX 加入到稀釋的轉(zhuǎn)染序列中混合，室溫孵育20 min，將復(fù)合物加入六孔板內(nèi)，而后每孔加入1.9 mL DMEM 培養(yǎng)基，使得每孔轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L，在37 ℃、5%CO2條件下孵育8 h，而后換成5%培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)40 h。

1.3.3 CCK?8 檢測細(xì)胞增殖能力取上述1.3.2 中處理細(xì)胞，采用胰蛋白酶處理，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為5 000 ～10 000 個/孔，培養(yǎng)24、48、72 h 時取細(xì)胞，加入10 μL CCK?8 溶液孵育4 h，測定吸光度值。

1.3.4 Transwell 實驗檢測細(xì)胞侵襲能力取稀釋（1∶8）后的Matrigel 均勻涂布在上層小室內(nèi)，孵育4 h 后加入無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸，向上室內(nèi)加入細(xì)胞懸液（對數(shù)期細(xì)胞，細(xì)胞密度約為5×104/mL），下室加入含有血清的培養(yǎng)基，將裝置置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，取出小室，采用PBS 沖洗并小心去除膜上的Matrigel 及細(xì)胞，采用多聚甲醛固定并加入結(jié)晶紫染料染色30 min，PBS 沖洗、晾干后置于倒置顯微鏡下觀察。

1.3.5 Annexin V/PI 法檢測細(xì)胞凋亡檢測取細(xì)胞收集于流式管內(nèi)，PBS 清洗3 遍，以1 000 r/min 離心10 min，取沉淀以200 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入FITC 標(biāo)記的Annexin V 溶液及PI 溶液，混勻后室溫避光孵育20 min，加入300 μL 緩沖液混勻，流式細(xì)胞儀上樣檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.6 有氧糖酵解作用測定（1）葡萄糖利用率及乳酸生成量測定：取上述培養(yǎng)細(xì)胞，采用葡萄糖含量試劑盒及乳酸試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測培養(yǎng)基葡萄糖及乳酸含量，計算葡萄糖利用率及乳酸生成量。（2）己糖激酶（HK）、乳酸脫氫酶（LDH）活性測定：采用HK 及LDH 試劑盒進(jìn)行操作，普通分光光度計測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)趨勢計算活性。

1.3.7 熒光素酶報告基因檢測miR?330?3p 靶向PKM2 調(diào)控能力在TargetScan 數(shù)據(jù)庫序列尋找結(jié)合位點，構(gòu)建野生型及突變型基因靶點PKM2 的熒光素酶表達(dá)載體，將載體分別與miR?NC、miR?330?3p 共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系內(nèi)，進(jìn)行雙熒光素酶報告實驗測定。

1.3.8 基因及蛋白表達(dá)（1）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測：主要涉及miR?330?3p mRNA 表達(dá)。取處理后的細(xì)胞，采用Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠檢測核酸條帶亮度，mRNA 表達(dá)量為目的基因與內(nèi)參表達(dá)量的比值。（2）Western blot 法：主要涉及PKM2、GLUT1、HK2、Bax、Caspase?3 蛋白的表達(dá)。取處理后的細(xì)胞提取總蛋白，配置SDS?PAGE 膠，以80 μg 蛋白量加入點樣孔內(nèi)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜完畢后采用脫脂牛奶封閉3 h，依次加入一抗、二抗，洗脫后加入發(fā)光試劑，置于顯像儀照相，以目的基因與內(nèi)參表達(dá)灰度值作為蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較行單因素方差分析及t檢驗，以P＜0.05 表示差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞系及胃粘膜上皮細(xì)胞miR?330?3p、PKM2 表達(dá)RT?PCR 結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞系及胃粘膜上皮細(xì)胞miR?330?3p 表達(dá)量分別為（0.33 ±0.10）、（0.20±0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot 顯示，胃癌細(xì)胞系及胃粘膜上皮細(xì)胞PKM2蛋白表達(dá)量分別為（0.34±0.10）、（1.01±0.23），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 胃癌細(xì)胞系及胃粘膜上皮細(xì)胞miR?330?3p、PKM2表達(dá)Fig.1 Expression of miR?330?3p and PKM2 in gastric cancer cell lines and gastric mucosal epithelial cells

2.2 miR?330?3p 與PKM2 的靶向關(guān)系分析生物信息學(xué)顯示，miR?330?3p 與PKM2 存在結(jié)合位點；熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與miR?NC 組比較，miR?330?3p PKM2 野生型熒光素酶活性降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 miR?330?3p 轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞PKM2 表達(dá)的影響與miR?NC 組比較，miR?330?3p?inhibitor 組PKM2 表達(dá)升高，miR?330?3p?mimcs 組PKM2 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 miR?330?3p 與PKM2 的靶向關(guān)系分析Fig.2 Analysis of the targeting relationship between miR?330?3p and PKM2

圖4 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞侵襲的影響Fig.4 The effect of miR?330?3p and PKM2 transfection on the invasion of gastric cancer cells

2.4 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響與miR?NC 組比較，miR?330?3p?inhibitor 組miR?330?3p 表達(dá)量降低（P＜0.05），吸光度值、侵襲細(xì)胞數(shù)增多，凋亡細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），下調(diào)miR?330?3p?inhibitor 組細(xì)胞PKM2 表達(dá)，吸光度值及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低，凋亡細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）。

圖3 miR?330?3p 轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞PKM2 表達(dá)的影響Fig.3 The effect of miR?330?3p transfection on the expression of PKM2 in gastric cancer cells

與miR?NC 組比較，miR?330?3p?mimcs 組miR?330?3p 表達(dá)量升高（P＜0.05），吸光度值、侵襲細(xì)胞數(shù)減少，凋亡細(xì)胞增加（P＜0.05）；上調(diào)miR?330?3p?mimcs 組細(xì)胞PKM2 表達(dá)，吸光度值及侵襲細(xì)胞數(shù)明顯升高，凋亡細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）。見表2、圖4、圖5。

表2 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對miR?330?3p 轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響Tab.2 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on the proliferation,invasion and apoptosis of miR?330?3p transfected cells x±s

圖5 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on apoptosis of gastric cancer cells

2.5 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對miR?330?3p 轉(zhuǎn)染細(xì)胞有氧糖酵解的影響miR?330?3p?inhibitor 組細(xì)胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性均顯著高于miR?NC 組（P＜0.05）；下調(diào)miR?330?3p?inhibitor 組細(xì)胞PKM2 表達(dá)，細(xì)胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性等有氧糖酵解指標(biāo)均明顯降低（P＜0.05）；miR?330?3p?mimcs 組各有氧糖酵解指標(biāo)顯著低于miR?NC 組（P＜0.05），上調(diào)miR?330?3p?mimcs 組細(xì)胞PKM2 表達(dá)，有氧糖酵解指標(biāo)均明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對miR?330?3p 轉(zhuǎn)染細(xì)胞有氧糖酵解的影響Tab.3 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on aerobic glycolysis of miR?330?3p transfected cells±s

表3 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對miR?330?3p 轉(zhuǎn)染細(xì)胞有氧糖酵解的影響Tab.3 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on aerobic glycolysis of miR?330?3p transfected cells±s

別細(xì)胞葡萄糖消耗量（mmol/L） 乳糖生成量（mmol/L）HK 活性（U/g）LDH 活性（U/g）iR?NC2.22±0.504.55±0.45160.12±22.7459.63±9.64 iR?330?3p?inhibitor3.11±0.626.85±0.56196.63±18.5274.15±10.22 iR?330?3p?inhibitor+PKM2?NC3.01±0.656.83±0.63189.63±22.1475.11±9.63組m m m miR?330?3p?inhibitor+PKM2?shRNA miR?NC miR?330?3p?mimcs miR?330?3p?mimcs+LV?NC miR?330?3p?mimcs+LV?PKM2 2.55±0.45 2.22±0.50 1.52±0.41 1.49±0.38 2.01±0.48 4.85±0.50 4.55±0.45 2.96±0.56 3.11±0.48 4.55±0.52 174.14±22.63 160.12±22.74 122.41±12.56 120.41±15.63 158.63±22.01 62.12±9.63 59.63±9.64 20.74±3.96 21.01±4.12 56.34±4.12

2.6 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對miR?330?3p 轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡、有氧糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的影響與miR?NC 組比較，miR?330?3p?inhibitor 組PKM2、GLUT1、HK2 表達(dá)升高，促凋亡蛋白Bax、Caspase?3表達(dá)量降低（P＜0.05）；下調(diào)miR?330?3p?inhibitor組細(xì)胞PKM2 表達(dá)，Bax、Caspase?3 等蛋白表達(dá)明顯升高，GLUT1、HK2 等蛋白明顯降低（P＜0.05）。與miR?NC 組比較，miR?330?3p?mimcs 組PKM2、GLUT1、HK2 表達(dá)降低，Bax、Caspase?3 表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；上調(diào)miR?330?3p?mimcs 組細(xì)胞PKM2 表達(dá)，Bax、Caspase?3 等蛋白表達(dá)明顯降低，GLUT1、HK2 等蛋白明顯升高（P＜0.05）。見表4、圖6。

3 討論

近年來的研究顯示，miRNA可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用影響腫瘤增殖、代謝及生物學(xué)行為，miRNA在腫瘤中的表達(dá)、致癌通路已成為當(dāng)前研究的熱點［10-11］。miR?330?3p 是一種被證實在多種惡性腫瘤中均存在表達(dá)降低的miRNA，既往國外開展的一項細(xì)胞及組織學(xué)研究顯示，miR?300?3p 在胃癌細(xì)胞系及組織中表達(dá)下降，而miR?300?3p 過表達(dá)可促進(jìn)E?鈣黏蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［12］；MA 等［13］近期開展的一項研究證實，過表達(dá)的miR?330?3p 可通過抑制Wnt/β?catenin 信號通路抑制細(xì)胞增殖及凋亡，有望成為胃癌的潛在治療靶點。本研究結(jié)果顯示，相比于正常胃粘膜上皮細(xì)胞，胃癌細(xì)胞系存在miR?330?3p 表達(dá)量的明顯降低，構(gòu)建miR?330?3p 低表達(dá)及過表達(dá)模型，結(jié)果顯示，與對照組比較，miR?330?3p?inhibitor 組胃癌細(xì)胞增殖、侵襲作用增強(qiáng)，凋亡作用降低，而miR?330?3p?mimcs 組呈現(xiàn)相反趨勢，提示抑制miR?330?3p 表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，而過表達(dá)miR?330?3p則有一定抑制作用，提示miR?330?3p 的降低可能與胃癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，這一結(jié)果與既往研究報道類似［14-15］。當(dāng)前miR?330?3p 對腫瘤生物學(xué)行為的具體調(diào)控機(jī)制仍未明確，目前認(rèn)為，糖酵解過程在腫瘤生長、增殖、轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用，葡萄糖消耗及乳酸生成的增加是細(xì)胞糖酵解活動增強(qiáng)的重要指標(biāo)［16-17］。本研究對胃癌細(xì)胞、miR?330?3p 低表達(dá)及過表達(dá)胃癌細(xì)胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性等糖酵解指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，miR?330?3p 低表達(dá)細(xì)胞存在糖酵解指標(biāo)的顯著升高，而miR?330?3p?mimcs 組糖酵解指標(biāo)顯著降低，調(diào)控糖酵解相關(guān)基因表達(dá)也呈相同的趨勢，提示miR?330?3p 或可通過作用于糖酵解作用影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

表4 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染對凋亡、有氧糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的影響Tab.4 Effects of miR?330?3p and PKM2 transfection on apoptosis and aerobic glycolysis?related gene expression

圖6 miR?330?3p、PKM2 轉(zhuǎn)染凋亡、有氧糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 The effect of miR?330?3p and PKM2 transfection on apoptosis and aerobic glycolysis?related gene expression

PKM2 編碼的丙酮酸激酶2 型是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，在多種惡性腫瘤中均存在過表達(dá)［18-20］，目前認(rèn)為，PKM2 或可通過增強(qiáng)瓦伯格效應(yīng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，腫瘤細(xì)胞中的高活性的PKM2 可快速供能，也可促進(jìn)糖酵解中間產(chǎn)物進(jìn)入旁路途徑，通過一系列機(jī)制供應(yīng)癌細(xì)胞物質(zhì)促進(jìn)其快速增殖［21］；研究證實PKM2 可與HIF?1 因子的亞單位共同影響腫瘤細(xì)胞代謝的改變［22］；WANG 等［23］開展的一項研究也表明，由EGFR 轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中的PKM2 可促使鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄增加，導(dǎo)致癌細(xì)胞的大量增殖。miR?330?3p 是否可通過靶向調(diào)控PKM2 影響糖酵解途徑從而影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為仍有待研究探討。為探討miR?330?3p 與PKM2 的靶向作用，本研究采用生物信息學(xué)方法及熒光素酶報告系統(tǒng)分析兩者的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR?330?3p 基因3’UTR 區(qū)域與PKM2 有結(jié)合位點，熒光素酶報告系統(tǒng)也提示miR?330?3p?mimcs 組PKM2 野生型熒光素酶活性降低，推測miR?330?3p與PKM2 可能具有一定靶向作用關(guān)系。為進(jìn)一步確定miR?330?3p 通過靶向影響PKM2 表達(dá)從而影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為，本研究在miR?330?3p 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中再分別上調(diào)或下調(diào)PKM2 表達(dá)，結(jié)果顯示，下調(diào)miR?330?3p?inhibitor 組細(xì)胞PKM2 表達(dá)后，胃癌細(xì)胞增殖及侵襲行為均降低，凋亡升高，而上調(diào)miR?330?3p?mimcs 組細(xì)胞PKM2 表達(dá)后，胃癌細(xì)胞增殖及侵襲行為也明顯升高，提示PKM2 的升高可回復(fù)miR?330?3p 升高對胃癌惡性生物學(xué)行為的抑制作用，而PKM2 的降低也可回復(fù)miR?330?3p 降低對胃癌惡性生物學(xué)行為的促進(jìn)作用，兩者存在靶向作用關(guān)系。

綜上，miR?330?3p 表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及有氧糖酵解進(jìn)程相關(guān)，其作用可能是通過靶向PKM2 實現(xiàn)，本研究的局限性在于未對PKM2 對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響機(jī)制進(jìn)行研究，擬在后續(xù)研究中探討。