基于NF-κB/NLRP3信號(hào)軸探討大血藤對(duì)CIA大鼠的治療作用及機(jī)制

俞云，于輝，馮旌，沈飛，喻斌，陳慶，時(shí)樂(lè)，卞勇

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京新百藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210038；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 南京 210023)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種表現(xiàn)出緩慢侵蝕性周?chē)P(guān)節(jié)炎的自身免疫性疾病，全世界發(fā)病率大約1%，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能受遺傳和環(huán)境等因素的影響。目前治療RA的化學(xué)藥物大都存在如免疫缺陷、肝損傷、胃腸道反應(yīng)等副作用[1]。

大血藤又名紅藤，是一種傳統(tǒng)中藥,為木通科大血藤植物Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd.et Wils.的干燥莖，具有清熱解毒，活血通絡(luò)，祛風(fēng)等功效，在臨床上尤其是苗族地區(qū)被廣泛用于治療風(fēng)濕痹痛、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，效果良好，副作用較小[2-5]。目前還未有大血藤對(duì)RA機(jī)制的深入報(bào)道，本研究通過(guò)建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型，考察大血藤的治療作用及機(jī)制，為大血藤的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。大鼠分籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，每籠5只，喂以全價(jià)顆粒鼠飼料(南京協(xié)同生物工程有限公司)，自由飲水飲食，室溫20～25 ℃，每天人工光照12 h，室內(nèi)通風(fēng)良好，相對(duì)濕度40%～70%。動(dòng)物設(shè)施環(huán)境使用許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0049，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批號(hào):ACU190603。

1.2 藥物和試劑

大血藤購(gòu)自藥村堂藥店(產(chǎn)地：湖北襄陽(yáng)，批號(hào):20200324，500 g/袋)，用10倍量沸水提取，每次500 g，將其濃縮成合生藥量1 g/mL的煎液，4 ℃保存，備用；甲氨蝶呤片(規(guī)格：2.5 mg，上海信誼藥廠(chǎng)有限公司，批號(hào)：H31020644)用蒸餾水將其配制至0.15 mg/mL；牛Ⅱ型膠原(CⅡ，Sigma公司，批號(hào)：C7806)；戊巴比妥鈉(Sigma公司，批號(hào)：F20160721)；完全弗氏佐劑(Chondrex公司，批號(hào)：7023)；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 ELISA試劑盒(美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：RAB0479、RAB0277、RAB0311、RAB1147)；NF-κB p65抗體、p-NF-κB p65抗體(Millipore公司，批號(hào):SAB5700683、SAB4301496)；RANKL抗體、p-IκB-α抗體、NLRP3抗體、Caspase-1抗體、GAPDH抗體(Abcam公司，批號(hào):ab216484、ab133462、ab263899、ab138483、ab9485)；PVDF膜(Millipore公司)；BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液(碧云天生物技術(shù)研究所)；Minute動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒(北京英文特生物技術(shù)有限公司)。

1.3 CIA大鼠模型的建立

用0.05 mol/L乙酸溶液將CⅡ配制成藥液，充分溶解后4 ℃冷藏保存。將含1 mg/mL乳酪分枝桿菌的弗氏完全佐劑和CⅡ溶液(2 mg/mL)混合(體積比1∶1)，在冰上研磨至完全乳化，4 ℃冷藏備用(僅供短時(shí)保存)。大鼠稱(chēng)質(zhì)量,標(biāo)記，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(2 mL/kg)，在尾根部皮內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)注射，每只大鼠給予0.2 mL CⅡ乳劑。首次注射當(dāng)天記為d0，7 d后用同樣方法加強(qiáng)免疫[6]。

1.4 分組和給藥

除空白組外，其他大鼠造模成功后根據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分將大鼠隨機(jī)分為模型組、甲氨蝶呤組(1.5 mg/kg)、大血藤高劑量組(1.6 g/kg)、大血藤中劑量組(0.8 g/kg)、大血藤低劑量組(0.4 g/kg)，每組8只大鼠。加強(qiáng)免疫后7 d開(kāi)始灌胃給藥，每10 g體質(zhì)量給藥0.1 mL(高、中、低劑量組分別將原藥稀釋至0.16、0.08、0.04 g/mL)，每日1次，給藥時(shí)間20 d。

1.5 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

造模后定期進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分[7]，觀察各組大鼠的病變。每只足爪的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0=正常；1=踝關(guān)節(jié)可觀察到紅斑和輕微腫脹；2=踝關(guān)節(jié)至跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)可觀察到紅斑和輕微腫脹；3=踝關(guān)節(jié)至跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)可觀察到紅斑和中度腫脹；4=踝關(guān)節(jié)至趾關(guān)節(jié)可觀察到紅斑和重度腫脹；計(jì)算所有(4只)足爪的評(píng)分總和，每只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)總和最多16分。

1.6 足腫脹度

分別于d14、d18、d22、d26、d30、d34，以自制的大鼠足跖容積測(cè)量?jī)x測(cè)定雙后肢踝關(guān)節(jié)以下容積，以上述時(shí)間點(diǎn)的足體積與致炎前足體積的差值表示足腫脹程度。

1.7 ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠心臟取血，3 000 r/min離心15 min，取上清，按試劑盒操作步驟檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.8 Western blot法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)蛋白表達(dá)

根據(jù)試劑盒說(shuō)明，提取關(guān)節(jié)滑膜總蛋白后，BCA法蛋白定量。按試劑盒操作步驟制備濃度為12%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，80 V電壓電泳2 h后，60 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗，室溫孵育，TBST沖洗3次，ECL顯影液顯影，顯影結(jié)果采用Quantity One軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH比值反應(yīng)蛋白表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大血藤對(duì)CIA大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

模型組大鼠于d14開(kāi)始出現(xiàn)體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩，d22模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于正常組(P<0.01)，同時(shí)大血藤中、高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.05,P<0.01)；大鼠在d14出現(xiàn)足部紅腫，d18模型組大鼠足腫脹度顯著高于正常組(P<0.01)，d22大血藤中、高劑量組大鼠足腫脹度顯著低于模型組(P<0.05,P<0.01)；d14模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著高于正常組(P<0.01)，d22大血藤中、高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較，圖1 大血藤對(duì)CIA大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

2.2 大血藤對(duì)CIA大鼠血清炎癥因子的影響

模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平顯著高于正常大鼠(P<0.01)；和模型組相比，中、高劑量大血藤能顯著降低CIA大鼠血清上述炎癥因子水平(P<0.05,P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較，圖2 大血藤對(duì)CIA大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的影響

2.3 大血藤對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜RANKL、p-IκB-α、NF-κB/p65、p-NF-κB/p65、NLRP3、Caspase-1表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，模型組大鼠滑膜RANKL、p-IκB-α、NF-κB/p65、p-NF-κB/p65、NLRP3、Caspase-1表達(dá)顯著高于正常大鼠(P<0.01)，中、高劑量大血藤可顯著降低上述蛋白表達(dá)(P<0.05,P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較，圖3 大血藤對(duì)CIA大鼠滑膜RANKL、p-IκB-α、NF-κB/p65、p-NF-κB/p65、NLRP3、Caspase-1表達(dá)的影響

3 討論

RA是一種以外周關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的慢性全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。目前研究RA比較經(jīng)典的動(dòng)物模型就是通過(guò)注射Ⅱ型膠原誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎模型，即CIA模型[8]，實(shí)驗(yàn)中我們采用CIA法造模，持續(xù)統(tǒng)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，結(jié)果顯示大血藤能顯著改善CIA大鼠相關(guān)癥狀，表現(xiàn)為降低足腫脹、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分以及改善體質(zhì)量數(shù)據(jù)。

促炎因子TNF-α和IL-6等作為RA發(fā)病中激起炎癥反應(yīng)的初始因素以及RA炎癥和關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)，在慢性炎癥中發(fā)揮著中心作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平和正常組大鼠比較顯著升高，而大血藤可以顯著降低大鼠血清TNF-α、IL-6水平。RANKL蛋白是和TNF-α具有密切同源性的Ⅱ型膜蛋白[9]，RANKL蛋白全長(zhǎng)有317個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為35 000～46 000，在機(jī)體各組織，如腦、心臟、骨骼肌、肝臟、腎臟、乳腺和肺組織等中均可檢測(cè)到，但在骨組織中的表達(dá)更為強(qiáng)烈[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)RANKL蛋白和RA關(guān)系密切[11]，當(dāng)RANKL與RANK結(jié)合后，TRAF6可特異性結(jié)合到RANKL胞漿區(qū)域，IκB激酶(IKKs)被激活，活化的IKKs(IKKα和IKKβ)可使NF-κB特異性抑制因子IκB特定部位的絲氨酸磷酸化，激活NF-κB。在RANKL刺激下，NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性顯著提高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜RANKL、p-IκB-α、NF-κB/p65、p-NF-κB/p65表達(dá)，結(jié)果顯示模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中上述蛋白表達(dá)顯著升高，而大血藤可顯著降低上述蛋白表達(dá)。

在正常和未激活的細(xì)胞中，NF-κB被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，啟動(dòng)多種活性物質(zhì)包括黏附分子、炎性因子、免疫相關(guān)受體等的基因表達(dá)，參與許多病理過(guò)程的發(fā)生與發(fā)展[12]，其中NLRP3炎癥小體作為目前研究最多的炎性小體復(fù)合物，參與了許多疾病如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13]、糖尿病[14]、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌損傷和其他心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展[15]。NLRP3炎癥小體由NLRP3受體蛋白、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(ASC)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-1)組成。NLRP3是NLRs受體家族中的重要亞族之一,主要由B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生[16]，其作為胞內(nèi)模式識(shí)別受體識(shí)別病原相關(guān)分子模式和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式，它缺少CARD結(jié)構(gòu)域，需要和ASC結(jié)合后招募pro-Caspase-1，剪切為成熟的Caspase-1，活化的Caspase-1進(jìn)一步誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放,引起一系列的炎癥反應(yīng)[17]。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜NLRP3、Caspase-1表達(dá)以及血清IL-18、IL-1β水平顯著升高，而大血藤可顯著降低CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)以及血清IL-18、IL-1β水平。

綜上所述，大血藤改善CIA大鼠癥狀的機(jī)制之一可能是降低促炎因子的釋放以及抑制NF-κB/NLRP3-Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路，最終改善CIA大鼠的炎癥反應(yīng)、延緩病理進(jìn)展。