油莎豆CebZIP1 基因的克隆及表達(dá)分析

李 騰，孫 巖，陳 瑩，劉寶玲，薛金愛，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

油莎豆（Cyperus esculentus）又稱虎堅(jiān)果、鐵荸薺等，屬莎草科莎草屬多年生C4 草本植物[1]。油莎豆原產(chǎn)于非洲及地中海沿岸的干旱和半干旱地區(qū)，目前，在我國(guó)的東北、華北及長(zhǎng)江流域等地均有種植，其具有生長(zhǎng)速度快、生物量大、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[2]。油莎豆全身是寶，其地上莖葉部分可作為優(yōu)質(zhì)牧草，也可作為造紙及編織業(yè)的基礎(chǔ)原材料；地下塊莖富含膳食纖維、油脂、蛋白質(zhì)和淀粉等，除供食用外，還可加工成生物柴油、潤(rùn)滑油等；地下須根也具有重要的藥用價(jià)值[3]。在生產(chǎn)中，油莎豆對(duì)土壤條件的要求并不嚴(yán)格，甚至可以在四荒地、鹽堿地、灘涂地等一些邊際土地上生長(zhǎng)，具有很強(qiáng)的抗旱、耐貧瘠、耐鹽堿等能力，所以，也是植物抗逆性研究的理想材料[4]。

轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠特異性識(shí)別基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，進(jìn)而抑制或激活目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白質(zhì)，參與植物（非）生物脅迫響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育[5]。堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中分布最廣泛、結(jié)構(gòu)最保守的一類基因家族，因其共有的bZIP 保守結(jié)構(gòu)域而被命名。bZIP 結(jié)構(gòu)域一般由60～80 個(gè)保守氨基酸殘基組成，包括1 個(gè)C 端的堿性結(jié)構(gòu)域（BR）和1 個(gè)N 端的亮氨酸拉鏈區(qū)（LZ），其中，堿性區(qū)參與細(xì)胞核定位和特異性識(shí)別DNA 序列；而亮氨酸拉鏈區(qū)因其特有的氨基酸序列，可使bZIP 蛋白在與DNA結(jié)合前發(fā)生二聚化，形成同源或異源二聚體[6]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子能識(shí)別的順式作用元件主要是以ACGT為中心的核心序列片段，如A-Box（TACGTA），C-Box（CACGTC）和G-Box（GACGTC）等[7]。研究發(fā)現(xiàn)，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控種子貯藏、植物的光信號(hào)傳導(dǎo)、病害防御、生物和非生物脅迫應(yīng)答以及ABA 響應(yīng)敏感性等各種反應(yīng)[8]。如擬南芥AtbZIP1、AtbZIP24、AtbZIP17 等蛋白都可通過調(diào)控鹽脅迫調(diào)控基因表達(dá)，從而提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受性，而AtbZIP9 參與調(diào)控葉片、維管等器官的發(fā)育[9-10]；水稻OsbZIP12、OsbZIP23 和OsbZIP72 可增強(qiáng)水稻的非生物脅迫抗性[11]，而OsbZIP52 則是干旱和冷脅迫的負(fù)調(diào)控因子，OsbZIP16基因上游核心順式作用元件參與ABA 信號(hào)傳導(dǎo)，基因過表達(dá)植株表現(xiàn)出顯著的抗旱性[12-13]。此外，大豆多個(gè)GmbZIPs轉(zhuǎn)錄因子均能使植物表現(xiàn)出明顯的抗鹽性和抗旱性[14]。

“十一五”期間，科技部將油莎豆列為“農(nóng)林生物質(zhì)工程”的國(guó)家科技重大項(xiàng)目，開展油莎豆的高效培育技術(shù)研發(fā)[15]。目前關(guān)于油莎豆bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)制尚不清楚。本研究基于油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挖掘鹽脅迫下bZIP家族中的差異表達(dá)基因，命名為CebZIP1。在油莎豆中對(duì)該基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，以及不同組織和逆境脅迫下的表達(dá)模式分析，探究其潛在的生物學(xué)功能，以期為油莎豆的抗逆生物學(xué)研究提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

油莎豆塊莖采自湖南長(zhǎng)沙，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田內(nèi)。

收集成熟期的根、葉、塊莖等用于組織特異性表達(dá)分析。

選擇飽滿無蟲眼的油莎豆塊莖，清洗干凈，播于裝有自來水的90 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿中（水不浸沒塊莖，按需向培養(yǎng)皿中加水），每個(gè)培養(yǎng)皿放10 顆油莎豆塊莖，置于光照培養(yǎng)箱中；將長(zhǎng)勢(shì)較好且一致的油莎豆植株快速清洗干凈，進(jìn)行脅迫試驗(yàn)，每個(gè)脅迫3 次重復(fù)。其中，鹽脅迫是將根部浸泡于0.3 mol/L 氯化鈉中處理0、6、12、24 h；干旱脅迫是將根部浸泡于100 g/kg 聚乙二醇6000 中處理0、6、12、24 h；低溫脅迫是挑選整株材料于4 ℃低溫處理0、6、12、24 h（根部浸泡于自來水中）。分別取每個(gè)處理節(jié)點(diǎn)的4 株油莎豆的混合葉片為試驗(yàn)材料，迅速清洗干凈，經(jīng)液氮速凍后，于-80 ℃冰箱進(jìn)行保存。

1.2 CebZIP1 基因的克隆及生物信息學(xué)分析

從山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源課題組前期獲得的鹽脅迫下油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到1 個(gè)存在明顯差異表達(dá)的bZIP 基因，將其命名為CebZIP1，利用Primer 6.0 設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。以油莎豆葉片cDNA 為模板，按照2×TSINGKE Master Mix（北京擎科生物公司）的體系和程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將所得PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后使用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）回收，測(cè)量回收產(chǎn)物濃度，連接到pMD19-T 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板挑取單克隆，菌檢為陽性后送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.3 CebZIP1 基因的生物信息學(xué)分析

用ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orff inder/）進(jìn)行開放讀碼框的查閱以及編碼氨基酸的預(yù)測(cè)；用在線軟件ProParam（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)CebZIP1 蛋白分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)；用在線軟件ProtScale（http：//web.expasy.org/pro tscale/）對(duì)CebZIP1 蛋白的疏水區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)；在WOLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）網(wǎng)站進(jìn)行CebZIP1的亞細(xì)胞定位分析。用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)（采用默認(rèn)設(shè)置）；采用SMART 軟件預(yù)測(cè)蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域；用ProtScan 分析CebZIP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用PRALINE program 網(wǎng)站（http://www.ibi.vu.nl/programs/pral inewww/）對(duì)不同物種的bZIP 蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)；用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建各物種bZIP 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，抽樣次數(shù)（Bootstrap）設(shè)置為1 000 次。

1.4 CebZIP1 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

使用植物RNA 提取試劑盒（北京全式金生物公司）提取油莎豆根、葉、塊莖的總RNA 和脅迫處理下葉片總RNA，使用ABM 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以油莎豆Ce18s rRNA為內(nèi)參基因，按照2×SYBR qPCR Mix（大連寶生物生物公司）的反應(yīng)體系，使用BioRad CFX96 Touch Real-Time PCR儀進(jìn)行RT-qPCR 基因差異表達(dá)分析，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆CebZIP1 基因的克隆和生物信息學(xué)分析

從鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得1 個(gè)差異表達(dá)的bZIP基因，名命名CebZIP1基因，經(jīng)克隆、測(cè)序，該基因cDNA 全長(zhǎng)948 bp（圖1），與前期測(cè)得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)保持一致。生物信息學(xué)分析表明，CebZIP1基因編碼315 個(gè)氨基酸；帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為40 個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為27 個(gè)，理論等電點(diǎn)（pI）為5.02（呈酸性）；蛋白分子質(zhì)量約為34.13 ku，分子式為C1457H2308N430O487S15，總原子數(shù)為4 697；不穩(wěn)定指數(shù)為49.01（屬于不穩(wěn)定蛋白），脂肪指數(shù)為68.48，總平均親水性系數(shù)值為-0.621（為親水性蛋白）；預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞核內(nèi)。由此表明，CebZIP1 是一個(gè)存在于細(xì)胞內(nèi)的親水性不穩(wěn)定酸性蛋白。CebZIP1 含有一個(gè)典型的bZIP蛋白BRLZ（Basic region leucine zipper）的結(jié)構(gòu)域，位于第144—208 位氨基酸之間（圖1）。利用ProtScan分析該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)可知，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α- 螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占36.52%和58.41%（圖2）。

2.2 油莎豆CebZIP1 轉(zhuǎn)錄因子同源比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進(jìn)一步分析油莎豆CebZIP1基因的功能，對(duì)其編碼氨基酸進(jìn)行了在線Blast 分析，結(jié)果如圖3所示，CebZIP1 與素心蘭（Cymbidium ensifolium，QEO19199.1）、鐵皮石斛（Dendrobium catenatum，XP_020676154.1）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha，XP_015688883.1）、高粱（Sorghum bicolor，XP_02131 5645.1）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003570405.1）的bZIP家族成員的氨基酸一致性較高。從第166—195、197—216 位和第222—246 位氨基酸之間可以看出氨基酸序列高度保守。

利用MEGA 7.0 軟件建立洋薊（Cynara cardunculusvar，XP_024993134.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_173381.1）、大豆（Glycine max，XP_006 604633.1）、哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica，XP_021289339.1）、茶樹（Camellia sinensis，XP_02806 3387.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002533547.1）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002533547.1）、萵苣（Lactuca sativa，XP_023737393.1）、阿比西尼亞紅蕉（Ensete ventricosum，RZS14488.1）、油棕（Elaeis guineensis，XP_029118633.1）、鳳蝶（Phoenix dactylifera，XP_0087 81732.1）、鳳梨（Ananas comosus，XP_020109470.1）、彎葉畫眉草（Eragrostis curvula，TVU32801.1）、玉米（Zea mays，XP_008681056.1）、谷子（Setaria italica，XP_004951741.1）、黍（Panicum miliaceum，RLM804 22.1）等22 種植物bZIP 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，油莎豆的bZIP 蛋白單獨(dú)聚在一支，很明顯地與其他植物的bZIP 蛋白區(qū)分出來，但與禾本科植物的遺傳距離最近（圖4）。

2.3 CebZIP1 基因的表達(dá)模式分析

通過RT-qPCR 檢測(cè)油莎豆CebZIP1基因在各個(gè)器官及鹽、干旱低溫脅迫下的相對(duì)表達(dá)量可知（圖5、6），正常情況下不同組織CebZIP1基因的表達(dá)量從高到低依次為葉、根和塊莖；葉中CebZIP1基因表達(dá)量顯著高于根和塊莖中的表達(dá)量（P＜0.05）；在非生物脅迫處理下，葉片中CebZIP1基因的表達(dá)量在24 h 內(nèi)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，并在12 h時(shí)的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)間。此外，干旱脅迫下CebZIP1基因的表達(dá)變化量高于鹽、低溫脅迫，尤其在干旱處理6～12 h 急劇上升。表明CebZIP1基因可能參與調(diào)控油莎豆非生物脅迫響應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在真核生物的基因組中，在調(diào)控動(dòng)植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及病蟲害、病原菌、澇害、低溫、高鹽等生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要功能[10]。在模式植物擬南芥[16]、葡萄、大豆[17]、玉米[18]和谷子[19]中已經(jīng)開展了多年研究。對(duì)于無參考基因組的油莎豆而言，本研究通過對(duì)前期鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘含有bZIP 結(jié)構(gòu)域的差異表達(dá)基因，命名為CebZIP1。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，關(guān)于油莎豆bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的研究非常薄弱，甚至在整個(gè)莎草科中都沒有與其近緣的bZIP 蛋白，這與莎草科植物在生產(chǎn)上的利用價(jià)值較少有很大的關(guān)系。一般來講，莎草科植物大多都具有耐貧瘠的特點(diǎn)，通過挖掘與其耐性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可為作物抗逆改良提供更多優(yōu)異的基因元件。同時(shí)本研究結(jié)果還表明，油莎豆的bZIP 蛋白與禾本科植物的bZIP 蛋白的親緣關(guān)系較近，這也與傳統(tǒng)的分類結(jié)果相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，油莎豆CebZIP1基因在鹽和干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)，這與毛雪飛等[10]研究的金銀花bZIP基因在干旱和鹽脅迫下的表達(dá)量結(jié)果一致，小麥TabZIP3基因的表達(dá)水平受鹽和干旱等顯著誘導(dǎo)，擬南芥中過表達(dá)TabZIP3基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受性[20]。揭示油莎豆CebZIP1轉(zhuǎn)錄因子同植物bZIP基因一樣，受非生物脅迫因素的誘導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)水平、增強(qiáng)油莎豆抵御逆境的能力[21]，特別是CebZIP1在脅迫處理后6 h 時(shí)表達(dá)量已經(jīng)明顯提高，說明CebZIP1基因能夠迅速響應(yīng)非生物脅迫。

本研究利用前期的鹽脅迫下油莎豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過檢索首次挖掘了含有bZIP 結(jié)構(gòu)域、且存在差異表達(dá)的CebZIP1基因，cDNA 長(zhǎng)度為948 bp，編碼315 個(gè)氨基酸，為定位于細(xì)胞核的酸性親水性蛋白?；虮磉_(dá)模式顯示，CebZIP1基因在油莎豆的根、塊莖和葉中均有表達(dá)，在葉和根中表達(dá)量顯著高于塊莖，且在葉中表達(dá)量最高；CebZIP1基因受鹽、干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且快速響應(yīng)干旱脅迫。說明CebZIP1基因參與非生物脅迫響應(yīng)，研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因在油莎豆響應(yīng)非生物脅迫中的作用提供理論依據(jù)。