鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

韓心語，鄧建峰，張麗霞，劉 倩，王 穎，田文霞

（山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷030801）

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌（Riemerel

la anatipestifer，RA）引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病，臨床上又稱鴨傳染性漿膜炎病。該病主要侵害1～8 周齡雛鴨，死亡率可達80%。鴨疫里氏桿菌容易產生耐藥性，使得臨床上對鴨疫里氏桿菌病的防控與治療造成一定的困難。該病已成為養(yǎng)鴨業(yè)經濟損失最為嚴重的細菌性傳染病之一[1]，一旦某地被檢測到鴨疫里氏桿菌病，很快將暴發(fā)為地方性疾病，且不容易根除。

鴨疫里氏桿菌最早由RIEMER 在患有流行性鵝滲出性敗血癥的病鵝中分離發(fā)現(xiàn)[2]。該菌為革蘭氏陰性菌，瑞士染色可見兩極濃染[3]，菌體呈桿狀或橢圓形，多為單個存在，無芽孢，無鞭膜，可形成莢膜。該菌屬于兼性厭氧菌，對營養(yǎng)成分要求較高，因此，常使用含5%血清的TSA 固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。鴨疫里氏桿菌血清型多達21 種，臨床上多為不同血清型間的混合或交替感染[4]。鴨疫里氏桿菌不能使糖類發(fā)酵，常將此特性作為檢測該菌的重要指標。盡管不同菌株之間生化特性存在差異，但僅通過生化指標來鑒定鴨疫里氏桿菌是比較困難的[5]。而PCR 鑒定作為一種特異性強、易于操作的技術，已經廣泛應用于鴨疫里氏桿菌的鑒定。胡清海等[6]首次建立了應用PCR 鑒定鴨疫里氏桿菌的方法體系，并設計特異性引物來鑒定鴨疫里氏桿菌的不同血清型。

鴨疫里氏桿菌病一年四季都有發(fā)生，各種應激都會促進該病的發(fā)生，如飼養(yǎng)密度大、環(huán)境衛(wèi)生差、管理不當等。該病主要經過呼吸道傳播，常呈現(xiàn)大量感染。在病程初期表現(xiàn)為精神沉郁、黃色下?。缓笃诒憩F(xiàn)為行動障礙，可見斜頸、轉圈等癥狀。剖檢可見明顯的纖維素性心包炎和肝周炎。該病的治療主要通過疫苗注射和使用抗菌藥物，但抗菌藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的濫用不僅加快了鴨疫里氏桿菌耐藥性的產生，而且食品安全問題也日益嚴重，故鴨疫里氏桿菌病的預防、控制和治療仍是當前養(yǎng)鴨業(yè)的首要待解決問題[7-8]。

本試驗從廣東和山東地區(qū)的病鴨分離鑒定鴨疫里氏桿菌，采用Kirby-Bauer 紙片法對其進行常見抗生素的耐藥性試驗，旨在為當地鴨疫里氏桿菌病提供臨床用藥參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

臨床采集廣東和山東地區(qū)疑似鴨疫里氏桿菌病的組織樣品。

供試15 種藥物有林可霉素、慶大霉素、青霉素、大觀霉素、卡那霉素、阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、恩諾沙星、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考，均購自南京建成科技有限公司。

1.2 試劑

胰酪胨大豆瓊脂（美國BD公司，貨號為CNL17-B0022）；胎牛血清FBS（杭州四季青生物有限公司，貨號為3011-8611）；瑞氏染色試劑盒（南京建成科技有限公司，貨號為D008-1-2）；革蘭氏染色試劑盒（南京建成科技有限公司，貨號為D010-1-2）；預混液Premix TaqTM、DNA Marker（索萊寶科技有限公司，貨號為M1070）。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌的分離培養(yǎng) 采用無菌操作將采集病料研磨，并用無菌PBS 稀釋，將稀釋液用0.45 μm濾器過濾。用劃線法接種于含5%血清的TSA 固體培養(yǎng)基上，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，觀察細菌菌落形態(tài)，選擇疑似菌落進行純化培養(yǎng)。傳代時培養(yǎng)皿中挑取肉眼可見半透明、圓形、微凸起的單菌落至含5%血清的TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中200 r/min 振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 染色鏡檢 挑取純化培養(yǎng)的單菌落于滴有PBS 的載玻片上進行涂片，用革蘭氏、瑞氏染色試劑盒進行染色。革蘭氏染色步驟按其說明書進行。瑞氏染色方法：瑞士吉姆薩A 液涂片染色1 min；再將瑞士吉姆薩B 液滴加A 液上，染色3 min；沖洗、干燥。然后進行顯微鏡鏡檢，觀察記錄菌落顏色與形態(tài)特征。

1.3.3 菌液PCR 檢測鑒定 挑取適量傳代培養(yǎng)單菌落作為基因擴增模板，以鴨疫里氏桿菌ATCC 11845菌株作為參考菌株，DnaK基因作為保守基因，設計鑒定引物F：ATGGAGCAAGATTTATTCATTATTTGG GATAGATGCCTAC；R：TTATTTCTTATTTTCTCCTTC AATTCTTTTATGTACTTTC。用該引物進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增試驗，PCR 反應體系為：12 μL 預混液PremixTaqTM，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，1 μL cDNA 模板和10 μL 蒸餾水，總計25 μL。PCR 最佳熱循環(huán)程序為：95 ℃3 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1.5 min，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 反應后，通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌液PCR 擴增產物。

1.3.4 藥敏試驗 參考文獻[9-10]，采用Kirby-Bauer紙片法，在無菌條件下將培養(yǎng)好的10 株菌液分別涂布在含5%血清的TSA 固體培養(yǎng)基上，涂布均勻。待稍微干燥后，用無菌鑷子將15 種藥物紙片平貼在培養(yǎng)基表面，間隔均勻，置于37 ℃條件下培養(yǎng)12 h 后觀察結果。判定藥敏抑菌結果的標準[11]為：抑菌環(huán)直徑20 mm 以上為極度敏感；15～20 mm 為高度敏感；10～15 mm 為中度敏感；在10 mm 以下為低度敏感；不出現(xiàn)抑菌環(huán)則為耐藥性。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察

試驗分離得到10 株菌株，在TSA 培養(yǎng)基上生長為半透明、光滑、濕潤、中央稍有隆起的圓形菌落，直徑為0.5～1.0 mm。在5%CO2條件下培養(yǎng)約48 h 后可見透明露珠樣小菌落（圖1）。

2.2 染色鏡檢結果

由圖2 可知，革蘭染色后，可發(fā)現(xiàn)革蘭陰性的小短桿狀病原菌，多為單個菌分布或者成對散落，少量為鏈狀排列，無鞭毛和芽胞；瑞氏染色可見兩極濃染，符合鴨疫里氏桿菌的形態(tài)特征。

2.3 PCR 擴增結果

通過特定引物進行特異性PCR 擴增，凝膠電泳結果可見清晰單一特定10 條目的條帶，確定其為鴨疫里氏桿菌（圖3）。

2.4 藥敏試驗結果

分離菌的藥敏試驗檢測結果如表1 所示，通過抑菌環(huán)直徑對比，大部分菌株對林可霉素、慶大霉素、青霉素、大觀霉素、卡那霉素、阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其中，對β- 內酰胺類（阿莫西林、青霉素、氨芐西林）、氨基糖苷類（慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、卡那霉素）和林可霉素類藥物（林可霉素）的耐藥率在50%以上，對大環(huán)內酯類（紅霉素）耐藥率較低，為10%；均對左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋鈉、四環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考高敏。

表1 鴨疫里氏桿菌分離株對不同藥物的耐藥性檢測

3 結論與討論

鴨疫里氏桿菌病可在全世界內廣泛流行[12]，嚴重阻礙了當前養(yǎng)鴨業(yè)的經濟發(fā)展。鴨疫里氏桿菌血清型較多，疫苗難以有效防治，使其成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要病原菌之一[13]。已知的鴨疫里氏桿菌至少有21 種血清型[8]，我國主要流行1 型、2 型、6 型和10 型[14]，在不同血清型之間其交叉免疫保護作用偏弱，再加上注射疫苗之后禽類產生免疫應答的時間又比較長，因此，長期以來藥物防治一直是生產中控制該病的主要措施[15-16]。當前養(yǎng)殖業(yè)中，越來越多的抗生素已被應用于臨床治療中，且使用次數及使用量越來越多。抗生素的使用雖然短時間內有所控制，但因雛鴨自身免疫力較低、疾病的傳染性較高，且飼養(yǎng)管理不當使抗生素過度使用，加劇耐藥菌株的產生。相關研究表明[3，10]，鴨疫里氏桿菌對常用的阿莫西林、青霉素和慶大霉素等抗生素已經產生單種耐藥性及多重耐藥性。本試驗分離的10 株鴨疫里氏桿菌同樣對這3 種藥物產生較強的耐藥性，其中8 株對阿莫西林產生耐藥性，6 株對青霉素產生耐藥性，5 株對慶大霉素產生耐藥性，同時7 株對其表現(xiàn)多重耐藥性，由此可見，鴨疫里氏桿菌的耐藥性日趨嚴峻。

天然性耐藥和獲得性耐藥為細菌耐藥性的2 種形式，細菌呈現(xiàn)獲得性耐藥是因為敏感性抗生素多次且長時間刺激該菌，進而使其基因突變表現(xiàn)出相應藥物的耐藥性。對鴨疫里氏桿菌的流行株進行分離及體外藥敏試驗的測定是確保藥物防治有效性的基礎檢測。SUN 等[12]對103 株鴨疫里氏桿菌完成了23 種常用抗菌藥物的耐藥性結果分析，其中68 株菌株表現(xiàn)多重耐藥性，即對2 種或2 種以上的抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥。ZHENG 等[17]完成了對分離到的里氏桿菌的耐藥菌株研究，結果表明，分離得到的菌株有40%以上對氯霉素表現(xiàn)出耐藥性，已呈現(xiàn)中度敏感，耐藥性趨勢增加。LUO 等[18]在CH-2株鴨疫里氏桿菌的全基因中找到了耐藥基因lnuH，該基因為一種新型的林可酰胺類抗性基因。XING 等[19]檢測了80 株鴨疫里氏桿菌對藥物的耐藥性情況，結果檢測到對紅霉素耐藥性菌株43 株（53.75%），通過基因分析，其分別攜帶ermF、ermFU或ereD紅霉素耐藥基因。上述報道的菌株耐藥性與本試驗結果存在較大差異，這是由于各個地區(qū)用藥習慣不同而抗藥性不同所致。吳彩艷等[20]對前幾年廣東地鴨疫里氏桿菌的耐藥性檢測表明，其對頭孢類、氟苯尼考、阿莫西林藥物敏感。本研究分離菌株對頭孢類、氟苯尼考高敏，但已經對阿莫西林完全耐藥。

本試驗分離鑒定的10 株鴨疫里氏桿菌對β-內酰胺類（阿莫西林、青霉素、氨芐西林）、氨基糖苷類（慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、卡那霉素）、林可霉素類藥物（林可霉素）的耐藥性在50%以上，對大環(huán)內酯類（紅霉素）耐藥率較低，為10%，但對喹諾酮類（左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星）、四環(huán)素類（四環(huán)素）、氯霉素類藥物（氟苯尼考）和頭孢噻呋鈉高敏。本研究對當地鴨疫里氏桿菌病的用藥預防與臨床治療提供了參考。