模擬冷鏈流通中溫度波動對腐敗希瓦氏菌的生長及其腐敗產(chǎn)物的影響

錢韻芳,林婷,曹維,葉晶鑫,謝晶*,楊勝平*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306)3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺,上海,201306)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦,是當今世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類優(yōu)良品種之一[1]。凡納濱對蝦營養(yǎng)豐富,也極易發(fā)生細菌腐敗。研究認為水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)主要由一系列化學和物理變化引起,其中微生物活動在該系列變化中起主要作用[2-3]。腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是凡納濱對蝦中的優(yōu)勢腐敗菌之一,因其較強的致腐敗能力而受到國內(nèi)外學者的關(guān)注[4-6]。其具有較強的蛋白質(zhì)分解和產(chǎn)生胺類化合物的能力,是目前冷鏈流通中水產(chǎn)品常見的特定腐敗菌[7]。為延長水產(chǎn)品在貯運過程中的保鮮期,常采用冷藏鏈流通方式來抑制腐敗菌的生長,但由于現(xiàn)階段存在冷鏈運輸裝備、操作不規(guī)范等問題,在運輸過程中容易出現(xiàn)“斷鏈”情況,引發(fā)溫度波動,進而影響水產(chǎn)品保鮮品質(zhì)[8-10]。目前研究多關(guān)注水產(chǎn)品品質(zhì)變化,未從溫度波動對微生物生長以及其代謝產(chǎn)物的影響進行分析。為研究冷鏈流通過程中溫度波動對腐敗希瓦氏菌的生長及其致腐敗能力的影響,本文使用提取的凡納濱對蝦汁為腐敗菌生長代謝提供營養(yǎng),模擬冷鏈流通過程中的3種溫度狀態(tài),分析蝦汁中腐敗希瓦氏菌的生長情況及總氨基酸含量、生物胺含量等理化指標的變化,分析溫度波動引起水產(chǎn)品品質(zhì)劣變的原因,為建立有效冷鏈流通體系,發(fā)展水產(chǎn)品貯運保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗原料與菌株

1.1.1 實驗原料

凡納濱對蝦購自上海市蘆潮港碼頭,蝦質(zhì)量為13～15 g,長度為14～15 cm,?；钸\抵實驗室后用碎冰猝死,冰水洗凈,稍晾干待用。

1.1.2 供試菌株

菌株：腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciensQY38,NCBI Accession：KX692894)為前期冷藏凡納濱對蝦貨架期終點分離純化并鑒定獲得的菌株,并于-80 ℃保藏。

1.2 試劑與儀器

丹磺酰氯(優(yōu)級純)、乙酸銨(優(yōu)級純)、乙腈(色譜純),上海安譜科學儀器有限公司；鐵瓊脂(iron agar,IA)、胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth,TSB),青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；鹽酸、NaOH、NaCl、輕質(zhì)氧化鎂、NaOCO3、HClO4均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司；氨基酸標品、生物胺標品,均為優(yōu)級純, Sigma試劑公司。

LC-2010C HT型高效液相色譜儀,日本島津公司；Kjeltec2300型凱氏定氮儀,丹麥FOSS公司；HVE-50高壓滅菌鍋,日本Hirayama公司；VS-1300L-U超凈工作臺,蘇凈安泰集團；TDL-5-型離心機,上海隆拓儀器設(shè)備公司；835氨基酸自動分析儀,日本日立公司；Sarrtorius PB-10酸度計,德國賽多利斯集團。

1.3 樣品預(yù)處理及無菌蝦汁的制備

為盡可能避免全蝦或蝦仁中存在的原始雜菌對實驗結(jié)果的干擾,本實驗采用經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的蝦汁作為腐敗希瓦氏菌的培養(yǎng)基。參考謝晶等[11]的方法,將凡納濱對蝦運抵實驗室后用冰水洗凈并去頭、去尾、去蝦線,攪碎過濾收集濾液,并用高壓滅菌鍋121 ℃下滅菌30 min備用。

1.4 腐敗菌(希瓦氏菌)菌株活化

將該菌株于TSB中在30 ℃下培養(yǎng)24 h,使菌液濃度達1.0×108CFU/mL,再取1 mL接種于TSB中,培養(yǎng)約12 h左右至菌液濃度達到105CFU/mL后待用[12]。

1.5 接種與貯藏

將滅菌的蝦汁冷卻至室溫,隨機分為3組,其中A1、B1、C1組分別加入0.01 mL腐敗希瓦氏菌菌液,對照組A2、B2、C2分別加入0.01 mL無菌TSB培養(yǎng)液?；靹蚝髮⒏鹘M置于不同溫度貯藏如圖1所示(模擬3種不同的冷鏈流通過程),對于A1、B1、C1組每24 h取1次樣,測定相關(guān)指標。對A2、B2、C2組各取3次樣(96、144和192 h),測定相關(guān)指標。

圖1 凡納濱對蝦蝦汁模擬冷鏈流通溫度波動過程Fig.1 Simulated situations of temperature changes of Pacific white shrimp juice注:(+)為接種菌液實驗組;(-)為對照組

1.6 菌落數(shù)的測定

參考YE等[12]的方法進行。

1.7 pH值的測定

吸取5 mL蝦汁樣品于燒杯中,加入無菌水至50 mL,攪拌均勻后靜置30 min,用pH計進行測定,每組樣品做2個平行[8]。

1.8 揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)的測定

取5 mL蝦汁樣品,用凱氏定氮儀測定[12]。

1.9 總氨基酸的測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[13]的方法進行測定。

1.10 凡納濱對蝦蝦汁生物胺的測定

吸取4 mL蝦汁樣品,參考謝晶等[14]的方法進行測定。

1.11 致腐敗能力分析

以貯運終點時1 CFU的腐敗菌產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物TVB-N、腐胺、尸胺為指標[15]。腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU、Y腐胺/CFU、Y尸胺/CFU分別按公式(1)、(2)、(3)計算：

(1)

(2)

(3)

式中：N0、Ns,初始點、貯運終點時的總菌數(shù),CFU/g；(TVB-N)0、(TVB-N)s,初始點、貯運終點時的TVB-N量,mg N/g；腐胺0、腐胺s,初始點、貯運終點時的腐胺含量,mg/kg；尸胺0、尸胺s,初始點、貯運終點時的腐胺含量,mg/kg。

1.12 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.5軟件繪圖,采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗希瓦氏菌菌落總數(shù)變化

腐敗希瓦氏菌生長情況如圖2所示。接菌的蝦汁初始菌落數(shù)為5.05 lg CFU/g,與新鮮對蝦的菌落數(shù)相近[16],對照組蝦汁因經(jīng)過滅菌未檢測到初始菌落,且整個流通過程中都沒有增加,說明滅菌效果良好,因此未在圖中顯示。由圖2可知,A1組蝦汁在10 ℃下貯藏24 h內(nèi)腐敗希瓦氏菌菌落數(shù)迅速上升,96 h時達到穩(wěn)定期,為9.49 lg CFU/g,從168 h開始,A1組的菌落總數(shù)開始呈現(xiàn)下降趨勢,可能是由于微生物進入衰亡期。B1組由于一直處于4 ℃條件下,其腐敗希瓦氏菌生長緩慢,至192 h菌落數(shù)為9.08 lg(CFU/g)且其變化仍呈上升趨勢。C1組的菌落數(shù)在前24 h內(nèi)的增長情況與B1組相同,之后進入10 ℃的模擬運輸過程中,其菌落數(shù)快速上升,運輸96 h后基本達到穩(wěn)定期,菌落數(shù)為9.10 lg CFU/g,當菌落數(shù)達到109CFU/g后溫度重新降至4 ℃也不能降低其菌落數(shù)。結(jié)果表明,低溫和溫度波動并不影響腐敗希瓦氏菌生長的最大菌落數(shù),但會顯著影響其增長速率,尤其是微生物快速增長的貯藏初期一旦發(fā)生溫度波動會顯著增大微生物的基數(shù),即使溫度重新降低也難以起到良好的抑制效果。張寧等[17]對于三文魚的類似研究也發(fā)現(xiàn)頻繁的溫度波動可導(dǎo)致菌落總數(shù)上升。

圖2 不同冷鏈流通條件下腐敗希瓦氏菌在凡納濱對蝦汁中的生長情況Fig.2 Growth of S.putrefaciens inoculated in Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

2.2 pH值變化

在內(nèi)源酶和微生物的作用下產(chǎn)生一系列化學反應(yīng)可導(dǎo)致水產(chǎn)品pH值發(fā)生變化[18]。3種不同冷鏈流通條件下凡納濱對蝦蝦汁pH值的變化如圖3所示,A1、B1、C1實驗組的pH值均呈現(xiàn)顯著的上升趨勢,而A2、B2、C2空白對照組的pH值均維持在6.91～6.97左右。貯藏24 h后3組實驗組的pH值開始上升,可能是腐敗希瓦氏菌分解蝦汁中的蛋白質(zhì)并積累了堿性含氮物質(zhì)引起的[19]。實驗結(jié)果表明,A1在72 h時pH值達到7.03,B1組pH值在168 h時才達到7.02,而C1組的pH值在96 h時就超過7.00。A1、C1組pH值變化與B1組存在較大差異,說明腐敗微生物生長導(dǎo)致pH的增加與溫度波動存在一定關(guān)系。

圖3 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁pH值變化Fig.3 pH value of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

2.3 TVB-N變化

水產(chǎn)品蛋白質(zhì)在微生物和內(nèi)源酶的共同作用下分解為肽和氨基酸等,氨基酸可繼續(xù)被降解為小分子揮發(fā)性的堿性含氮物質(zhì),其可用TVB-N表示[14]。本研究蝦汁TVB-N值變化如圖4所示。不同流通條件下接菌后蝦汁的TVB-N值均呈顯著上升趨勢,空白對照組的TVB-N值在整個過程中基本保持平穩(wěn)。

圖4 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁TVB-N值變化Fig.4 TVB-N contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

B1組由于全程處于4 ℃條件下,與其他實驗組相比其TVB-N含量水平較低,貯藏192 h時含量為13.11 mg/100 g。A1組在48 h后TVB-N開始快速上升,C1組TVB-N相對A1組變化較緩,但兩者在冷鏈末期TVB-N含量較為接近,分別為28.29和25.91 mg/100 g,明顯高于B1組和空白對照組,說明溫度波動可導(dǎo)致腐敗產(chǎn)物的增加,與楊勝平等[8]研究冰鮮帶魚在冷鏈流通中隨溫度波動的品質(zhì)變化結(jié)果相一致。常大偉等[20]研究發(fā)現(xiàn),溫度波動會破壞肌纖維結(jié)構(gòu),增加溶酶體數(shù)量,加速魚肉蛋白質(zhì)的分解。A1、B1、C1樣品的TVB-N上升趨勢與細菌菌落數(shù)的增長呈一定相關(guān)性,說明TVB-N變化與微生物間存在聯(lián)系。

2.4 總氨基酸含量變化

作為優(yōu)質(zhì)蛋白的來源,水產(chǎn)品富含氨基酸,而氨基酸又是大部分腐敗產(chǎn)物的前體化合物[21],因此本文測定了蝦汁中總氨基酸含量的變化。根據(jù)實驗組在整個貯藏過程中腐敗希瓦氏菌菌落總數(shù)和TVB-N含量的變化趨勢,分別選取了A1組在第0、24、96和192 h；B1組在第0、96、120和192 h；C1組在第0、48、96和192 h；A2、B2、C2組分別在第0和192 h時進行總氨基酸含量的測定,其含量變化如圖5所示。結(jié)果顯示,蝦汁總氨基酸的初始值為276.87 mg/g,在3種不同冷鏈條件的流通中,總氨基酸的含量均呈下降趨勢。在貯運終點(192 h)時,A2、B2和C2對照組總氨基酸含量略有下降,且各組變化幅度相近,這可能是與游離氨基酸氧化分解有關(guān),而A1、B1、C1實驗組的總氨基酸含量出現(xiàn)顯著下降,分別為170.48、169.51和160.92 mg/g,說明腐敗希瓦氏菌的生長繁殖需要消耗蝦汁中的氨基酸。C1組中蝦汁總氨基酸含量下降幅度最大,其所處的冷鏈流通中的溫度波動頻率最高,因此推測溫度波動促進了腐敗希瓦氏菌的代謝活動,進而加速氨基酸的降解導(dǎo)致水產(chǎn)品品質(zhì)下降[22]。

圖5 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁總氨基酸含量變化Fig.5 Contents of total amino acids of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

模擬貯運過程中大多數(shù)的氨基酸含量都呈下降趨勢,其中酪氨酸、賴氨酸、精氨酸的含量下降最為明顯,這3種氨基酸含量的變化趨勢如圖6、7、8所示。

蝦汁中酪氨酸的初始含量為10.01 mg/g,在經(jīng)過192 h不同冷鏈條件的貯運后,A1、B1、C1實驗組的酪氨酸含量分別下降至2.06、4.45和2.10 mg/g；精氨酸含量由最初的24.19 mg/g分別降低至12.34、17.61 和12.21 mg/g；賴氨酸含量則由19.44 mg/g分別下降至14.05、12.54 和12.69 mg/g。對照組中蝦汁的酪氨酸、精氨酸和賴氨酸的含量均無明顯變化,且精氨酸、酪氨酸含量的變化與腐敗希瓦氏菌菌落數(shù)的變化具有一定相關(guān)性,因此推斷蝦汁中氨基酸含量的下降主要由腐敗希瓦氏菌生長和代謝活動引起的。C1組氨基酸變化與A1組差異較小,而與B1組差異顯著,說明溫度波動可導(dǎo)致腐敗希瓦氏菌對這3種氨基酸的需求量提高,從而促進相關(guān)氨基酸的降解。

圖6 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁酪氨酸含量變化Fig.6 Tyrosine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics process

圖7 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁精氨酸含量變化Fig.7 Arginine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

圖8 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁賴氨酸含量變化Fig.8 Lysine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

2.5 生物胺含量變化

微生物的脫羧酶能夠?qū)⑺a(chǎn)品中的氨基酸脫羧生成生物胺類物質(zhì)[23-24]。這類反應(yīng)過程能幫助微生物獲得能量或者抵御不良環(huán)境[25]。生物胺的累積不僅會導(dǎo)致水產(chǎn)品的品質(zhì)劣變,過量攝入如組胺、酪胺、五羥色胺等生物胺,還可能導(dǎo)致食物中毒[26]。通過檢測發(fā)現(xiàn)接種腐敗希瓦氏菌的蝦汁中生物胺類物質(zhì)主要為腐胺和尸胺,與本課題組前期研究[17,27]結(jié)果相一致,其變化如圖9、10所示。凡納濱對蝦汁內(nèi)最初的腐胺含量為3.48 mg/kg,A1、C1組在24和48 h時腐胺的含量已經(jīng)分別上升至179.81和150.77 mg/kg,而B1組的蝦汁在96 h時腐胺的含量僅為53.26 mg/kg。不同模擬冷鏈流通條件下的接菌組蝦汁中腐胺含量不斷上升,A1、B1、C1的腐胺含量在192 h時分別達到310.78、142.56 和327.32 mg/kg,而3個溫度波動條件下的對照組A2、B2、C2蝦汁中腐胺含量變化不大,說明腐胺的生成主要是由腐敗希瓦氏菌代謝產(chǎn)生。貯運初期的溫度波動導(dǎo)致腐胺的累積快速增加并在中后期不再受降溫的影響。食品中的腐胺可以由精氨酸代謝產(chǎn)生[28],與本研究中腐胺含量的升高和精氨酸含量的下降趨勢相一致。

圖9 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁腐胺含量變化Fig.9 Putrescine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

如圖10所示,A1、B1、C1組蝦汁中尸胺含量不斷上升,且在開始的24 h內(nèi)A1組的尸胺含量由起始的2.21 mg/kg快速上升至58.07 mg/kg,在48 h內(nèi),C1組的尸胺含量上升至40.77 mg/kg,說明相對較高的環(huán)境溫度以及存在溫度波動的環(huán)境有利于蝦汁中尸胺的產(chǎn)生和累積。同時,在貨架期終點即第192 h時,C1組中的尸胺含量已經(jīng)超過了A1組,為123.17 mg/kg,說明溫度波動對尸胺含量的增加有較大影響。而空白對照組的A2、B2、C2中尸胺的含量基本穩(wěn)定,表明尸胺含量的增加主要由腐敗希瓦氏菌代謝產(chǎn)生。與腐胺不同的是,尸胺的前體化合物是賴氨酸[29]。

圖10 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁尸胺含量變化Fig.10 Changes in cadaverine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

2.6 腐敗希瓦氏菌致腐敗能力分析

腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子在數(shù)值上等于單位數(shù)量腐敗菌產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物的量,可作為衡量腐敗菌致腐敗能力的依據(jù)[15,30]。如表1所示,A1和C1組蝦汁中貯運末期腐敗希瓦氏菌TVB-N產(chǎn)量因子和尸胺產(chǎn)量因子均明顯大于B1組,說明在外界較高溫度以及溫度波動條件下腐敗希瓦氏菌的致腐敗能力比在4 ℃恒溫條件下強。同時,C1組在貨架期終點時的菌落總數(shù)為1.26×109CFU/g,明顯低于A1組,但C1組蝦汁中的腐敗希瓦氏菌TVB-N產(chǎn)量因子(YTVB-N/CFU)的數(shù)值約為A1、B1組的2～3倍,尸胺產(chǎn)量因子(Y尸胺/CFU)約為A1、B1組的3倍。C1組貯藏末期的腐胺產(chǎn)量因子(Y腐胺/CFU)也高于B1和A1組,說明與較高溫度條件相比,外界環(huán)境的溫度波動更能促進腐敗希瓦氏菌產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物。

表1 不同冷鏈流通過程中接菌凡納濱對蝦汁的致腐因子比較Table 1 Yield factors in TVB-N,putrescine and cadaverine contents of inoculated Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

3 結(jié) 論

通過分析腐敗希瓦氏菌在3種不同模擬冷鏈流通條件下的凡納濱對蝦蝦汁中微生物生長、腐敗產(chǎn)物產(chǎn)量及氨基酸含量變化等,研究了腐敗菌的生長和代謝活動,發(fā)現(xiàn)溫度波動會加速流通初期腐敗希瓦氏菌的生長繁殖,加速蛋白質(zhì)的水解,導(dǎo)致TVB-N、腐胺、尸胺含量不斷增加,且后期恢復(fù)低溫也不能有效抑制微生物生長和腐敗產(chǎn)物的累積,這可能是溫度波動間接導(dǎo)致水產(chǎn)品品質(zhì)劣變的原因。因此,水產(chǎn)品在冷鏈流通過程中尤其是貯運初期應(yīng)盡可能避免溫度波動出現(xiàn)“斷鏈”現(xiàn)象。