貝類多糖研究進(jìn)展

劉志芳,趙前程,劉志東,段蕊,林娜,張俊杰

1(江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 連云港,222005)2(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 大連,116023)3(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海,200090)

貝類屬軟體動(dòng)物門(mén),全球現(xiàn)有貝類品種11萬(wàn)種以上,是動(dòng)物界中僅次于節(jié)肢動(dòng)物的第二大門(mén)類[1]。貝類分布廣泛,根據(jù)生活環(huán)境的不同,可以分為海水貝類、淡水貝類和陸生貝類,又以海水貝類居多,約占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%。目前,我國(guó)已經(jīng)成為全球最大的海水貝類養(yǎng)殖國(guó),2019年,我國(guó)貝類產(chǎn)量達(dá)1 500萬(wàn)t[2]。我國(guó)現(xiàn)有海水養(yǎng)殖貝類約30多種,達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)水平的貝類主要有牡蠣、蛤、扇貝、蟶和貽貝等。

豐富的貝類品種,巨大的生物資源量為開(kāi)發(fā)貝類生物活性物質(zhì)提供了良好的原料基礎(chǔ)。貝類種屬、習(xí)性及生存環(huán)境的差異導(dǎo)致了貝類多糖組成及結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,促成了貝類多糖生物活性和功能特性的獨(dú)特性和多樣性[3]。貝類多糖具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等生物活性,以及降血壓、降血糖、降血脂、溶血栓、緩解動(dòng)脈硬化、降低肝臟損傷等藥理作用。這些功效決定了貝類多糖可以成為功能性食品、特膳食品和創(chuàng)新藥物的良好來(lái)源,具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。

本文綜述了貝類多糖的制備、分離純化、結(jié)構(gòu)解析、生物活性和功能特性的研究進(jìn)展,總結(jié)歸納了制備方法、結(jié)構(gòu)及活性三者間的關(guān)系,以期為貝類多糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 貝類多糖的制備

常用制備方法主要有水提法、堿提法、酶解法和鹽提法及超聲波輔助提取法等,如表1所示。提取方法不同,貝類多糖的組成、結(jié)構(gòu)、活性及應(yīng)用等也不盡相同。貝類多糖的含量、得率等受原料的屬性、采收時(shí)間、組織部位、儲(chǔ)藏方式及預(yù)處理方法等因素影響。雄性鮑魚(yú)內(nèi)臟中所含的還原糖較雌性高；不同養(yǎng)殖場(chǎng)中縊蟶游離總糖含量差別較大,最大含量差約為40%,且隨季節(jié)變化程度大[4-5]。冷凍和冷藏均會(huì)降低貝類多糖提取率,冷藏影響更大,扇貝裙邊及柱中多糖提取率存在差異[6]。原料的生熟則會(huì)影響紫貽貝肉多糖含量,熟貝肉較生貝肉制得的多糖提取率高[7]。

表1 貝類多糖提取方式的對(duì)比Table 1 Different extraction methods of shellfish polysaccharides

1.1 水提取法

水提法即以水為溶劑進(jìn)行提取,包括冷水、熱水提取法,條件簡(jiǎn)單、溫和,成本低,無(wú)試劑殘留,但多糖提取率明顯低于其他方法,且花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),與多糖相連的多肽鏈不易去除,適用于多糖含量高的組織提取。ADANE等[8]采用125.01 ℃的亞臨界水提取牡蠣凍干粉中多糖,得率為18.66%,較常溫水提牡蠣脫脂粉多糖得率高出2.56%[9]。

1.2 中性鹽提取法

中性鹽提取即以氯化鈉、醋酸鈉、磷酸鹽等為溶劑進(jìn)行提取,該方法較溫和,但會(huì)破壞多糖的硫酸基團(tuán),含硫酸基團(tuán)的多糖生物活性較中性多糖強(qiáng),因此中性鹽提取法不適用于含硫酸基團(tuán)的多糖的制備。陳駿洪[10]采用中性鹽提取法提取縊蟶粉多糖,結(jié)果表明在80 ℃、料液比1∶90(g∶mL)、提取2 h時(shí),多糖得率最高,為1.43%。

1.3 堿提取法

堿提法主要通過(guò)堿溶液(主要是NaOH、KOH等)破壞糖與蛋白間的酯鍵,促進(jìn)多糖溶于溶液,但也會(huì)對(duì)多糖的糖苷鍵造成一定破壞。QIN等[11]重復(fù)了不同實(shí)驗(yàn)中水提、KOH提取及酶解制備牡蠣多糖的最優(yōu)條件,最終確定KOH提取時(shí)上清液中多糖含量最高。研究發(fā)現(xiàn),多糖在強(qiáng)堿作用下易水解,堿提法在提取多糖后一般需要透析數(shù)天以清除鹽殘留,若操作不當(dāng),多糖易被分解,可采用膜分離技術(shù)有效脫除小分子雜質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),二價(jià)陽(yáng)離子(Ca2+、Mg2+)對(duì)硫酸多糖有聚集作用,比一價(jià)陽(yáng)離子(Na+、K+)影響大。因此,堿提法應(yīng)該選取具有低價(jià)鍵的陽(yáng)離子以防止硫酸多糖變性[12]。

1.4 酶解法

酶解法主要利用蛋白酶切斷蛋白肽鍵使得多糖溶出,不破壞多糖結(jié)構(gòu),提取效率高,能夠有效去除與多糖相連的肽鏈,實(shí)現(xiàn)脫蛋白。目前應(yīng)用于貝類多糖制備的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶等。不同酶切割位點(diǎn)各不相同,部分可能重合,因此,多種酶同時(shí)使用時(shí)要考慮其是否具有更高的效率。劉志昌[6]通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加酶量?jī)H為鮮重的0.3%時(shí)酶解率即達(dá)到最高值,其他條件為料液比1∶3(g∶mL),時(shí)間5 h,提取率為7.49%,水提法提取率最高為4.22%,酶解制備多糖較水提法得率高出0.77倍,且耗時(shí)短,酶解所需溫度低于水提。YUAN等[13]采用酶解法和水提法提取縊蟶多糖,在可見(jiàn)光及紫外可見(jiàn)光成像中可以明顯觀察到酶解制得的多糖量更多,在最佳條件下提取率最高可達(dá)到17.72%。

1.5 超聲波輔助提取法

研究表明,超聲波對(duì)組織結(jié)構(gòu)的破壞是無(wú)差別的,超聲波輔助提取法能夠有效促進(jìn)組織分離,加速多糖溶出,同時(shí)也會(huì)對(duì)多糖內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成破壞,一般作為輔助提取方法使用。超聲波輔助提取法制備多糖的得率較單獨(dú)水提或酶解高,孫萍萍等[14]利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化縊蟶的制取,發(fā)現(xiàn)超聲波輔助提取法能夠提高水提和酶解法的多糖提取率,多出約1 mg/g。

1.6 其他

此外,多糖的制備還有其他方法,微波輔助提取法會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)；超臨界流體萃取法成本較其他方法高,但效率高、試劑殘留少；H2O2輔助提取法適用于寡糖的制備[15]。

采用酶解法制備貝類多糖得率大于堿提,水提、酸提法得率次之,多種方法疊加或多種酶復(fù)合進(jìn)行提取得率普遍較單一方法高。多種方法制取河蚌多糖時(shí),酶解制多糖得率最高,其次是堿提,水提多糖得率最低,電場(chǎng)輔助酶解能夠使其得率提高約1%[16]。堿提法制得的紫貽貝多糖得率最高,其次是水提法,酸提法得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他2種方法[17]。

2 貝類多糖的脫蛋白

多糖脫蛋白的常用方法有Sevage法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法、鹽酸法、酶解法、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(glucono-delta-lactone,GDL)法。酶解法多用于脫除蛋白含量高的多糖中蛋白。

Sevage法作用條件溫和,但去除與多糖相連蛋白的效果差,需要重復(fù)數(shù)次,試劑毒性大,不利于操作及試劑的脫除[18]。

TCA法脫蛋白效果好且多糖損失率較Sevage法低,但高濃度、長(zhǎng)時(shí)間處理會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu),試劑難以及時(shí)脫除,在使用酸法脫蛋白時(shí)要綜合考慮溶液與酸接觸時(shí)間,較Sevage法更適用于貝類多糖脫蛋白[19]。

GDL法脫蛋白率高,無(wú)毒,經(jīng)濟(jì),耗時(shí)長(zhǎng)。劉瑀等[20]比較了TCA法與GDL法用于蝦夷扇貝多糖脫蛋白的效果。結(jié)果表明,GDL法脫蛋白率達(dá)到了99.06%,較TCA法高10.41%,試劑用量少,更經(jīng)濟(jì),但需要加熱,TCA法脫蛋白試劑用量較前者用量高出3～20倍,無(wú)需加熱。

雙水相萃取法是利用2種互不相溶的溶質(zhì)在特定濃度或溫度下形成不互溶富水相,以實(shí)現(xiàn)分離。CHEONG等[21]采用雙水相萃取法,以去除牡蠣多糖所含蛋白,該方法易操作、無(wú)毒、低成本,多糖與蛋白不能單獨(dú)存在于某一相中,單一溶質(zhì)最多能夠提取67.02%的多糖,所得多糖分子量較低。

反復(fù)凍融法可以使含疏水基團(tuán)的蛋白變性、沉降,多次冷凍有利于蛋白的脫除,多糖得率有所下降。XIONG等[22]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凍融法的蛋白脫除率與糖得率均高于Sevage法,處理不宜超過(guò)10次。

雙醛纖維素(DAC)通過(guò)與蛋白結(jié)合達(dá)到脫蛋白目的,磁性殼聚糖微球(MCM)、樹(shù)脂能夠吸附蛋白,其中DAC法效果優(yōu)于Sevage法,吸附法綠色可回收[23-25]。

除Sevage法外,目前大部分方法可以在脫蛋白的同時(shí)脫色。

3 貝類多糖的結(jié)構(gòu)

3.1 貝類多糖的結(jié)構(gòu)解析方法及基本結(jié)構(gòu)

貝類多糖的單糖組成、支鏈結(jié)構(gòu)、特征基團(tuán)、連接方式等存在顯著差異,如表2所示。

表2 貝類多糖的結(jié)構(gòu)解析Table 2 Structural analysis of shellfish polysaccharides

結(jié)構(gòu)決定性質(zhì),性質(zhì)反映結(jié)構(gòu),開(kāi)展貝類多糖結(jié)構(gòu)的解析有利于探究其作用機(jī)理。貝類多糖主鏈中含有吡喃葡萄糖和甘露糖,其他單糖糖種類及含量不固定,主要含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖,及多種糖胺、糖醛酸,支鏈結(jié)構(gòu)多樣,支鏈平均間隔6～7個(gè)主鏈單糖。LIU等[3]分析了5種貝類所含糖醛酸,結(jié)果表明甘露糖醛酸與其他3種非甘露糖醛酸具有組織及物種特異性,僅存在于部分貝類中,貝類所含糖醛酸種類與親緣關(guān)系相關(guān)。曹九零[37]分析了20種海洋貝類多糖,結(jié)果表明其中性及硫酸多糖含量與種屬間無(wú)顯著關(guān)系。由于目前多糖研究涉及的貝類種類較少,結(jié)構(gòu)解析尚缺乏種間、活性間的相關(guān)分析,也無(wú)法針對(duì)貝類多糖的結(jié)構(gòu)與種間關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)性分析。已有信息表明,淡水螺較海水螺單糖組成簡(jiǎn)單,雙殼貝類較單殼貝類支鏈組成更為復(fù)雜。

3.2 影響貝類多糖結(jié)構(gòu)的因素

冷水提和熱水提較酶解獲得的多糖單糖組成簡(jiǎn)單,高溫、萃取劑、堿會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)降低其分子質(zhì)量。酶解獲得的紫貽貝多糖MT0-A1單糖組成較復(fù)雜,含有α-D-GalNAcp、β-D-GlcNAcp、α-D-Manp、α-D-Galp、α-L-Fucp等,其中主鏈部分主要由→2)Galp-(1→,→3)Manp-(1→,→3)Galp-(1→組成,側(cè)鏈部分主要由Manp-(1→,Fucp-(1→組成,冷水提取的多糖LTS1-A在所有提取所得多糖中含糖量最高,高達(dá)79.4%,單糖組成最簡(jiǎn)單,僅主要由Glc單糖構(gòu)成。另外一種冷水提多糖由多種單糖組成,但該多糖所占比例較小,熱水提所得的多糖單糖組成較單一,主鏈主要是(1→4)-α-D-Glcp,主鏈單糖∶支鏈=6∶1,支鏈由不同鍵連接的葡聚糖構(gòu)成[7]。因此,酶解法制得的多糖較水提法制得的多糖單糖組成更全面,結(jié)構(gòu)更為完整,更具研究?jī)r(jià)值。

亞臨界水提取牡蠣多糖(CGPs)的平均分子質(zhì)量為108 kDa,低于熱水萃取法,高于雙水相萃取法,后兩者所得多糖平均分子質(zhì)量分別為6 500 kDa、3.48 kDa,其活性各有特點(diǎn)[7]。高蒙蒙[9]采用常溫、熱水、堿提取的牡蠣多糖其分子量、糖及蛋白含量各不相同,分子質(zhì)量分別為2 100、2 000、980 kDa,其中堿提法制得多糖蛋白含量最高(47.7%)。在制備高純度、結(jié)構(gòu)完整的多糖時(shí)不建議采用雙水相萃取法、堿提法。

4 貝類多糖的生物活性

4.1 貝類多糖的主要生物活性

由表3可知，貝類多糖普遍具有抗氧化、抗紅細(xì)胞溶血的活性,部分具有抑菌、提高免疫細(xì)胞活性、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性,對(duì)多種急慢性疾病具有顯著療效,能夠抗疲勞、降三高、護(hù)肝、溶解血栓、延緩衰老,某些貝類多糖還具有抗流感病毒、HIV、HSV、HBsAg的能力。貝類多糖生物活性多樣,無(wú)毒副作用,部分活性強(qiáng)的多糖可以藥用,以減少機(jī)體損傷。

表3 貝類多糖的生物活性Table 3 Biological activities of shellfish polysaccharides

研究表明,多糖具有保濕、美白、修復(fù)受損皮膚等功效,安全性高,特別是來(lái)源于動(dòng)物的透明質(zhì)酸(酸性黏多糖)保濕效果更佳,能夠有效阻隔紫外線、細(xì)菌侵襲,并滲入皮膚細(xì)微改變皮膚狀態(tài)?，F(xiàn)有的多糖口服液多以植物原料為主,水產(chǎn)品中海參多糖口服液具有保健滋補(bǔ)功效,可知貝類多糖產(chǎn)品仍具有廣闊應(yīng)用前景。企鵝珍珠貝、馬氏珠母貝多糖具有一定的保濕能力,但效果弱于牡蠣、翡翠貽貝多糖,可以用于以保濕為目的的化妝品原料,其他功能方面仍有待研究[29]。貝類多糖活性多樣、來(lái)源廣泛、效果顯著,對(duì)其功能的深入研究將有利于化妝品、特膳食品、醫(yī)藥等的研發(fā)。

4.2 影響貝類多糖生物活性的因素

4.2.1 原料及制備方法

貝類的組織部位及制備方法等均會(huì)影響多糖種類及結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響其生物活性及穩(wěn)定性。酶解制得的多糖結(jié)構(gòu)更為完整,更有利于結(jié)構(gòu)解析及活性的保持,酸性環(huán)境不利于貝類多糖維持其活性,高溫會(huì)造成貝類多糖活性的損失。劉志昌[6]提取的扇貝裙邊多糖與扇貝柱多糖相比,清除自由基、超氧陰離子、亞硫酸根能力及鐵還原能力更高,酶解法較水提法制得的多糖活性高。程仕偉等[17]研究了采用不同方法制備的紫貽貝多糖的抗氧化活性,水提和堿提法制備的多糖·OH、超氧陰離子、亞硝酸根清除能力較酸提多糖強(qiáng)。此外,不同干燥方式也會(huì)影響貝類多糖的生物活性,如真空冷凍干燥處理,多糖的DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、·OH清除能力強(qiáng)于真空干燥處理多糖,兩者自由基清除能力均強(qiáng)于熱風(fēng)干燥處理多糖[54]。

4.2.2 多糖分子質(zhì)量及組成

研究表明,分子質(zhì)量不同的貝類多糖生物活性存在差異,具有抗氧化活性的貝類多糖多以α-吡喃葡聚糖為主要成分,糖蛋白具有抗腫瘤的生物活性。YANG等[54]研究發(fā)現(xiàn),褶紋冠蚌分子質(zhì)量大于30 kDa的糖蛋白對(duì)小鼠S180肉瘤、EAC腹水瘤抑制效果明顯且無(wú)毒害作用,小于30 kDa的多糖基本無(wú)抑制作用。ZHONG等[55]將低分子質(zhì)量的牡蠣多糖LMW-OPS(主要成分為α-D-葡萄糖醛酸,分子質(zhì)量為1 980～2 630 Da)注射到小鼠腹腔,能夠抑制其體內(nèi)的CMT93和CT26腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),但并不直接抑制2種細(xì)胞的增殖,而是通過(guò)緩解腫瘤細(xì)胞對(duì)骨髓源性樹(shù)突細(xì)胞功能的抑制作用,激發(fā)樹(shù)突狀細(xì)胞活性,增強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)活性,進(jìn)而起到抗腫瘤作用。SHI[38]等研究發(fā)現(xiàn)牡蠣多糖CGPS-1(分子質(zhì)量約為6.50×106Da的葡萄糖聚合物)能夠降低AST、ALT、MDA含量,提高SOD活性,進(jìn)而改善肝損傷。雷曉凌等[56]對(duì)酶解獲得的糖胺聚糖SG1(含氮2.7%)進(jìn)行體外抗HL260細(xì)胞實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,不同劑量SG1對(duì)HL260細(xì)胞均有抑制作用,且抑制作用隨著用量的增加而增強(qiáng),脫蛋白的縊蟶多糖具有多種抗氧化活性,暫時(shí)還沒(méi)有關(guān)于高純度縊蟶多糖免疫及抗腫瘤活性的報(bào)道。

4.2.3 改性

為了獲得目標(biāo)生物活性或功能特性更強(qiáng)的多糖,研究人員開(kāi)展了多糖的改性研究。目前,貝類多糖的改性主要以硫酸化為主,能夠顯著增強(qiáng)其免疫活性,賦予其抑制癌細(xì)胞增殖的活性。TAWUT等[57]將硫酸化的紫貽貝多糖SP作用于野生貽貝,探究其免疫應(yīng)答效應(yīng),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SP會(huì)增加貽貝血細(xì)胞活性,溶菌酶活性也有所提高。硫酸酯化后的青蛤多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用[58]。硫酸酯化的牡蠣多糖CT-S2具有增強(qiáng)凝血效果的作用,并且對(duì)HCT-116、HL-60、A-549細(xì)胞也具有抑制作用[9]。牡蠣C6取代的硫酸化多糖SOG較C2和C3取代的SOG1刺激淋巴細(xì)胞增殖的效果更明顯,因此,取代基團(tuán)的位置也會(huì)影響改性多糖的活性[59]。

5 結(jié)語(yǔ)

本文綜述了貝類多糖的制備、分離純化方法、結(jié)構(gòu)特征、生物活性和功能特性,分析了影響貝類多糖組成、結(jié)構(gòu)及活性的內(nèi)在和外在因素,探究了貝類多糖的構(gòu)效關(guān)系,探討了其在化妝品、保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用,期望能夠?yàn)樨愵惗嗵堑纳疃壤锰峁┗A(chǔ)信息。未來(lái),不同種類的貝類多糖、結(jié)構(gòu)、功能及機(jī)理研究還有待深入和拓展,期望本文能夠?yàn)樨愵惗嗵堑纳疃乳_(kāi)發(fā)利用提供參考。