胚齡對(duì)于CC級(jí)別單囊胚凍融移植周期妊娠結(jié)局的影響

趙 明，黃 亞，杜 通，林嘉盈，祁秀娟，徐 利，陸文怡，匡延平

1.上海永遠(yuǎn)幸婦科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海200131；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科，上海200011

隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)的成熟，囊胚移植的應(yīng)用愈加廣泛。囊胚移植比分裂期胚胎移植的臨床妊娠率更高［1］，這可能是因?yàn)橛捎谀遗叩捏w外培養(yǎng)過程，能夠淘汰部分遺傳物質(zhì)異常的囊胚，并且內(nèi)膜和胚齡更為同步［2-5］。單胚胎移植策略可有效避免多胎妊娠及其引起的妊娠期高血壓、早產(chǎn)、不良出生結(jié)局等風(fēng)險(xiǎn)，并且研究表明單胚胎移植策略不會(huì)降低累計(jì)妊娠率［6-7］。為獲得最佳的臨床結(jié)局，需要選擇一個(gè)具有足夠發(fā)育潛能的囊胚進(jìn)行移植。研究［8-10］表明，囊胚質(zhì)量與妊娠結(jié)局密切相關(guān)，高質(zhì)量囊胚的妊娠結(jié)局最好。

由于低質(zhì)量囊胚的發(fā)育潛能不如高質(zhì)量囊胚，很多生殖中心不凍存CC 級(jí)別囊胚［11］。但對(duì)于難以獲得高質(zhì)量囊胚的患者，移植CC 級(jí)別囊胚會(huì)增加患者的受孕機(jī)會(huì)。然而，對(duì)于移植CC 級(jí)別囊胚的臨床結(jié)局情況，以及不同胚齡對(duì)于CC 級(jí)別囊胚的妊娠結(jié)局的影響等問題國(guó)內(nèi)外研究資料較少，結(jié)論尚不明確。本研究旨在探討移植CC 級(jí)別囊胚的妊娠結(jié)局情況以及不同胚齡對(duì)于CC 級(jí)別囊胚凍融移植周期妊娠結(jié)局的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究回顧性分析了從2017年4月—2019年12月于上海永遠(yuǎn)幸婦科醫(yī)院進(jìn)行單個(gè)凍融囊胚移植的565例患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單囊胚移植周期。②冷凍復(fù)蘇移植周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未經(jīng)處理的輸卵管積水。②先天或后天生殖道畸形。③夫妻任意一方染色體核型分析異常。若患者進(jìn)行了多個(gè)移植周期，僅納入第一個(gè)移植周期。

本中心采用Gardner 評(píng)分系統(tǒng)［12］，從囊胚發(fā)育分期、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞3個(gè)方面對(duì)囊胚質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。囊胚發(fā)育分期：1期，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期，囊胚腔大于胚胎總體積的1/2；3期，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期，囊胚全部從透明帶中逸出。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級(jí)：A級(jí)，細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級(jí)，細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C級(jí)，細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞分級(jí)：A級(jí)，細(xì)胞較多，結(jié)構(gòu)致密；B級(jí)，細(xì)胞不多，結(jié)構(gòu)松散；C級(jí)，細(xì)胞稀少，結(jié)構(gòu)疏松。本研究中將4～6期AA、AB、BA級(jí)別囊胚定義為高質(zhì)量囊胚，4～6期BB、AC、CA級(jí)別囊胚定義為中質(zhì)量囊胚，4～6期CB、BC級(jí)別囊胚定義為低質(zhì)量囊胚，將4～6期CC級(jí)別囊胚定義為CC級(jí)別囊胚［8，11］。所有納入移植周期依據(jù)囊胚質(zhì)量分為：高質(zhì)量囊胚組（n=189）、中質(zhì)量囊胚組（n=114）、低質(zhì)量囊胚組（n=140）和CC級(jí)別囊胚組（n=122）。

1.2 研究方法

1.2.1 囊胚培養(yǎng) 自然周期、微刺激、激動(dòng)劑、拮抗劑等常規(guī)促排卵方案參照《輔助生殖促排卵藥物治療專家共識(shí)》進(jìn)行［13］。高孕激素狀態(tài)下促排卵方案（progestin primed ovarian stimulation，PPOS） 在我們先前發(fā)表論文［14］中有詳細(xì)描述，常規(guī)方法為自患者月經(jīng)第3 日起予以每日甲羥孕酮（浙江仙琚制藥股份有限公司）4 mg 口服和人類絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，hMG）150～225 IU（麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司）肌內(nèi)注射，直至誘發(fā)排卵。取卵后4～6 h 進(jìn)行體外受精（in vitro fertilization，IVF）或者卵質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）。囊胚培養(yǎng)采用序貫培養(yǎng)液，在37 °C 條件下培養(yǎng)。受精后第5 日（D5）觀察胚胎并冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎，其余胚胎則繼續(xù)培養(yǎng)至第6日（D6）或第7日（D7）進(jìn)行冷凍。

1.2.2 囊胚冷凍與復(fù)蘇 采用Cryotop冷凍載桿（Kitazato Corporation，日本）進(jìn)行胚胎冷凍。冷凍前利用激光對(duì)胚胎進(jìn)行人工皺縮，并將胚胎放置培養(yǎng)液中5～15 min。隨后將胚胎轉(zhuǎn)入冷凍液中放置1 min，并在90 s 內(nèi)轉(zhuǎn)移至Cryotop 上，放入液氮中保存。復(fù)蘇時(shí)，將胚胎從液氮中移出并迅速轉(zhuǎn)移至37℃的解凍液1 min，然后依次將胚胎轉(zhuǎn)入稀釋液、初次洗滌液、二次洗滌液中分別室溫放置3 min、5 min 和1 min［15］。隨后將胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)，2 h 后移植。采用Hamilton 激光打孔儀（Hamilton，美國(guó)；型號(hào)ZILOS-tk）對(duì)胚胎進(jìn)行激光打孔輔助孵化。去除透明帶后，培養(yǎng)2～6 h后進(jìn)行移植。

1.2.3 內(nèi)膜準(zhǔn)備 （1）自然周期：月經(jīng)規(guī)律者，自月經(jīng)周期第10～12日起陰道B超檢測(cè)排卵。排卵后即開始黃體支持，排卵后第5日進(jìn)行胚胎移植。

（2）微刺激周期：月經(jīng)不規(guī)律及排卵障礙者，自月經(jīng)第3 日起每日服用來(lái)曲唑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）2.5～5.0 mg，共計(jì)服用3～5 d；月經(jīng)第10日復(fù)查B超，若主卵泡直徑<14 mm，則隔日注射hMG 150 IU，直到誘發(fā)排卵。排卵后開始黃體支持，排卵后第5日進(jìn)行胚胎移植。

（3）人工周期：月經(jīng)不規(guī)律及內(nèi)膜薄病史者，自月經(jīng)第3 日起服用口服雌二醇（Abbott Healthcare Products，荷蘭），當(dāng)內(nèi)膜厚度超過8 mm 后開始黃體支持，在黃體支持的第6日進(jìn)行胚胎移植。

黃體支持為口服地屈孕酮（Abbott Healthcare Products，荷蘭）、口服雌二醇地屈孕酮片（Abbott Healthcare Products，荷蘭）和陰道塞入黃體酮軟膠囊（法國(guó)Laboratoires，法國(guó)），黃體支持持續(xù)到妊娠后8周。

1.2.4 妊娠結(jié)局判定 生化妊娠定義為移植后14 d 血β-人絨毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin，β-HCG）>5 IU/L。生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%。臨床妊娠定義為移植后35 d B超下見妊娠囊及原始心管搏動(dòng)。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%。早期流產(chǎn)定義為妊娠12 周內(nèi)自然或人工流產(chǎn)。早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)妊娠數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。持續(xù)妊娠率的定義為妊娠20 周及以后周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%。異位妊娠率的定義為異位妊娠數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 語(yǔ)言（3.6.1）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilktest 檢驗(yàn)正態(tài)分布和Levene's test 檢驗(yàn)方差齊性。正態(tài)分布且方差齊性資料以±s 表示，組間差異比較采用方差分析；非正態(tài)分布或方差不齊資料以M（Q1，Q3）表示，組間差異比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。定性資料以n（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)（樣本量>40 且最小理論頻數(shù)>5）或Fisher 精確檢驗(yàn)（樣本量≤40 或最小理論頻數(shù)≤5）。采用多元回歸模型校正可能的混雜因子，并計(jì)算校正比值比（adjusted odds ratio，aOR） 和95% 置 信 區(qū) 間（95% confidence interval，95%CI）。多元回歸模型中“參考”是作為比較的參照，設(shè)定的aOR是1。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量胚胎移植組的比較

2.1.1 不同質(zhì)量胚胎移植組患者基礎(chǔ)情況比較 本研究共納入565個(gè)單囊胚凍融移植周期。4組間的女方年齡、基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平、抗米勒管激素（anti-müllerian hormone，AMH）水平、授精方式和胚齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他基線情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。

表1 不同質(zhì)量胚胎移植組患者基線資料比較Tab 1 Baseline characteristics grouped by blastocyst quality

2.1.2 不同質(zhì)量胚胎移植組患者臨床結(jié)局比較 如表2所示，不同質(zhì)量胚胎組間的生化妊娠率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。高質(zhì)量囊胚、臨床妊娠率和活產(chǎn)率最高，分別達(dá)58.7%和46.2%。隨胚胎質(zhì)量下降，臨床妊娠率和活產(chǎn)率隨之下降。中質(zhì)量囊胚的臨床妊娠率和活產(chǎn)率分別為54.4%和43.3%，低質(zhì)量囊胚的則分別為47.1%和36.2%。CC級(jí)別囊胚可獲得25.4%的臨床妊娠率和17.6%的活產(chǎn)率。4組間早期流產(chǎn)率和異位妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同質(zhì)量囊胚子代的分娩孕周（P=0.481）和出生體質(zhì)量（P=0.669）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 不同質(zhì)量胚胎移植組患者妊娠結(jié)局比較Tab 2 Pregnancy outcomes grouped by blastocyst quality

多元回歸分析顯示（表3），胚胎質(zhì)量與臨床妊娠率顯著相關(guān)。與高質(zhì)量囊胚相比，CC 級(jí)別囊胚的臨床妊娠率較低（aOR=0.81，95%CI 0.71～0.93，P=0.003）。而中低質(zhì)量囊胚和高質(zhì)量囊胚的臨床妊娠率相似（P＞0.05）。除此之外，女方年齡、基礎(chǔ)FSH 水平、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植日內(nèi)膜厚度也顯著影響臨床妊娠率（P<0.05）。

表3 臨床妊娠率多元回歸分析結(jié)果Tab 3 Multivariable analysis of factors associated with clinical pregnancy rate

Continued Tab

2.2 不同胚齡CC級(jí)別胚胎妊娠結(jié)局比較

如表4 所示，D6 和D7 CC 級(jí)別囊胚的患者年齡顯著大于D5 CC 級(jí)別囊胚的患者。D5 CC 級(jí)別囊胚生化妊娠率（46.2% vs 37.0% vs 6.7%，P=0.021）、臨床妊娠率（42.3% vs 23.5% vs 6.7%，P=0.040）和活產(chǎn)率（31.6% vs 15.6% vs 0，P=0.133）均高于D6 和D7 的CC 級(jí)別囊胚。而早期流產(chǎn)率差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.328）。

表4 不同胚齡CC級(jí)別胚胎妊娠結(jié)局比較Tab 4 Pregnancy outcomes grouped by embryonic age

如表5 所示，對(duì)CC 級(jí)別囊胚的臨床妊娠率的影響因素進(jìn)行多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，胚齡對(duì)CC 級(jí)別囊胚移植臨床妊娠率有顯著影響。相較于D5 的CC 級(jí)別囊胚，D7 的CC 級(jí)別囊胚的臨床妊娠率更低（aOR=0.69，95%CI 0.49～0.96，P=0.032）。其他因素對(duì)CC 級(jí)別囊胚的臨床妊娠率無(wú)顯著影響。

表5 CC級(jí)別囊胚臨床妊娠多元回歸分析結(jié)果Tab 5 Multivariable analysis of factors associated with clinical pregnancy rate for CC grade blastocysts

3 討論

目前，涉及CC 級(jí)別囊胚妊娠結(jié)局的研究極少。van den Abbeel 等［16］的研究數(shù)據(jù)表明，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)外胚層評(píng)分為C 的囊胚的活產(chǎn)率均較低?；谄漕A(yù)測(cè)模型估計(jì)3 期CC 級(jí)別囊胚的活產(chǎn)率可達(dá)12%，4～5 期CC 級(jí)別囊胚可達(dá)到27%。我們的研究顯示，CC 級(jí)別囊胚的臨床妊娠率可達(dá)到25.4%，活產(chǎn)率可達(dá)到17.6%。在校正了年齡等混雜因子后，雖然CC 級(jí)囊胚獲得臨床妊娠的可能低于高質(zhì)量囊胚，但二者差距并不大（aOR=0.81，95%CI 0.71～0.93，P=0.003）。目前國(guó)內(nèi)外較多的生殖中心認(rèn)為CC級(jí)別囊胚發(fā)育潛能極低，不適合凍存［11］。我中心的數(shù)據(jù)顯示，相較于其他級(jí)別囊胚組，CC 級(jí)別囊胚組的女方年齡和基礎(chǔ)FSH 水平偏高、AMH 水平偏低（表1），提示該組患者整體而言卵巢儲(chǔ)備較差。在臨床實(shí)踐中，高齡、卵巢儲(chǔ)備差的患者常常經(jīng)過多次取卵，仍難以獲得優(yōu)質(zhì)胚胎。對(duì)于此類患者，建議不要輕易丟棄CC 級(jí)別囊胚，移植CC 級(jí)別的囊胚可增加患者的受孕機(jī)會(huì)。同時(shí)，我們中心的數(shù)據(jù)顯示，相較于其他級(jí)別囊胚組而言，CC 級(jí)別囊胚組的早期流產(chǎn)率偏高，活產(chǎn)率偏低（表2），這一現(xiàn)象或與該組患者高齡、卵巢儲(chǔ)備差有關(guān)。

目前對(duì)于胚胎發(fā)育潛能的評(píng)估主要基于胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分［17］。然而相同評(píng)分的囊胚卻可能由發(fā)育速度不同的胚胎形成。一些研究［18-20］表明，在形態(tài)學(xué)評(píng)分相近的情況下，發(fā)育較快的囊胚相較于發(fā)育遲滯的囊胚有著更好的臨床結(jié)局。Du 等［20］研究發(fā)現(xiàn)D7 囊胚的種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著低于D5 或D6 的囊胚。其可能的原因是發(fā)育遲緩的胚胎中非整倍體率和紡錘體異常率更大，從而降低了其種植能力［21-22］。然而，關(guān)于不同胚齡對(duì)CC 級(jí)別囊胚妊娠結(jié)局的影響國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在凍融移植周期中，D5 CC 級(jí)別囊胚的臨床妊娠率（42.3%）和活產(chǎn)率（31.6%）較高，具有較高的臨床價(jià)值；而D6的CC級(jí)別囊胚臨床妊娠率為23.5%，活產(chǎn)率為15.6%，雖低于D5的CC級(jí)別囊胚，但仍具有一定的移植價(jià)值；不過D7 的CC 級(jí)別囊胚的臨床妊娠率僅為6.7%，遠(yuǎn)低于D5 和D6 的CC 級(jí)別囊胚，且未獲得活產(chǎn)，臨床價(jià)值很小。

我中心CC 級(jí)別囊胚妊娠率較高可能的原因如下：第一，在本研究中，一半以上的患者于促排卵周期采用了PPOS 方案。PPOS 方案由Kuang 等［14］于2015 年首次提出，其創(chuàng)造性地采用外源性孕激素抑制黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰。PPOS 方案能夠獲得與傳統(tǒng)短方案一樣的妊娠結(jié)局且能有效降低卵巢過度刺激的風(fēng)險(xiǎn)［13］。2017 年的一項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)［23］表明，PPOS 可以改善卵巢低儲(chǔ)備的患者的胚胎質(zhì)量。相比于采用自然周期的患者，采用PPOS 方案的患者的獲卵數(shù)和有效胚胎數(shù)量更多［23］。第二，本中心實(shí)驗(yàn)室采用了輔助孵化技術(shù)［24］。在顯微鏡下人工移除透明帶可減少胚胎孵出的阻力，進(jìn)而提高胚胎的種植率［24］。第三，我中心采用經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下胚胎移植策略。因經(jīng)陰道超聲對(duì)于子宮的顯影質(zhì)量?jī)?yōu)于經(jīng)腹部超聲，移植醫(yī)師可以更精準(zhǔn)地選擇宮腔內(nèi)合適的位置進(jìn)行胚胎移植。有文獻(xiàn)［25］報(bào)道，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下移植相較于腹部超聲引導(dǎo)可顯著增加胚胎種植率和臨床妊娠率，并能降低異位妊娠率。

本研究主要的不足在于其回顧性研究設(shè)計(jì)，可能存在潛在的混雜因子未能校正。此外，本研究樣本量較為有限，結(jié)論尚需前瞻性大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究表明，對(duì)于難以獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的患者，移植CC 級(jí)別囊胚仍有臨床意義。其中，D5 的CC級(jí)別囊胚具有很好的妊娠結(jié)局；D6 的CC 級(jí)別囊胚雖然妊娠率較低，但仍具有一定的移植價(jià)值；而D7 的CC 級(jí)別囊胚臨床價(jià)值較小。

參·考·文·獻(xiàn)

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