不同基原大黃藥材的HPLC指紋圖譜及含量差異研究

袁振海，王 芳，梁大連，賈嬋媛，陳彬合

（山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatunL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumoffocinaleBaill.的干燥根和根莖?？?，寒。歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)。具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃的功效。臨床用于實熱積滯便秘，血熱吐衄，目赤咽腫，癰腫疔瘡，腸癰腹痛，瘀血經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀阻，跌打損傷，濕熱痢疾，黃疽尿赤，淋證，水腫；外治燒燙傷等[1]。

大黃是中國傳統(tǒng)四大中藥之一，含蒽衍生物類、鞣質(zhì)類、二苯乙烯類、萘衍生物類等多種有效成分，具有廣泛的藥理作用[2]。僅中國藥典（2020年版）一部中收錄的含大黃的復方制劑即有數(shù)十種，如一清顆粒、一捻金、十一味能消丸、小兒熱速清口服液、止血復脈合劑、烏軍治膽片等。但由于目前市場上中藥飲片質(zhì)量參差不齊、煎煮工藝各異，缺乏行之有效的質(zhì)量評價與監(jiān)督體系。加之大黃為3種基原，不同基原藥材的使用目前未有明確的指導原則，也鮮有關(guān)于不同基原藥材質(zhì)量差異的研究報道。本文希望通過初步的對比分析研究，為此類藥材的研究提供一定的參考，并為提高中藥材質(zhì)量控制水平乃至減小中藥品種臨床差異、提高療效提供一定的依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（Waters e2695泵，Waters 2998 PDA檢測器，Waters四元在線脫氣機，Empower色譜工作站，美國Waters公司）；XA105DU電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

蘆薈大黃素對照品（110795-201609），大黃素對照品（110756-201512），大黃酸對照品（110757-201607），大黃素甲醚對照品（110758-201616），大黃酚對照品（110796-200309），大黃對照藥材（藥用大黃，120984-201202，編號：S1），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（天津賽孚瑞科技有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

本文研究中使用的不同基原及產(chǎn)地的大黃藥材來源見表1。

表1 大黃藥材來源

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch PG-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A相為0.1 %磷酸水溶液，B相為乙腈，梯度洗脫（見表2）；流速1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μl。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取蘆薈大黃素對照品、大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素甲醚對照品及大黃酚對照品適量，加甲醇制成每l ml含蘆薈大黃素20 μg、大黃酸20 μg、大黃素20 μg、大黃酚10 μg、大黃素甲醚10 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過四號篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3 指紋圖譜的考察[3-4]

3.1 精密度試驗

精密稱取編號S2（產(chǎn)地：四川）的大黃樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次，測得各峰的保留時間RSD＜2.94 %，各峰峰面積RSD＜3.87 %，表明該法精密度良好。

3.2 重復性試驗

精密稱取S2（產(chǎn)地：四川）的大黃樣品6份，按2.3項下方法制備供試液，按2.1項下色譜條件測定，選取分離度較好的14個共有峰進行比較，結(jié)果顯示，共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜4 %，表明該法重復性良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗

取3.1項下供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h進樣測定，結(jié)果顯示，14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜4 %，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 各批次大黃藥材的HPLC分析[5-8]

分別按2.1項下條件測定對照品溶液和7個批次大黃藥材的供試品溶液，記錄色譜圖。將S1～S7 7批大黃藥材HPLC圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件，利用中位數(shù)法，以S1批樣品的HPLC 圖為參照圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，建立大黃藥材的HPLC 指紋圖譜共有模式圖，見圖1（P2）。混合對照圖譜見圖1（P1）。

圖1 大黃對照品圖譜（P1）及藥材的指紋圖譜共有模式圖（P2）

采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，進行相似度計算，得到7批大黃藥材的共有指紋圖譜R，結(jié)果見圖2。由圖2可見，指紋圖譜共有14個主要共有峰。

圖2 7批大黃藥材的HPLC指紋圖譜

3.5 大黃指紋圖譜相似度評價

以大黃藥材的共有模式指紋圖譜（R）為標準，進行整體相似度評價，結(jié)果見表3。

表3 不同批次大黃藥材相似度評價結(jié)果

由表3可見，7個批次大黃樣品共同評價時，各批次間的相似度有明顯差異，其中S3、S4、S5 3批藥用大黃相似度＜0.9，S1（藥用大黃）、S2（藥用大黃）、S6（唐古特大黃）、S7（掌葉大黃）4批相似度＞0.95，表明上述產(chǎn)地、批次的大黃藥材整體概貌及主要成分種類差異較大，但3種基原的大黃通過相似度比較未體現(xiàn)出明顯差異。

3.6 藥用大黃藥材的HPLC分析

由圖2可見，唐古特大黃（S6）和掌葉大黃（S7）共有峰明顯多于藥用大黃（S1～S5），尤其在保留時間3～28 min之間最為明顯，因此單獨將5批藥用大黃HPLC圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件，利用中位數(shù)法，以S1批樣品的HPLC 圖譜為參照圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，進行相似度計算，建立藥用大黃藥材的HPLC 指紋圖譜共有模式圖R，結(jié)果見圖3，指紋圖譜共計16個共有峰。

圖3 5批藥用大黃藥材的HPLC指紋圖譜

3.7 藥用大黃指紋圖譜相似度評價

以藥用大黃藥材的共有模式指紋圖譜為標準，進行整體相似度評價，結(jié)果見表4。

表4 5批次藥用大黃藥材相似度評價結(jié)果

由表4可見，5個批次的藥用大黃單獨評價與上述7批藥材（3種基原）共同評價時有明顯差異。其中S3、S4相似度雖仍＜0.9，但相似度由0.6升高至0.8，而S5由0.86升高至0.96，符合相似度要求；可見藥用大黃之間整體概貌及主要成分種類雖存在一定差異，但同基原藥材間相似度評價差異小于多基原。

3.8 3種基原大黃的指紋圖譜

將唐古特大黃、掌葉大黃的HPLC圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件，利用中位數(shù)法，以唐古特大黃樣品的HPLC圖譜為參照圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，進行相似度計算，建立藥材的HPLC 指紋圖譜共有模式圖P3，共有峰基本相同，兩批間相似度達0.999。比較唐古特大黃、掌葉大黃和藥用大黃的HPLC 指紋圖譜共有模式圖（P3），見圖4。

圖4 藥用大黃共有圖譜（P3）與掌葉大黃、唐古特大黃指紋圖譜

由圖4可見，藥用大黃共有峰數(shù)量及各峰面積都明顯少于唐古特大黃和掌葉大黃，但共同進行相似度評價時未能體現(xiàn)出不同基原間的差異，因此又以游離蒽醌和總蒽醌含量為指標，采用該指紋圖譜條件對3種基原的大黃進行進一步的分析研究。

4 不同基原大黃中蒽醌類化合物的研究

4.1 色譜條件

色譜柱：Welch PG-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A相為0.1 %磷酸水溶液，B相為乙腈，梯度洗脫（見表5）；流速1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μl。

表5 梯度洗脫程序

4.2 對照品溶液的配制

精密稱取蘆薈大黃素對照品、大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素甲醚對照品及大黃酚對照品適量，加甲醇制成每l ml含蘆薈大黃素20 μg、大黃酸20 μg、大黃素20 μg、大黃酚10 μg、大黃素甲醚10 μg的混合溶液，即得。

4.2.1 游離蒽醌供試品溶液的制備 取藥材粉末（過四號篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

4.2.2 總蒽醌供試品溶液的制備 取藥材粉末（過四號篩）0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5.0 ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8 %鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min，加熱回流1 h，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

4.3 結(jié)果及分析

根據(jù)中國藥典（2020年版）一部，大黃項下要求游離蒽醌不得少于0.20 %，總蒽醌不得少1.5 %。3種基原大黃藥材中游離蒽醌含量測定結(jié)果見表6，3種基原大黃藥材中總蒽醌的含量測定結(jié)果表7，3種基原大黃藥材的總蒽醌與游離蒽醌HPLC色譜圖見圖5。研究結(jié)果表明3種大黃均符合藥典要求，但三者各成分含量及HPLC色譜峰差異明顯。

由表6可見，在游離蒽醌的含量測定中，已知的5種成分含量在藥用大黃中由高到低依次為大黃酚＞大黃素甲醚、大黃酸＞大黃素＞蘆薈大黃素；在唐古特大黃和掌葉大黃中的含量由高到低依次為大黃素甲醚、大黃素＞大黃酸、大黃酚＞蘆薈大黃素。藥用大黃中大黃酚含量最高，約為唐古特大黃和掌葉大黃的兩倍；而唐古特大黃和掌葉大黃中大黃素和大黃素甲醚含量最高，約為藥用大黃的兩倍。

表6 3種基原大黃藥材中游離蒽醌含量結(jié)果

由表7可見，在酸化后總蒽醌的含量測定中，已知的5種成分含量在藥用大黃中由高到低依次為大黃酚＞大黃素、大黃酸＞大黃素甲醚＞蘆薈大黃素；在唐古特大黃和掌葉大黃中的含量由高到低依次為大黃素＞大黃素甲醚＞大黃酸＞大黃酚＞蘆薈大黃素。5種已知成分的含量及排序與測定游離蒽醌時發(fā)生顯著變化，其中唐古特大黃和掌葉大黃中5種已知成分的含量比酸化前測定升高10多倍，含量排序雖有變化但總體趨勢與酸化處理前接近。

表7 3種基原大黃藥材中總蒽醌的含量結(jié)果

由圖5可見，測定游離蒽醌的色譜圖中，唐古特大黃和掌葉大黃在0～35 min間出峰數(shù)量及峰1～峰17各峰面積明顯高于藥用大黃，且藥用大黃中無峰15。酸化處理后，測定總蒽醌的色譜圖中，可見色譜峰發(fā)生明顯變化，即供試品中成分發(fā)生明顯變化，經(jīng)酸化處理后，未知峰2和已知5種成分的峰面積明顯升高，而其他未知峰的峰面積明顯降低甚至消失，總成分數(shù)量減少，剩余少量成分含量升高，說明大黃供試品的酸化處理改變了藥材中的原物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖5 3種基原大黃藥材的供試品色譜圖

5 討論

5.1 色譜條件的選擇

分別考察了為島津Inertsustain C18、Welch PGC18、Welch XB-C18、Agilent Zorbax C184種色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以及乙腈-0.1 %磷酸水溶液、乙腈-0.05 %磷酸水溶液、甲醇-0.1 %磷酸水溶液等多種流動相體系，并對柱溫、流速及進樣量進行考察，結(jié)果以乙腈-0.1 %磷酸水溶液、流速1.0 ml/min、柱溫35 ℃、進樣量10 μl的色譜條件測定時，基線較穩(wěn)定，出峰較多、分離最好、峰形最佳、保留時間適宜。

5.2 指紋圖譜相似度評價

由本文研究可見，在采用指紋圖譜相似度評價大黃藥材時，不同基原藥材多批次共同評價與同基原藥材多批次評價的結(jié)果會有明顯差異，有時不能完全體現(xiàn)批間差異。因此在涉及多基原藥材時應尤其關(guān)注類似問題，建議在采用相似度評價的基礎(chǔ)上，還應根據(jù)情況增加主要色譜峰單位質(zhì)量峰面積（A/W）的波動范圍，共有峰個數(shù)、非共有峰個數(shù)及峰面積總和、指紋圖譜峰形特征等指標，并運用統(tǒng)計方法進行適當?shù)闹鞒煞址治龊途垲惙治觯瑥亩鴮Σ煌团蔚乃幉倪M行更全面的評價。

5.3 測定方法及成分含量控制

藥典中收錄的大黃流浸膏、浸膏及各成方制劑均以鹽酸或硫酸酸化方法制備供試品，然后以測得的大黃素和大黃酚兩者的總和或以本文中涉及的5種成分（蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚）的總和來作為質(zhì)量控制的指標。根據(jù)本文研究，酸化制備的供試品的測定結(jié)果不能真實反映產(chǎn)品中大黃的各成分含量及各成分比例。特別是對于大黃流浸膏和大黃浸膏，采用不同基原或混合基原提取的浸膏按此方法檢測均可符合質(zhì)量要求，但其中各成分實際含量及比例差異較大，推測甚至可能在一定程度下導致藥效不同。因此，建議今后可對大黃流浸膏及浸膏采用非酸化方式制備供試品，并輔以指紋圖譜進行質(zhì)量控制。而對于含大黃的成方制劑，因為不同品種涉及不同藥材，乃至不同提取工藝等，成分更加復雜，根據(jù)本文初步研究結(jié)果推測，采用酸化制備供試品測定總蒽醌的方法進行質(zhì)控，更難真實反映各品種在生產(chǎn)過程中從藥材到中間體及成品的質(zhì)量傳遞，無法有效監(jiān)控批間質(zhì)量波動。建議應在注重此問題的前提下，結(jié)合不同產(chǎn)品的具體生產(chǎn)情況及藥效成分，盡量采用可真實反映產(chǎn)品中物質(zhì)基礎(chǔ)的測定方法進行質(zhì)控。

5.4 局限及完善措施

由于本試驗中收集的大黃藥材批次較少，尤其是唐古特大黃及掌葉大黃僅各一批，代表性不足，所得數(shù)據(jù)不能全面完善地反映不同基原的大黃藥材情況，但本研究內(nèi)容已可為大黃的研究、使用甚至其他多基原藥材的研究、使用提供一定的基礎(chǔ)和參考。后續(xù)將對更多批次不同基原的大黃藥材進行研究比較，證明并完善該研究結(jié)果，為進一步提高中藥材及中藥品種的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

6 結(jié)論

綜合本文研究結(jié)果可見，不同基原的大黃藥材中成分及含量存在明顯差異，單純采用指紋圖譜相似度評價，無法有效評價其內(nèi)在差異。因此在對多基原藥材評價時建議在采用指紋圖譜相似度評價的基礎(chǔ)上，還需增加主要色譜峰單位質(zhì)量峰面積（A/W）的波動范圍，共有峰個數(shù)、非共有峰個數(shù)及峰面積總和等指標，并運用統(tǒng)計方法進行適當?shù)闹鞒煞址治龊途垲惙治?，來全面評價多基原藥材的批間差異。對于多基原藥材在實際應用時應盡量固定藥材基原，并輔助指紋圖譜進行質(zhì)量控制；同基原混批使用時為保證產(chǎn)品質(zhì)量，也應進行均一化研究，以保證產(chǎn)品批間質(zhì)量波動較小。對于難以固定為一個基原的藥材，建議先分別進行同基原均一化研究之后，再根據(jù)工藝需求確定不同基原間的配用比例。

此外，針對大黃在酸性條件下處理后，成分發(fā)生明顯變化，不同基原間成分差異減小的情況，應注意在提取或質(zhì)量控制中采用不同的制備方法可能得到不同的結(jié)果，考慮結(jié)果是否能真實表達藥材或制劑的內(nèi)在質(zhì)量。