siRNA-YAP1對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

鄭柳 胡超 楊彬彬 楊興剛 丁芝祥

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科 541001 胡超現(xiàn)在蕪湖市眼科醫(yī)院 241000

后發(fā)性白內(nèi)障即晶狀體后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)，是白內(nèi)障術(shù)后的主要并發(fā)癥之一。白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)發(fā)生增生、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及細(xì)胞外基質(zhì)的合成等一系列病理變化，引起正常光滑的后囊膜皺縮形成PCO，導(dǎo)致視力下降[1]。EMT是上皮樣細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變的異常分化過(guò)程，是PCO發(fā)生的關(guān)鍵[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)是誘發(fā)纖維化形成的生長(zhǎng)因子。TGF-β2通過(guò)激活經(jīng)典Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路、PI3K/Akt通路和其他通路調(diào)節(jié)LECs的移行、增生和EMT過(guò)程，影響PCO的發(fā)生[3-5]，10 ng/ml TGF-β2誘導(dǎo)HLEB-3細(xì)胞發(fā)生EMT是研究PCO的適當(dāng)模型[1,6-7]。Hippo信號(hào)通路在機(jī)體發(fā)育和疾病中發(fā)揮重要作用，參與胚胎眼形成的多個(gè)階段，其調(diào)節(jié)紊亂可能導(dǎo)致病理組織過(guò)度生長(zhǎng)和腫瘤的進(jìn)展[8-9]。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過(guò)激活靶轉(zhuǎn)錄因子(如TEAD家族)，促進(jìn)細(xì)胞增生，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)基因表達(dá)、致癌轉(zhuǎn)化和EMT，從而在調(diào)控器官大小和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[10]。通過(guò)條件性敲除發(fā)育小鼠YAP基因的研究證明，Hippo/YAP信號(hào)通路參與維持LECs和晶狀體纖維的形態(tài)[11]。目前RNA干擾技術(shù)在PCO防治中已被廣泛應(yīng)用[12]，采取YAP基因沉默的方法是否可以阻斷人LECs的EMT過(guò)程尚未完全闡明。本研究探討小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)-YAP1對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)人LECs EMT的抑制作用，為PCO的預(yù)防提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 永生化人LECs(HLEB-3細(xì)胞)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑及儀器 南美胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國(guó)Gemini公司)；DMEM低糖細(xì)胞培養(yǎng)液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；TGF-β2(美國(guó)Prospec公司)；siRNA(上海吉瑪公司)；Trizol試劑、lipofectamine 3000(美國(guó)Invitrogen公司)；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Power SYBR Green I Master Mix)(美國(guó)ABI公司)；引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(AB40772)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)抗體(AB92547)、兔抗人YAP1抗體(AB205270)(美國(guó)Abcam公司)；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、小鼠抗人β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；PCR儀(美國(guó)Life公司)；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；電泳儀、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(美國(guó)AMG公司)；熒光顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1HLEB-3細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)15% FBS和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素混合液的opti-DMEM低糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞達(dá)到約80%融合時(shí)棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化約2 min，光學(xué)顯微鏡下觀察。待細(xì)胞變圓、漂浮后，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，均勻吹打細(xì)胞，使細(xì)胞全部單個(gè)脫落。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，離心半徑15 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，向離心管中加入完全培養(yǎng)液4 ml，吹打、重懸細(xì)胞，進(jìn)行1∶ 3傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2TGF-β2誘導(dǎo)HLEB-3細(xì)胞EMT模型的建立 將培養(yǎng)的細(xì)胞分為正常對(duì)照組和TGF-β2誘導(dǎo)組，正常對(duì)照組細(xì)胞采用無(wú)血清opti-DMEM低糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，TGF-β2誘導(dǎo)組細(xì)胞在含終質(zhì)量濃度為10 ng/ml TGF-β2的opti-DMEM低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化，建立TGF-β2誘導(dǎo)HLEB-3細(xì)胞EMT模型。采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白E-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化；分別采用Western blot法、細(xì)胞免疫熒光法以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中YAP1蛋白及其mRNA表達(dá)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后TGF-β2誘導(dǎo) 將HLEB-3細(xì)胞分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA1-YAP1組、siRNA2-YAP1組和siRNA3-YAP1組，轉(zhuǎn)染前24 h將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于6孔板并用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度約為1×105個(gè)/孔，待細(xì)胞融合至約80%，參照l(shuí)ipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)分別在培養(yǎng)基中加入Opti-DMEM培養(yǎng)基、siRNA空質(zhì)粒、siRNA1-YAP1、siRNA2-YAP1和siRNA3-YAP1進(jìn)行轉(zhuǎn)染。siRNA1-YAP1序列：正向引物為5’-GACGACCAAUAGCUCAG AUTT-3’，反向引物為5’-AUCUGAGCUAUUGGUCG UCTT-3’；siRNA2-YAP1序列：正向引物為5’-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3’，反向引物為5’-UUUGGUUGAUAGUAUCACCTT-3’；siRNA3-YAP1序列：正向引物為5’-CUGCCACCAAGCUAGAUAATT-3’，反向引物為5’-UUAUCUAGCUUGGUGGCAGTT-3’；siRNA-陰性轉(zhuǎn)染組(negative control，NC)序列：正向引物為5’-GCGACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3’，反向引物為5’-AUCUUAGGCAGAUCGUCGCdTdT-3’。轉(zhuǎn)染后6 h，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。綠色熒光代表羧基熒光素(carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)熒光標(biāo)記的siRNA，細(xì)胞顯示熒光代表轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染成功后，用含終質(zhì)量濃度為10 ng/ml TGF-β2的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Western blot法檢測(cè)HLEB-3細(xì)胞中YAP1蛋白的表達(dá)水平，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。選取轉(zhuǎn)染效果最佳的siRNA-YAP1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將培養(yǎng)的HLEB-3細(xì)胞分為siRNA空載體組、siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組、siRNA空載體+TGF-β2組和siRNA-YAP1+TGF-β2組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、細(xì)胞免疫熒光染色和Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中YAP1 mRNA及其蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，并采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白E-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定HLEB-3細(xì)胞中YAP1 mRNA表達(dá) 采用Trizol RNA提取試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA，用Fast Quant RT試劑盒將總RNA 1 μg逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。按照SYBR Green I Master試劑盒配置熒光反應(yīng)體系，加入八聯(lián)管中進(jìn)行反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃反應(yīng)60 s，共40個(gè)循環(huán)。YAP1序列：正向引物為5’-CCTGCGTAGCCAGTTACCAACAC-3’，反向引物為5’-GCTGCTCATGCTTAGTCCACTGTC-3’；β-actin序列：正向引物為5’-CCTGGCACCCAG CACAAT-3’；反向引物為5’-GGGCCGGACTCGTCA TAC-3’。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5Western blot法檢測(cè)HLEB-3細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、Vimentin和YAP1蛋白表達(dá) 采用適量RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑(體積比為100∶ 1)混合液于冰上充分裂解細(xì)胞30 min。離心半徑10 cm，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，加入1/3體積4倍蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min,蛋白變性后分裝于EP管中，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。將等量的蛋白樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉在TBST中封閉膜，滴加相應(yīng)一抗(均1∶ 1 000)，4 ℃過(guò)夜，次日取出條帶，用TBST沖洗后，用相應(yīng)二抗(均1∶ 1 000)孵育膜，凝膠成像系統(tǒng)照相。以β-actin為內(nèi)參。采用Image J軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，各蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin灰度值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6免疫熒光染色法檢測(cè)HLEB-3細(xì)胞內(nèi)YAP1蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板上并用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，用預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定各組處理細(xì)胞10 min。PBS洗3次，用體積分?jǐn)?shù)0.5% TritonX-100處理20 min；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的牛血清白蛋白在室溫下封閉30 min，棄封閉液，加入YAP1抗體(1∶ 200)稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，與FITC標(biāo)記山羊抗兔(1∶ 800)室溫下孵育1 h。用含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)的封閉液封片，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞中YAP1蛋白熒光狀態(tài)。藍(lán)色熒光顯示DAPI核染，綠色熒光標(biāo)記YAP1蛋白。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)符合正態(tài)分布，以mean±SD表示，組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊。TGF-β2誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)評(píng)估采用均衡分組單因素干預(yù)兩水平研究設(shè)計(jì)，TGF-β2誘導(dǎo)組與正常對(duì)照組間各檢測(cè)指標(biāo)的差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)評(píng)估采用均衡分組單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計(jì)，組間各檢測(cè)指標(biāo)總體差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β2誘導(dǎo)后HLEB-3細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)變化

正常對(duì)照組培養(yǎng)的HLEB-3細(xì)胞呈多邊形，TGF-β2誘導(dǎo)組細(xì)胞由多邊形變成長(zhǎng)紡錘形(圖1)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β2誘導(dǎo)組細(xì)胞中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.830±0.104，低于正常對(duì)照組的1.180±0.118，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.857，P=0.018)；TGF-β2誘導(dǎo)組細(xì)胞中Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.240±0.110，高于正常對(duì)照組的0.797±0.110，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.933，P=0.008)(圖2)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察2個(gè)組HLEB-3細(xì)胞培養(yǎng)后24 h形態(tài)變化(×100，標(biāo)尺=100 μm) A：正常對(duì)照組細(xì)胞呈多邊形 B：TGF-β2誘導(dǎo)組細(xì)胞呈長(zhǎng)紡錘形 圖2 2個(gè)組細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)比較 A：2個(gè)組細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)電泳圖 B：2個(gè)組細(xì)胞中E-cadherin相對(duì)表達(dá)量比較 C:2個(gè)組細(xì)胞中Vimentin相對(duì)表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；Vimentin：波形蛋白；E-cadherin：E-鈣黏蛋白；β-actin:β-肌動(dòng)蛋白Figure 1 Morphology of HLEB-3 cells cultured for 24 hours in the two groups under light microscope (×100,bar=100 μm) A:The cells in the normal control group were polygonal B:The cells in the TGF-β2 induced group were spindle-shaped Figure 2 Comparison of E-cadherin and Vimentin protein expression between the two groups A:E-cadherin and Vimentin protein expression electrophoretogram of the two groups B:Comparison of the relative expression of E-cadherin between the two groups C:Comparison of the relative expression of Vimention between the two groups Compared with the normal control group,aP<0.05(Independent-samples t test,n=3) TGF:transforming growth factor

2.2 TGF-β2誘導(dǎo)后HLEB-3細(xì)胞中YAP1表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，TGF-β2誘導(dǎo)組細(xì)胞中YAP1蛋白熒光明顯增強(qiáng)，YAP1蛋白電泳表達(dá)條帶增強(qiáng)。TGF-β2誘導(dǎo)組細(xì)胞中YAP1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為2.200±0.193和1.203±0.121，顯著高于正常對(duì)照組的1.136±0.123和0.967±0.025，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.288，P<0.01；t=-3.329，P=0.029)(圖3)。

2.3 不同轉(zhuǎn)染組HLEB-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率和YAP1蛋白表達(dá)

倒置熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn),FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%以上，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA1-YAP1組、siRNA2-YAP1組和siRNA3-YAP1組細(xì)胞中YAP1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.317±0.225、1.182±0.132、0.264±0.079、0.163±0.067和0.188±0.091，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.308，P<0.01)；與正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，siRNA1-YAP1組、siRNA2-YAP1組和siRNA3-YAP1組細(xì)胞中YAP1相對(duì)表達(dá)量均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(圖4)。siRNA1-YAP1、siRNA2-YAP1和siRNA3-YAP1均能有效抑制YAP1表達(dá)，siRNA2-YAP1組YAP1蛋白相對(duì)表達(dá)量最少，選取siRNA2-YAP1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 不同轉(zhuǎn)染組TGF-β2誘導(dǎo)后HLEB-3細(xì)胞中YAP1蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

與siRNA空載體組比較，siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中YAP1熒光強(qiáng)度明顯減弱，siRNA空載體+TGF-β2組中YAP1熒光明顯增強(qiáng)；與siRNA空載體+TGF-β2組相比，siRNA-YAP1+TGF-β2組細(xì)胞中YAP1熒光明顯減弱。siRNA空載體組、siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組、siRNA空載體+TGF-β2組和siRNA-YAP1+TGF-β2組YAP1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.327±0.021、0.303±0.057、1.453±0.021和0.320±0.104，YAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.156±0.175、0.576±0.108、2.048±0.329和0.572±0.022，總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=340.851，P<0.01；F=51.432，P<0.01)，其中siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組YAP1蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于siRNA空載體組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，siRNA-YAP1+TGF-β2組細(xì)胞中YAP1蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于siRNA+TGF-β2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；siRNA空載體+TGF-β2組細(xì)胞中YAP1蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于siRNA空載體組，差異均有統(tǒng)計(jì)意義(均P<0.05)(圖5)。

圖3 2個(gè)組培養(yǎng)后24 h HLEB-3細(xì)胞中YAP1蛋白表達(dá)比較 A：細(xì)胞免疫熒光染色可見(jiàn)正常對(duì)照組中YAP1蛋白少量表達(dá)，呈綠色熒光(FITC)，DAPI核染呈藍(lán)色熒光(×200，標(biāo)尺=50 μm) B：細(xì)胞免疫熒光染色可見(jiàn)TGF-β2誘導(dǎo)組YAP1蛋白表達(dá)明顯增多，熒光明顯增強(qiáng)(×200,標(biāo)尺=50 μm) C：2個(gè)組細(xì)胞中YAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) D：2個(gè)組細(xì)胞中YAP1蛋白表達(dá)電泳圖 E：2個(gè)組細(xì)胞中YAP1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) YAP：Yes相關(guān)蛋白；TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；β-actin:β-肌動(dòng)蛋白 圖4 不同轉(zhuǎn)染組HLEB-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率和YAP1蛋白表達(dá)比較 A：倒置熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常(標(biāo)尺=20 μm) B：倒置熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)陰性對(duì)照組80%細(xì)胞具有綠色熒光(標(biāo)尺=20 μm) 綠色熒光代表FAM熒光標(biāo)記的siRNA，細(xì)胞顯示熒光代表轉(zhuǎn)染成功 C：不同轉(zhuǎn)染組HLEB-3細(xì)胞中YAP1蛋白表達(dá)電泳圖 D：不同轉(zhuǎn)染組HLEB-3細(xì)胞中YAP1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) 1：正常對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：siRNA1-YAP1組；4：siRNA2-YAP1組；5：siRNA3-YAP1組 YAP：Yes相關(guān)蛋白；β-actin:β-肌動(dòng)蛋白Figure 3 Comparison of YAP1 protein expression in HLEB-3 cells cultured for 24 hours between the two groups A:In the control group,the immunofluorescence staining showed a small amount of YAP1 protein (green fluorescence，F(xiàn)ITC),and DAPI staining showed nucleus (blue fluorescence) (×200,bar=50 μm) B:In the TGF-β2 induced group,the immunofluorescence staining presented enhanced fluorescence,suggesting that the expression of YAP1 proteins was increased significantly ( ×200,bar=50 μm) C:Comparison of YAP1 mRNA relative expression between the two groups Compared with the normal control group,aP<0.05 (Independent-samples t test,n=3) D:YAP1 protein expression electrophoregram of the two groups E:Comparison of YAP1 protein expression between the two groups Compared with the normal control group,aP<0.05 (Independent-samples t test,n=3) YAP:Yes-associated protein;TGF:transforming growth factor Figure 4 Comparison of transfection efficiency and YAP1 protein expression in HLEB-3 cells among various groups A:Normal cell morphology in the negative control group was observed under an inverted fluorescence microscope (bar=20 μm) B:The 80% of cells in the negative control group showed green fluorescence under the inverted fluorescence microscope (bar=20 μm).Green fluorescence represented FAM fluorescently labeled siRNA,and cells showing fluorescence indicated successful transfection C:YAP1 protein expression electrophoretogram of HLEB-3 cells among various groups D:Relative expression of YAP1 proteins in HLEB-3 cells among various groups Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the negative control group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:normal control group;2:negative control group;3:siRNA1-YAP1 group;4:siRNA2-YAP1 group;5:siRNA3-YAP1 group YAP:Yes-associated protein

2.5 不同轉(zhuǎn)染組TGF-β2誘導(dǎo)后HLEB-3細(xì)胞中EMT指標(biāo)蛋白表達(dá)比較

各轉(zhuǎn)染組E-cadherin和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.225，P<0.01；F=52.541，P<0.01)，其中與siRNA空載體組相比，siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的E-cadherin蛋白熒光增強(qiáng)，相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2個(gè)組Vimentin蛋白熒光未見(jiàn)明顯差異，相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與siRNA空載體組相比，siRNA空載體+TGF-β2組細(xì)胞中的E-cadherin蛋白熒光減弱，相對(duì)表達(dá)量明顯降低，Vimentin蛋白熒光增強(qiáng)，相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組相比，siRNA-YAP1+TGF-β2組中E-cadherin蛋白熒光減弱，相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Vimentin蛋白熒光及相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與siRNA空載體+TGF-β2組相比，siRNA-YAP1+TGF-β2組中E-cadherin蛋白熒光增強(qiáng)，相對(duì)表達(dá)量升高，Vimentin蛋白熒光減弱，相對(duì)表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)意義(均P<0.05)(圖6，表1)。

圖5 不同轉(zhuǎn)染組TGF-β2誘導(dǎo)后HLEB-3細(xì)胞中YAP1表達(dá)比較 A：細(xì)胞免疫熒光染色觀察各轉(zhuǎn)染組HLEB-3細(xì)胞中YAP1表達(dá) A1：siRNA空載體組 A2：siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組 A3：siRNA空載體+TGF-β2組 A4：siRNA-YAP1+TGF-β2組 B：各轉(zhuǎn)染組HLEB-3細(xì)胞中YAP1表達(dá)電泳圖 C：各轉(zhuǎn)染組HLEB-3細(xì)胞中YAP1蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與siRNA空載體組比較，aP<0.05；與siRNA+TGF-β2組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) C1：YAP1蛋白 C2：YAP1 mRNA 1：siRNA空載體組；2：siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組；3：siRNA空載體+TGF-β2組；4：siRNA-YAP1+TGF-β2組 YAP：Yes相關(guān)蛋白；β-actin:β-肌動(dòng)蛋白Figure 5 Comparison of YAP1 protein expression in HLEB-3 cells among different transfection groups after TGF-β2 induction A:YAP1 expression in HLEB-3 cells of each transfection group by immunofluorescence A1:siRNA empty vector group A2:siRNA-YAP1 transfection group A3:siRNA empty vector+TGF-β2 group A4:siRNA-YAP1+TGF-β2 group B:Electrophoretogram of YAP1 expression in HLEB-3 cells of each transfection group C:Comparison of YAP1 proteins and mRNA in HLEB-3 cells among different transfection groups Compared with the siRNA group,aP<0.05;compared with siRNA+TGF-β2 group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) C1：YAP1 proteins C2:YAP1 mRNA 1:siRNA empty vector group;2:siRNA-YAP1 transfection group;3:siRNA empty vector+TGF-β2 group;4:siRNA-YAP1+TGF-β2 group YAP:Yes-associated protein

圖6 不同轉(zhuǎn)染組TGF-β2誘導(dǎo)后HLEB-3細(xì)胞中EMT指標(biāo)蛋白表達(dá)比較 A：細(xì)胞免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)變化(FITC ×200，標(biāo)尺=50 μm) siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組較siRNA空載體組E-cadherin蛋白熒光增強(qiáng)；siRNA空載體+TGF-β2組較siRNA空載體組E-cadherin蛋白熒光減弱，Vimentin蛋白熒光增強(qiáng)；siRNA-YAP1+TGF-β2組較siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組E-cadherin蛋白熒光減弱；siRNA-YAP1+TGF-β2組較siRNA空載體+TGF-β2組中E-cadherin蛋白熒光增強(qiáng)，Vimentin蛋白熒光減弱。藍(lán)色熒光DAPI核染，綠色熒光標(biāo)記YAP1蛋白 B：各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)電泳圖 1：siRNA空載體組；2：siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組；3：siRNA空載體+TGF-β2組；4：siRNA-YAP1+TGF-β2組 siRNA:小干擾RNA；YAP：Yes相關(guān)蛋白；TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；Vimentin：波形蛋白；E-cadherin：E-鈣黏蛋白；β-actin:β-肌動(dòng)蛋白Figure 6 Comparison of EMT marker proteins expression in HLEB-3 cells among various transfection groups after TGF-β2 induction A:E-cadherin and vimentin proteins expression in HLEB-3 cells of each transfection group by immunofluorescence (FITC ×200,bar=50 μm) Compared with siRNA empty vector group,the fluorescence of E-cadherin protein in siRNA-YAP1 transfection group was increased;compared with siRNA empty vector group,the fluorescence of E-cadherin protein in siRNA empty vector+TGF-β2 group was decreased,and the fluorescence of Vimentin protein was enhanced;compared with siRNA-YAP1 transfection group,the fluorescence of E-cadherin protein in siRNA-YAP1+TGF-β2 group was reduced;compared with siRNA empty vector+TGF-β2 group,the fluorescence of E-cadherin protein in siRNA-YAP1 transfection+TGF-β2 group was stronger,and the fluorescence of Vimentin protein was weaker DAPI staining showed nucleus (blue fluorescence);immunofluorescence staining showed florescently labeled YAP protein (green fluorescence) B:Electrophoretogram of E-cadherin,Vimentin protein expression of each group 1:siRNA empty vector group;2:siRNA-YAP1 transfection group;3:siRNA empty vector+TGF-β2 group;4:siRNA-YAP1+TGF-β2 group siRNA：small interfering RNA；YAP:Yes-associated protein;TGF:transforming growth factor

表1 各組細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 1 Comparison of relative expression levels of EMT-related marker proteins among various groups (mean±SD)組別樣本量E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量siRNA空載體組30.817±0.0370.788±0.018siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組30.987±0.041a0.745±0.017siRNA空載體+TGF-β2組30.560±0.029ab1.005±0.032absiRNA-YAP1+TGF-β2組30.744±0.092bc0.791±0.021cF值20.22552.541P值<0.01<0.01 注:與各自siRNA空載體組比較,aP<0.05;與各自siRNA-YAP1轉(zhuǎn)染組比較,bP<0.01;與各自siRNA空載體+TGF-β2比較,cP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) EMT:上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;siRNA:小干擾RNA;YAP:Yes相關(guān)蛋白;TGF:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子;E-cadherin:E-鈣黏蛋白;Vimentin:波形蛋白 Note:Compared with the respective siRNA empty vector groups,aP<0.05;compared with the respective siRNA-YAP1 transfection groups,bP<0.01;compared with the respective siRNA empty vector+TGF-β2 group,cP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) EMT:epi-thelial-mesenchymal transition;siRNA:small interfering RNA;YAP:Yes-associated protein;TGF:transforming growth factor

3 討論

EMT是指上皮細(xì)胞通過(guò)某些特定的程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，發(fā)生EMT時(shí)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Vimentin、N-cadherin的表達(dá)上調(diào)，而上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)則下調(diào)或缺失[13]。LECs的EMT是指LECs從上皮樣細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變的分化過(guò)程，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為多邊形的LECs伸展延長(zhǎng)為梭形，呈成纖維細(xì)胞樣改變；組織學(xué)上表現(xiàn)為Vimentin、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)增加，同時(shí)伴有纖維連接蛋白、層黏連蛋白等其他肌成纖維細(xì)胞固有成分的表達(dá)，以及LECs的表達(dá)成分，如α晶狀體蛋白、E-cadherin等的表達(dá)量降低或丟失[1]。LECs發(fā)生EMT等一系列病理過(guò)程后具有較強(qiáng)的收縮性，常引起晶狀體囊膜皺縮而失去透明性，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙，是PCO發(fā)生和發(fā)展的主要病理機(jī)制[14]。本研究中結(jié)果顯示，HLEB-3細(xì)胞經(jīng)TGF-β2誘導(dǎo)后E-cadherin蛋白表達(dá)減少，Vimentin蛋白表達(dá)增加，證明HLEB-3細(xì)胞的EMT模型誘導(dǎo)成功。

Hippo信號(hào)通路最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，其能夠調(diào)控細(xì)胞增生、凋亡、分化等活動(dòng)，從而控制器官大小和組織發(fā)育穩(wěn)態(tài)[15]。YAP和具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共激活因子是Hippo通路的2個(gè)主要下游效應(yīng)因子[16]。YAP是一種原癌基因，激活后其表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增生[17]。有研究發(fā)現(xiàn)YAP參與肝癌細(xì)胞及房室內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程[18-19]。Song等[11]條件性敲除小鼠YAP基因發(fā)現(xiàn)晶狀體嚴(yán)重發(fā)育遲緩和畸形，主要特征是晶狀體整體明顯縮小，LECs丟失，纖維細(xì)胞排列紊亂，形成空泡，說(shuō)明YAP蛋白參與晶狀體的正常發(fā)育和維持，與白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間黏附減少的LECs內(nèi)核YAP表達(dá)增加，推測(cè)在PCO形成過(guò)程中YAP活性增加[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2誘導(dǎo)HLEB-3細(xì)胞發(fā)生EMT后細(xì)胞內(nèi)YAP1表達(dá)增加，說(shuō)明YAP1可能參與LECs發(fā)生EMT的過(guò)程，可能是PCO進(jìn)展的標(biāo)志。無(wú)論是正常的HLEB-3細(xì)胞或是經(jīng)TGF-β2誘導(dǎo)EMT的HLEB-3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染特異性siRNA-YAP1可以下調(diào)細(xì)胞內(nèi)YAP1的表達(dá)，不影響正常培養(yǎng)細(xì)胞的Vimentin表達(dá)，但正常培養(yǎng)細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)上調(diào)，可增加細(xì)胞的黏附性，降低其發(fā)生EMT的概率；在TGF-β2組細(xì)胞內(nèi)下調(diào)YAP1則E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，Vimentin表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明siRNA-YAP1可明顯抑制由TGF-β2誘導(dǎo)的HLEB-3細(xì)胞發(fā)生EMT。以上結(jié)果表明Hippo/YAP1與LECs表型轉(zhuǎn)換及纖維化之間存在一定的關(guān)系，YAP1表達(dá)下調(diào)可抑制由TGF-β2誘導(dǎo)的HLEB-3細(xì)胞EMT過(guò)程，從而為預(yù)防PCO的發(fā)展提供新的思路。

YAP1是一種基本原癌基因，與腫瘤細(xì)胞EMT的相關(guān)研究已有較多報(bào)道，在肝細(xì)胞癌中可觀察到Y(jié)AP1反復(fù)擴(kuò)增[20]。此外，YAP1還有乳腺上皮細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移潛能[17,21]。YAP1進(jìn)入細(xì)胞核后激活靶轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)基因表達(dá)、致癌轉(zhuǎn)化和EMT[10]。本研究結(jié)果顯示，Hippo/YAP1參與LECs發(fā)生EMT的過(guò)程調(diào)控，siRNA-YAP1可抑制由TGF-β2誘導(dǎo)的HLEB-3細(xì)胞的EMT，由于EMT是PCO發(fā)生的關(guān)鍵過(guò)程，進(jìn)而推測(cè)siRNA-YAP1可能延緩或阻止PCO的發(fā)生。未來(lái)的研究將進(jìn)一步探索Hippo/YAP1通路的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為預(yù)防PCO提供新的治療靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明鄭柳、胡超：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫(xiě)；楊彬彬、楊興剛：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析；丁芝祥：論文修改、經(jīng)費(fèi)支持