茶粉均質(zhì)性的紅外光譜相似度評(píng)價(jià)研究

伍賢學(xué)，李 明，李亮星，鄧秀娟，馬憲英，李亞莉，周紅杰*

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院,云南 昆明 650201 2.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100 3.昆明易武鴻慶茶業(yè)有限責(zé)任公司,云南 昆明 650000

引 言

紅外光譜法是一種經(jīng)典的有機(jī)結(jié)構(gòu)分析手段，近年來(lái)越來(lái)越廣泛的用于生物醫(yī)藥、石油化工、農(nóng)業(yè)食品等諸多混合物分析領(lǐng)域，具有直接、簡(jiǎn)單、快速、低碳等優(yōu)點(diǎn)[1]。研究表明，指紋性和可解析性是混合物紅外光譜的兩個(gè)基本屬性。近十多年來(lái)，孫素琴等在中藥、食品等復(fù)雜體系的紅外光譜分析領(lǐng)域進(jìn)行了系統(tǒng)研究并取得一系列成果，奠定了混合物紅外光譜分析的理論基礎(chǔ)[2-3]。

準(zhǔn)確的信號(hào)是定性和定量分析的基礎(chǔ)，是實(shí)現(xiàn)分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提[4]。非均質(zhì)樣品的均質(zhì)化處理不足可能嚴(yán)重影響分析結(jié)果的可靠性，特別是對(duì)于單次取樣量低至毫克甚至微克的固態(tài)樣品紅外光譜分析更是如此。茶葉和其他很多復(fù)雜固體樣品一樣，屬于典型的非均質(zhì)樣品。粉碎是茶葉分析的常規(guī)前處理環(huán)節(jié)，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 8303)也對(duì)茶樣預(yù)處理過(guò)程中的粉碎環(huán)節(jié)進(jìn)行了相應(yīng)規(guī)定。但不論是茶葉水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、總生物堿等常規(guī)理化分析，還是茶葉中兒茶素、茶氨酸、咖啡因或香氣成分分析，單次分析的取樣量(或預(yù)處理取樣量)通常都在1 000 mg以上，而茶粉的紅外光譜(KBr)測(cè)試單次取樣量約1 mg甚至更低。因此，直接利用常規(guī)成分測(cè)定所需的茶樣粉末進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，所得光譜可能無(wú)法準(zhǔn)確反映茶樣的整體信息，以此為基礎(chǔ)的紅外光譜分析可能存在較大的誤判風(fēng)險(xiǎn)。非均質(zhì)樣品的紅外光譜分析中的這一問題尚未引起足夠重視，從諸多文獻(xiàn)的紅外光譜圖上可以看出較為普遍的存在樣品量過(guò)載、基線傾斜、信噪比偏低等不太注重紅外光譜質(zhì)量的現(xiàn)象[5-8]。迄今為止亦鮮見紅外光譜分析對(duì)樣品均質(zhì)化程度要求的有關(guān)報(bào)道。本課題組近年來(lái)一直從事茶葉等復(fù)雜樣品紅外光譜相關(guān)研究[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，弄清高質(zhì)量紅外光譜對(duì)茶粉均質(zhì)化程度的要求對(duì)于茶葉的紅外光譜深入研究十分必要。得益于光譜軟件技術(shù)及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的發(fā)展成果，利用紅外光譜相關(guān)系數(shù)(r)可以方便地對(duì)光譜相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)[1]。

云南是世界茶樹原產(chǎn)地中心地帶。具有獨(dú)特的云南大葉種茶樹資源優(yōu)勢(shì)，擁有普洱生茶、普洱熟茶、滇紅茶等特色鮮明的茶葉品種。三類茶葉產(chǎn)品均由云南大葉種茶樹幼嫩芽葉經(jīng)不同工藝加工而成，三類茶可以分別歸為不發(fā)酵茶、后發(fā)酵茶和全發(fā)酵茶，茶葉化學(xué)組成存在顯著差異。

為此，以三類滇產(chǎn)茶為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)紅外光譜相似度評(píng)價(jià)茶葉粉碎粒徑對(duì)紅外光譜質(zhì)量的影響，優(yōu)化茶葉均質(zhì)化粉碎條件，以便于盡可能少的光譜采集次數(shù)獲取可靠的紅外光譜分析信號(hào)，為基于茶葉紅外光譜分析的相關(guān)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。預(yù)期研究成果可為茶葉的紅外光譜研究過(guò)程中的樣品均質(zhì)化前處理實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)指導(dǎo)，也可為其他非均質(zhì)固態(tài)樣品的紅外光譜分析提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品處理

選取普洱生茶(Raw-PE)、普洱熟茶(Riped-PE)、滇紅茶(YNBT)三類茶樣作為研究對(duì)象，所有茶樣均由昆明易武鴻慶號(hào)茶葉有限公司提供。

各取茶樣100 g，除塵后盛于烘樣鋁盒中于60 ℃的烘箱中干燥4 hrs。取出冷至室溫后，勻堆取出10 g用多功能粉碎機(jī)(國(guó)產(chǎn))粉碎2 min，茶粉依次過(guò)60，120和250目不銹鋼分樣組篩，制得A(60目以下)、B(60～120目)、C(120～250目)及D(250目以上)四種不同粒徑范圍的茶粉，分裝收集編號(hào)后于干燥器中保存?zhèn)浼t外光譜測(cè)試用。

1.2 儀器參數(shù)及方法

PE Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀(Perkins-Elmer)；通用金剛石單點(diǎn)衰減全反射紅外光譜附件(UATR)；氘代硫酸三甘氨酸酯(DTGS)檢測(cè)器；KBr法光譜掃描范圍：4 000～400 cm-1；ATR法光譜掃描范圍：4 000～650 cm-1；光譜分辨率為4 cm-1，累計(jì)掃描16次，掃描時(shí)自動(dòng)扣除H2O和CO2的干擾；每個(gè)茶樣平行測(cè)試五次；原始紅光譜依次執(zhí)行T-A轉(zhuǎn)換、基線校正、歸一化等標(biāo)準(zhǔn)化處理后用于光譜相似度評(píng)價(jià)。光譜采集及處理利用PE公司紅外光譜專業(yè)軟件(Spectrum 10.4)完成；光譜相似度評(píng)價(jià)采用PE紅外光譜軟件自帶Compare軟件完成，優(yōu)選光譜評(píng)價(jià)范圍為1 800～700 cm-1。

透射法(KBr)紅外光譜測(cè)定：取茶樣粉末約1 mg與約100 mg溴化鉀碎晶(光譜純，自貢三川公司)混合研磨均勻后放入壓片模具，8噸壓力下保持2 min，隨后將樣品片用樣品夾固定后放入樣品倉(cāng)進(jìn)行測(cè)試。

ATR法紅外光譜測(cè)定方法：取少許茶粉置于金剛石UATR平臺(tái)，壓力桿保持在同一壓力條件下測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 全體茶樣間的紅外光譜相似度評(píng)價(jià)

為從總體上了解不同茶類、粒徑茶樣之間的相關(guān)性，以普洱生茶250目以上粒徑樣品的第五次平行KBr光譜為參比，對(duì)3類茶樣、4種粒徑各5個(gè)平行樣共60個(gè)KBr譜的1 800～700 cm-1波數(shù)段進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，相關(guān)系數(shù)(r)均以?shī)A角余弦值計(jì)算，即

其中，每個(gè)紅外光譜(光譜矩陣x的一行)被視為由n個(gè)可變坐標(biāo)產(chǎn)生的n維空間中的向量，兩個(gè)光譜之間的相似性由兩個(gè)向量之間夾角的余弦定義；wk為扣除水蒸氣和二氧化碳的吸收干擾的噪聲權(quán)重因子。評(píng)價(jià)結(jié)果見表1。

首先，從表1可見，以Raw-PE<250-5的KBr譜為參比，普洱生茶的相關(guān)系數(shù)范圍為1.000 0～0.993 2，滇紅茶與普洱熟茶相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)范圍分別為0.930 0～0.756 3和0.644 7～0.562 9，3類茶的相關(guān)系數(shù)范圍存在顯著差異，容易通過(guò)相似度評(píng)價(jià)進(jìn)行區(qū)分，20條滇紅茶光譜中與參比光譜相關(guān)性最好的為YNDH 250-2(r=0.930 0)，普洱熟茶的為Riped-PE 120-5(r=0.644 7)。對(duì)20條類內(nèi)光譜對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)變化幅度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)除了普洱生茶的變化幅度小于1%之外，普洱熟茶的達(dá)到8%，滇紅茶的更是超過(guò)17%。該結(jié)果說(shuō)明粉碎粒徑對(duì)不同茶類均質(zhì)性影響明顯不同，這可能與三個(gè)茶樣的加工原料老嫩程度不同有關(guān)。

表1 不同茶類、粒徑茶樣的紅外光譜(KBr)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 1 Similarity evaluation results of different tea samples based on FTIR (KBr) spectra

2.2 不同粒徑、茶類及光譜采集方式的紅外光譜差異分析

圖1給出了3類滇產(chǎn)茶的4種粒徑茶粉共60條KBr譜重疊圖，圖2是相應(yīng)的ATR譜重疊圖。所有紅外光譜均按實(shí)驗(yàn)方法所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并選取1 800～700 cm-1波數(shù)范圍進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，不同譜線用不同顏色、線型標(biāo)記，標(biāo)記詳情見圖注。從圖1可以看出，三類茶樣呈現(xiàn)出明顯不同的紅外光譜吸收特征，吸收峰差異在3 500～3 000和1 600～1 000 cm-1范圍內(nèi)表現(xiàn)得最為明顯，普洱生茶的吸收峰相對(duì)最強(qiáng)、普洱熟茶的吸收峰相對(duì)最弱。還可看出，不同茶類間的譜線趨于分離，而同類茶間的譜線則更趨于聚攏重疊，3類茶中滇紅茶光譜表現(xiàn)相對(duì)較差。圖2中三類茶呈現(xiàn)出與圖1類似吸收特征，但在1 600～1 000 cm-1范圍內(nèi)光譜的類間差異更加突出、類內(nèi)差異相對(duì)更小。此外，2 000 cm-1附近為ATR譜普遍存在的噪音峰，對(duì)光譜標(biāo)準(zhǔn)化處理具有一定不利影響。

圖1 溴化鉀法紅外光譜重疊圖(1 900～500 cm-1)綠色:普洱生茶;紅色:滇紅茶;藍(lán)色:普洱熟茶Fig.1 Stacked plot of FTIR (KBr) spectra (1 900～500 cm-1)green:Raw-PE;red:YNBT;blue:Riped-PE

圖2 衰減全反射紅外光譜重疊圖(1 900～600 cm-1綠色:普洱生寵;紅色:滇紅茶;藍(lán)色:普洱熟茶Fig.2 Stacked plot of ATR-FTIR spectra (1 900～600 cm-1)green:Raw-PE;red:YNBT;blue:Riped-PE

光譜差異反映了茶樣組成差異，可通過(guò)重疊光譜圖中的譜線重疊程度直觀表現(xiàn)，這些直觀的視覺差異可以通過(guò)光譜間的歐式距離、夾角余弦值、皮爾森線性相關(guān)系數(shù)等進(jìn)行量化表達(dá)。上述結(jié)果表明，3類茶樣的均質(zhì)化程度受粉碎粒徑影響并不一致，普洱生茶的均質(zhì)性最好，滇紅茶的均質(zhì)性最差，該評(píng)價(jià)結(jié)果與前文的結(jié)果一致。

2.3 基于平行光譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果與分析

表2 KBr法的平行紅外光譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Similarity evaluation based on parallel FTIR (KBr) spectra

表3 ATR法平行紅外光譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Results of similarity evaluation based on parallel ATR-FTIR spectra

上述結(jié)果表明，粒徑、茶類及光譜采集方式均可能影響光譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果。均質(zhì)性與茶類相關(guān)，本研究中普洱生茶比滇紅茶、普洱熟茶表現(xiàn)出更好的均質(zhì)性；均質(zhì)性與茶粉粒徑成負(fù)相關(guān)，粒徑越小，均質(zhì)性越高；就兩種光譜采集方式比較結(jié)果而言，KBr譜比ATR譜表現(xiàn)出更強(qiáng)的差異區(qū)分能力，可能更適合用于組成類似樣本間的差異分析。

2.4 基于同類茶20個(gè)光譜間的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果與分析

前文平行光譜評(píng)價(jià)結(jié)果表明茶樣的均質(zhì)性與茶粉粒徑呈負(fù)相關(guān)，250目以上茶樣的均質(zhì)性最好。故以250目以上茶樣光譜為參比對(duì)來(lái)自于同類茶、不同粒徑的20個(gè)光譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并以下劃線標(biāo)記出與參比相似度較低的r值(<0.99)。表4、表5分別為基于KBr譜和ATR譜的評(píng)價(jià)結(jié)果，表中還分別給出了同粒徑、同茶類以及同一光譜采集方式的r均值。

從表4、表5可以看出，普洱熟茶、滇紅茶及普洱生茶20個(gè)KBr譜的r值中低于0.990 0的分別有10，10及0個(gè)，而相應(yīng)的ATR譜結(jié)果分別為6，13及4個(gè)。值得注意的是，43個(gè)低于0.990 0的r值中，除了3個(gè)源于滇紅茶120目以上樣品的ATR譜之外，其余40個(gè)全部源于120目以下的茶樣?；贙Br譜的同類茶比較，(rRaw-PE(0.997 7)>(rRiped-PE(0.980 2)>(rYNDH(0.970 9)，相應(yīng)的ATR譜結(jié)果為(rRaw-PE(0.992 3)>(rRiped-PE(0.991 8)>(rYNDH(0.987 6)?；贙Br譜的同粒徑比較結(jié)果為(rD(0.999 4)>(rC(0.996 7)>(rB(0.983 6)>(rA(0.952 0)，相應(yīng)的ATR譜結(jié)果為(rD(0.999 2)>(rC(0.992 8)>(rB(0.988 8)>(rA(0.981 6)。此外，60個(gè)KBr譜r均值為0.991 6，低于相應(yīng)的ATR譜均值0.993 3。

表4 同類茶、不同粒徑的20個(gè)KBr譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Similarity evaluation of the same kind of tea samples with different particle sizes based on 20 IR spectra (KBr)

表5 同類茶不同粒徑的20個(gè)ATR譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Similarity evaluation of the tea samples with same type but different particle sizes based on 20 ATR-FTIR spectra

該評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)一步表明普洱生茶相對(duì)于另外兩種茶樣具有更好的均質(zhì)性。更重要的是，結(jié)果表明粉碎粒徑大小可能嚴(yán)重影響茶粉的均質(zhì)化程度，利用粉碎均質(zhì)化程度不足(120目以下)的茶粉紅外光譜分析茶葉化學(xué)組成可能導(dǎo)致光譜不能真實(shí)反映樣本化學(xué)組成信息。兩種光譜采集方式結(jié)果對(duì)比分析表明，KBr譜對(duì)樣品間的組成差異反映更為靈敏，更適合組成高度相似的同類樣本間的差異識(shí)別與分析。

3 結(jié) 論

對(duì)3類滇產(chǎn)茶樣的不同粒徑茶粉進(jìn)行KBr法和ATR法紅外光譜的一系列相似度評(píng)價(jià)研究。不同茶類對(duì)比表明，普洱生茶茶樣比普洱熟茶和滇紅茶茶樣的均質(zhì)化程度更高，這可能與加工普洱熟茶、滇紅茶的茶箐原料比普洱生茶原料稍顯粗老、茶梗木質(zhì)化程度稍高有關(guān)。不同光譜采集方式研究結(jié)果表明，雖然ATR平行光譜表現(xiàn)出更好的重現(xiàn)性，但KBr譜明顯具有相對(duì)更好的樣品間差異識(shí)別能力，更適合用于茶葉產(chǎn)品這樣的組成高度相似的同類樣本間的差異識(shí)別與分析。對(duì)不同粒徑茶粉的研究結(jié)果表明，茶粉的均質(zhì)化程度與茶粉粒徑密切相關(guān)，粒徑越小，均質(zhì)化程度越高。非均質(zhì)樣品的充分均質(zhì)化前處理是取得可靠分析結(jié)果的基本保障，這對(duì)于單次測(cè)試取樣量低至1 mg的紅外光譜(KBr)分析而言尤為如此。一般而言，120目以上的茶粉粒徑可讓KBr譜達(dá)到r>0.995，但若基于ATR譜進(jìn)行分析，最好將茶樣粉碎至250目以上。

值得指出的是，雖然樣品的均質(zhì)化程度和樣品間的組成差異可以方便地通過(guò)紅外光譜相似度進(jìn)行量化評(píng)價(jià)，但對(duì)于具體分析樣本而言，研究確定可靠的相似度評(píng)價(jià)閾值非常重要，簡(jiǎn)單利用相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可能存在潛在的誤判風(fēng)險(xiǎn)。