張楊子 王璇 吳玙彤 潘淑惠 文正常 文明
摘要:本試驗旨在研究鴨腸炎病毒(DEV)gD蛋白亞細(xì)胞定位及其對病毒感染的相關(guān)作用。本研究經(jīng)過對DEV病毒擴(kuò)增處理,利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組gD基因胞外區(qū)蛋白(gDw),以兔抗gDw IgG為抗體,進(jìn)行免疫熒光反應(yīng),對比病毒對照組,檢查gD蛋白在吸附、侵入以及傳播之間起到的作用。結(jié)果表明,經(jīng)過熒光顯微鏡觀察,接種DEV后4h可見綠色熒光,主要在細(xì)胞核附近。持續(xù)觀察6~24h發(fā)現(xiàn)熒光隨著時間增加明顯加強(qiáng),細(xì)胞輪廓清晰,主要存在于胞漿中。激光顯微鏡下觀察接種DEV后4h可觀察到綠色熒光,經(jīng)過PI染色12h后可見綠色熒光更加明顯,主要在胞漿中呈現(xiàn),在胞核內(nèi)沒有出現(xiàn)特異性熒光。染色后72h可在細(xì)胞膜上觀察到綠色熒光,且輪廓清晰。添加兔抗gDw IgG不會影響病毒粒子吸附率,在病毒粒子吸附中糖蛋白D并未產(chǎn)生明顯作用。觀察組吸附率和噬斑數(shù)與對照組有顯著差異(P<0.05),添加兔抗gDw IgG后可有效降低病毒粒子侵入DEF,糖蛋白D具有阻止病毒侵入DEF的作用。添加兔抗gDw IgG后病毒噬斑直徑明顯減小,證實了在DEV細(xì)胞之間傳播過程中糖蛋白D起到抵抗作用。DEF感染DEV后2h可檢查到gD基因轉(zhuǎn)錄,經(jīng)過免疫熒光實驗,4h后可合成gD蛋白,出現(xiàn)在核膜和核周,12h出現(xiàn)在胞漿上,72h出現(xiàn)在細(xì)胞膜上。DEVgD參與病毒侵入以及細(xì)胞之間傳播的作用,對于病毒吸附不明顯,添加gDw Igw抗體后,細(xì)胞病變具有延遲反應(yīng)。
關(guān)鍵詞:鴨腸炎;病毒gD蛋白;亞細(xì)胞定位;病毒感染作用
鴨腸炎即鴨瘟,是由鴨腸炎病毒(DEV)引發(fā)的禽類感染傳染病,具有較強(qiáng)的傳染性,發(fā)病急,死亡率高[1]。一般情況下,禽類感染潛伏期約為3~5d,患病鴨表現(xiàn)出愛獨(dú)處,頭頸卷縮,雙腳麻痹,羽毛松亂,不愿意行走。隨著病情惡化開始腹瀉,排泄物呈白色或綠色,有腥臭味,食欲減退、肛門紅腫[2]。經(jīng)過解剖,患鴨出現(xiàn)體腔積血以及組織出血,存在器官壞死。gD蛋白亞細(xì)胞是病毒傳播的重要蛋白,具有中和病毒作用,作為一種中和抗原,能夠誘導(dǎo)保護(hù)反應(yīng),鴨腸炎疫苗就是通過將病毒結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原免疫,從而達(dá)到預(yù)防作用。通過研究gD蛋白定位和感染病毒作用,能夠?qū)崿F(xiàn)鴨腸炎的預(yù)防和治療。
1資料與方法
1.1實驗材料
采購10日齡左右的鴨胚,制備鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)[3]。采購鴨腸炎病毒弱病株。準(zhǔn)備分子生物學(xué)試劑以及生化試劑。準(zhǔn)備DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、低熔點瓊脂糖。配置PBS緩沖液、甲醇固定液以及碳酸鹽緩沖液等。
1.2方法
1.2.1 gD蛋白亞細(xì)胞定位根據(jù)gD基因序列,收集不同感染時間的DEF,并取正常細(xì)胞為對照組。提取RNA,經(jīng)過酶處理后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),將產(chǎn)物電泳處理。將DEV接種在載玻片上,接種1、2、4、6、12、24、72h后收獲細(xì)胞。使用PBS溶液進(jìn)行單層細(xì)胞的沖洗,同時使用多聚甲醛進(jìn)行固定處理,重復(fù)沖洗3次。使用PBS溶液處理細(xì)胞。沖洗后使用羊抗兔IgG孵育1h,用PI染色液染色處理,再次用PBS沖洗,固定在載玻片上,進(jìn)行顯微鏡觀察。
1.2.2 gD蛋白對病毒的感染作用
1)吸附作用。將病毒溶解于DMEM(無血清)、兔抗gDw IgG、兔陰性血清中,接種單層DEF,處理2h去除接種物,使用PBS進(jìn)行沖洗,將沒有結(jié)合的游離粒子沖洗干凈。在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng),對照組不需進(jìn)行沖洗,直接覆蓋低熔點瓊脂糖。
2)侵入作用。將病毒溶解于DMEM(無血清)、兔抗gDw IgG、兔陰性血清中,在37℃條件下進(jìn)行處理1h,丟棄接種物。對照組使用PBS溶液進(jìn)行清洗,觀察組使用醋酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗,經(jīng)過2min處理后,侵入粒子完全滅活。
3)傳播作用。使用半固體營養(yǎng)瓊脂充分吸收釋放病毒粒子,DEV通過細(xì)胞之間直接傳播形成噬斑。用病毒進(jìn)行接種,然后覆蓋有DMEM的營養(yǎng)瓊脂經(jīng)過培養(yǎng)后形成噬斑。進(jìn)行染色處理后,測量噬斑直徑。觀察組中含有兔抗gDw IgG。
1.3統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 23.0軟件處理數(shù)據(jù),使用t檢驗計量資料,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;使用卡房檢驗計數(shù)資料(%),P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1 gD蛋白亞細(xì)胞定位
經(jīng)過熒光顯微鏡觀察,正常DEF在激發(fā)光下沒有發(fā)現(xiàn)特異性熒光,經(jīng)過PI染色后呈紅色,可見橢圓形清晰輪廓。接種DEV后4h可見綠色熒光,主要在細(xì)胞核附近。持續(xù)觀察6~24h發(fā)現(xiàn)熒光隨著時間增加明顯加強(qiáng),細(xì)胞輪廓清晰,主要存在于胞漿中。激光顯微鏡下沒有觀察到DEF出現(xiàn)特異性綠色熒光。觀察組接種DEV后4h可觀察到綠色熒光,經(jīng)過PI染色12h后可見綠色熒光更加明顯,主要在胞漿中呈現(xiàn),在胞核內(nèi)沒有出現(xiàn)特異性熒光。染色后72h可在細(xì)胞膜上觀察到綠色熒光,且輪廓清晰。
2.2病毒gD蛋白對病毒吸附前后噬斑的變化
觀察組處理后噬斑(64.71±2.54)個,吸附率(71.29±1.34)%。2組對比,無明顯差異。具體結(jié)果詳見表1。
2.3病毒gD蛋白對病毒侵入前后噬斑的變化
觀察組處理后噬斑(51.56±1.70)個,侵入率(65.12±2.31)%。兩組對比,差異顯著(P<0.05)。具體結(jié)果詳見表2。
2.4病毒gD蛋白對細(xì)胞間傳播前后噬斑的變化
觀察組噬斑直徑(1.25±0.06)mm。兩組對比,差異顯著(P<0.05)。具體結(jié)果詳見表3。
3討論
gD是病毒囊膜的重要構(gòu)成部分,對病毒侵入細(xì)胞有重要意義,負(fù)責(zé)病毒包膜的融合和病毒釋放與擴(kuò)散的介導(dǎo)作用。在病毒復(fù)制和中和抗體中g(shù)D也產(chǎn)生重要作用,是體液免疫、宿主細(xì)胞免疫的重要靶標(biāo)。若病毒缺少gD基因,無法和細(xì)胞膜發(fā)生吸附作用,將造成病毒失去感染能力[4]。在病毒基因組中有至少80多個基因產(chǎn)物,但合成gD主要出現(xiàn)在病毒感染的早期,在DNA復(fù)制后合成,當(dāng)病毒復(fù)制活躍后,6~12h開始大量聚集。通過免疫熒光技術(shù)可觀察到感染4h后gD在核周囊泡上定位[5]。本研究也顯示,經(jīng)過熒光顯微鏡觀察,正常DEF在激發(fā)光下沒有發(fā)現(xiàn)特異性熒光,經(jīng)過PI染色后呈紅色,可見橢圓形清晰輪廓。接種DEV后4h可見綠色熒光,主要在細(xì)胞核附近。持續(xù)觀察6~24h發(fā)現(xiàn)熒光隨著時間增加明顯加強(qiáng),細(xì)胞輪廓清晰,主要存在于胞漿中。使用激光顯微鏡進(jìn)行觀察,沒有觀察到DEF出現(xiàn)特異性綠色熒光。觀察組接種DEV后4h可觀察到綠色熒光,經(jīng)過PI染色12h后可見綠色熒光更加明顯,主要在胞漿中呈現(xiàn),在胞核內(nèi)沒有出現(xiàn)特異性熒光。染色后72h可在細(xì)胞膜上觀察到綠色熒光,且輪廓清晰??梢奼D定位表現(xiàn)出動態(tài)變化過程,和gD發(fā)揮功能以及DEF增殖存在密切關(guān)聯(lián)性。在感染后4~6h為糖蛋白合成的活躍時期,從核膜向胞漿上轉(zhuǎn)移,顯微鏡可觀察到綠色熒光增加。感染24h后gD大量合成,胞漿內(nèi)病毒數(shù)量增加,向胞外釋放。在72h后觀察到細(xì)胞膜上出現(xiàn)明顯綠色熒光。
經(jīng)本試驗研究,添加gD抗體后會延遲DEV病變的發(fā)生,病變局限在少數(shù)細(xì)胞中,無法形成大范圍噬斑,也證明了DEV感染過程是一個膜融合的過程。本研究顯示,添加兔抗gDw IgG不會影響病毒粒子吸附率,在病毒粒子吸附中糖蛋白D并未產(chǎn)生明顯作用。主要對病毒侵入和細(xì)胞之間感染產(chǎn)生抑制作用。gD并不會錨定包膜上,gD抗體中和病毒會造成病毒gD數(shù)量減少,從而影響病毒的侵入以及傳播,最終造成病變延遲。本研究也顯示,觀察組處理后噬斑(51.56±1.70)個,侵入率(65.12±2.31)%。觀察組與對照組對比,差異顯著,證實觀察組吸附率和噬斑數(shù)和對照組有顯著差異,添加兔抗gDw IgG后可有效降低病毒粒子侵入DEF,糖蛋白D具有阻止病毒侵入DEF的作用。觀察組與對照組對比,差異顯著。添加兔抗gDw IgG后病毒噬斑直徑明顯減小,證實了在DEV細(xì)胞之間傳播過程中糖蛋白D起到抵抗作用。目前關(guān)于gD蛋白的基因研究還相對較少,未來還需要針對gD亞單位疫苗、gD核酸疫苗展開研究,從而有效預(yù)防和治療鴨腸炎。
4小結(jié)
綜上所述,DEF感染DEV后2h可檢查到gD基因轉(zhuǎn)錄,經(jīng)過免疫熒光試驗,4h后可合成gD蛋白,出現(xiàn)在核膜和核周,12h出現(xiàn)在胞漿上,72h出現(xiàn)在細(xì)胞膜上。DEVgD參與病毒侵入以及細(xì)胞之間傳播的作用,對于病毒吸附不明顯,添加gDw Igw抗體后,細(xì)胞病變具有延遲反應(yīng)。█
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