脈沖激光對誘發(fā)型2 型糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響研究

胡國花，蘭 娜

（西安市西電集團(tuán)醫(yī)院麻醉科，西安710077）

0 引言

糖尿病的發(fā)病率近年來呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢。我國是全球糖尿病第一大國，糖尿病患者占我國總?cè)丝诘慕咏?0%，而這其中有90%以上被確診為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2D）[1-2]。T2D 可引起機(jī)體諸多并發(fā)癥，包括心血管疾病、腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變及潰瘍等，這些并發(fā)癥也是T2D 具有高致殘率和致死率的主要原因。神經(jīng)病理性疼痛分為周圍性疼痛和中樞性疼痛2 類，是T2D 最主要的并發(fā)癥之一，發(fā)病率占T2D 總?cè)藬?shù)的近50%[3]。糖尿病大多累及周圍神經(jīng)，以肢體遠(yuǎn)端受累為主的對稱性周圍神經(jīng)病理性疼痛為其主要的表現(xiàn)形式[4]，臨床特點為對于疼痛或非疼痛刺激敏感性增加，體現(xiàn)為自發(fā)和觸發(fā)痛、痛覺過敏、痛覺超敏和異常性疼痛[5-6]。目前臨床的主要治療藥物包括鎮(zhèn)痛類、抗抑郁和焦慮類、抗炎類及神經(jīng)營養(yǎng)類，但是由于這些藥物的毒副作用和部分有效性限制，亟待開發(fā)更多有效、經(jīng)濟(jì)且安全的治療方法[7-8]。激光器的成功研發(fā)使激光在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究在近年來受到了越來越廣泛的關(guān)注，特別是低強(qiáng)度脈沖激光，憑借其溫和、安全、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢，在多種疾病的臨床治療（包括軟組織損傷和骨創(chuàng)傷修復(fù)、抗炎癥及抗自由基損傷等[9-10]）中得到了廣泛的應(yīng)用。

近年來，低強(qiáng)度脈沖激光的生物學(xué)效應(yīng)受到了科研人員和臨床工作者的廣泛關(guān)注。諸多研究證實，低強(qiáng)度脈沖激光在皮膚損傷修復(fù)、骨折愈合、骨關(guān)節(jié)炎治療等方面具有積極的療效[11-12]。同時學(xué)者們通過動物和臨床研究均揭示，低強(qiáng)度脈沖激光具有緩解慢性疼痛的功效[9，13]。雖然激光所產(chǎn)生的積極的生物學(xué)效應(yīng)的潛在機(jī)制尚未明確，但是學(xué)者們推測激光對于機(jī)體的影響是其誘發(fā)的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、光化學(xué)效應(yīng)、電磁效應(yīng)等累積疊加的效果[10]。但是，低強(qiáng)度脈沖激光是否能夠顯著緩解糖尿病誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛，國內(nèi)外鮮有研究報道。而研究激光療法對于發(fā)生率更高的T2D 所誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的作用效果，則更具廣泛的臨床應(yīng)用價值。本研究通過構(gòu)建誘發(fā)型T2D 大鼠模型，系統(tǒng)地探究低強(qiáng)度脈沖激光對于T2D 所誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的作用效果。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

清潔級SD 雄性大鼠，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），購自美國Sigma 公司；便攜式血糖分析儀，購自美國Lifescan公司；低強(qiáng)度激光發(fā)生系統(tǒng)，購自瑞典Irradia 公司；Von Frey 纖維絲，購自美國Stoelting 公司；熱痛敏刺激和測量系統(tǒng)，購自意大利Commat 公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自北京天根生物技術(shù)公司；Maxima SYBR Green qPCR 試劑盒，購自美國Thermo 公司；總RNA 提取試劑Trizol，購自美國Invitrogen 公司。

1.2 實驗設(shè)計與分組

實驗動物飼養(yǎng)于溫度（23±1）℃、相對濕度（55±5）%、晝夜明暗周期12 h/12 h 的實驗室環(huán)境中。將3月齡的SD 大鼠使用完全隨機(jī)分組法分為空白對照組（Control 組）、T2D 組和T2D 激光治療組（T2D+laser組）3 組，每組10 只。Control 組大鼠以普通飼料喂養(yǎng)，T2D 組和T2D+laser 組大鼠以高脂高糖飼料（包含10%豬油、10%蔗糖、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉）喂養(yǎng)，大鼠全部自由飲水。高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周后，對T2D 組和T2D+laser 組大鼠行腹腔STZ注射（質(zhì)量濃度35 mg/kg），Control 組大鼠行等劑量的檸檬酸緩沖液注射。STZ 注射后繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)4 周。隨后，使用血糖儀通過尾靜脈取血測量各組大鼠清晨的隨機(jī)血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L 并表現(xiàn)出多飲、多食、多尿的“三高”癥狀的大鼠，被認(rèn)定為符合T2D 標(biāo)準(zhǔn)，納入本實驗研究。最終所有大鼠均納入研究。T2D+laser 組大鼠施加低強(qiáng)度脈沖激光治療8 周，每天治療3 次，每次50 s；Control 組和T2D 組的大鼠予以假暴露干預(yù)。

1.3 脈沖激光裝置

本研究所用的低強(qiáng)度激光裝置為脈沖工作模式，采用單極性電極刺激方式。輸出的激光波長為830 nm，激光裝置的峰值工作功率為20 W，波形的脈沖寬度為200 ns，頻率為700 Hz，平均輸出功率為60 mW，功率密度為60 mW/0.38 cm2，激光的暴露時間為50 s，產(chǎn)生的激光能量為3 J。

1.4 機(jī)械痛閾值測定

對3 組大鼠分別在實驗的第0、2、4、6 和8 周實施足底機(jī)械痛閾值的測定。具體方法：測量前將實驗大鼠放置于金屬網(wǎng)中，上方設(shè)有透明樹脂玻璃罩，令其充分適應(yīng)30 min。待大鼠安靜后，使用Von Frey 纖維絲刺激大鼠后足中央，刺激過程中或移開纖維絲的瞬間，大鼠出現(xiàn)明顯的抬足、躲避、舔腳等反應(yīng)，將此次測量記為陽性，并記錄動作發(fā)生時間。每一標(biāo)號的纖維絲對每側(cè)足底刺激5 次（雙側(cè)10 次），如出現(xiàn)5 次以上陽性反應(yīng)，則記錄該纖維絲力度為被采集指標(biāo)。如果發(fā)現(xiàn)實驗動物出現(xiàn)5 次不抬腿的情況，則更換更高刻度的纖維絲。

1.5 熱痛閾值測定

對3 組大鼠分別在實驗的第0、2、4、6 和8 周實施足底熱痛閾值的測定。具體方法：測量前，將實驗大鼠置于獨立的有機(jī)玻璃籠中，令其充分適應(yīng)30 min。使用熱輻射測痛儀對大鼠足底中部行熱光束照射，大鼠因無法耐受熱痛出現(xiàn)抬足反應(yīng)，此時光束會自動切斷并自動記錄反應(yīng)時間。每只大鼠的每側(cè)足底共刺激5 次（雙側(cè)共10 次），每次間隔10 min，記錄10次測量值并取其平均值。

1.6 脊髓細(xì)胞因子檢測

8 周后，應(yīng)用過量戊巴比妥鈉溶液對各組大鼠進(jìn)行腹腔注射處死。通過RNA 提取試劑盒提取腰段脊髓L5 背角總RNA，以2 μg RNA 為上樣量，按照試劑盒說明書的步驟在20 μL 反應(yīng)體系中對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR 儀對所選目標(biāo)基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，引物序列詳見表1。PCR 的反應(yīng)體系：cDNA 模板1.6 μL，上、下引物（濃度為10 μmol/L）各0.8 μL，SYBR 嵌合熒光試劑10 μL，最后使用去離子水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至20 μL。具體反應(yīng)條件：95 ℃變性處理3 min，95、60 ℃各30 s，循環(huán)40 次后，進(jìn)行55 ℃退火處理15 s。每種基因設(shè)置4 個復(fù)孔，使用2-ΔΔCT法對白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和神經(jīng)生長因子（NGF）的相對表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

表1 本研究實時PCR 檢測中所使用的引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗涉及的全部實驗數(shù)據(jù)均使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。3 組大鼠各實驗參數(shù)的統(tǒng)計學(xué)差異均使用單因素方差分析。如果單因素方差分析發(fā)現(xiàn)3 組數(shù)據(jù)間存在統(tǒng)計差異，使用Benferoni 多重檢驗法對3 組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低強(qiáng)度脈沖激光治療未改變T2D 大鼠的血糖值

各組大鼠在實驗的第0、2、4、6、8 周的隨機(jī)血糖值比較結(jié)果如圖1 所示。T2D 組大鼠的隨機(jī)血糖值在實驗的第0、2、4、6、8 周均顯著高于Control 組大鼠（P＜0.001），而T2D＋laser 組大鼠的隨機(jī)血糖值也同樣在第0、2、4、6、8 周均顯著高于Control 組大鼠（P＜0.001），但是T2D 組與T2D＋laser 組大鼠之間的血糖值在實驗的各時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠在不同時間的隨機(jī)血糖值比較結(jié)果

2.2 低強(qiáng)度脈沖激光治療顯著提升T2D 大鼠的足底機(jī)械痛閾值

各組大鼠在實驗的第0、2、4、6、8 周的足底機(jī)械痛閾值比較結(jié)果如圖2 所示。T2D 組大鼠的足底機(jī)械痛閾值在實驗的第0、2、4、6、8 周均顯著低于Control組大鼠（P＜0.001），T2D＋laser 組大鼠的足底機(jī)械痛閾值在第0 周顯著低于Control 組大鼠（P＜0.001），但與T2D 組大鼠比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。T2D＋laser組大鼠的足底機(jī)械痛閾值在第2、4、6、8 周均顯著高于T2D 組大鼠（P＜0.01），在第2、4、6 周顯著低于Control 組大鼠（P＜0.05），但在第8 周與Control 組大鼠比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠在不同時間的足底機(jī)械痛閾值比較結(jié)果

2.3 低強(qiáng)度脈沖激光治療顯著提升T2D 大鼠的足底熱痛閾值

各組大鼠在實驗的第0、2、4、6、8 周的足底熱痛閾值比較結(jié)果如圖3 所示。與Control 組大鼠相比，T2D 組大鼠足底熱痛閾值在第0、2、4、6、8 周均顯著降低（P＜0.001），而T2D＋laser 組大鼠足底熱痛閾值在第0、2、4、6 周也顯著降低（P＜0.05），但在第8 周無明顯差異（P＞0.05）。與T2D 組大鼠相比，T2D＋laser 組大鼠足底熱痛閾值在第0 周無明顯差異（P＞0.05），但在第2、4、6、8 周均顯著升高（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠在不同時間的足底熱痛閾值比較結(jié)果

2.4 低強(qiáng)度脈沖激光降低T2D 大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6 表達(dá)水平并提升NGF 表達(dá)水平

各組大鼠8 周后的脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6 和NGF 表達(dá)結(jié)果如圖4 所示。T2D 組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α 和IL-6 的基因表達(dá)水平顯著高于Control 組大鼠（P＜0.001），脊髓NGF 的基因表達(dá)水平顯著低于Control 組大鼠（P＜0.01）。而T2D＋laser 組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α 和IL-6 的基因表達(dá)水平顯著低于T2D 組大鼠（P＜0.01），其脊髓NGF 的基因表達(dá)水平顯著高于T2D 組大鼠（P＜0.05）。但是T2D＋laser 組與Control 組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6 和NGF基因表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠8 周后脊髓重要基因表達(dá)結(jié)果

3 討論

T2D 所誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛一直是糖尿病并發(fā)癥臨床治療的棘手問題，嚴(yán)重危害了患者的生理和心理健康[13]。對于T2D 的研究，有諸多的動物模型可供選擇，這其中包括自發(fā)型T2D 模型和誘發(fā)型T2D 模型[14]。自發(fā)型T2D 模型主要依托基因修飾鼠的途徑，而誘發(fā)型模型主要通過高脂高糖飲食協(xié)同注射STZ 構(gòu)建。自發(fā)型T2D 模型通常需要人為地修改動物體內(nèi)的特定基因表達(dá)，從而達(dá)到模擬T2D 臨床特征的效果，但其構(gòu)建成本較高、周期長，且難以避免所改變的基因?qū)τ诩膊”旧淼母蓴_因素。但是無論是自發(fā)型T2D 動物還是誘發(fā)型T2D 動物，低強(qiáng)度脈沖激光對于其神經(jīng)病理性疼痛的作用效果國內(nèi)外尚鮮有研究報道。本研究使用STZ 注射聯(lián)合高脂高糖膳食方法構(gòu)建誘發(fā)型T2D 模型，系統(tǒng)探究了低強(qiáng)度脈沖激光對于誘發(fā)型T2D 所引起的神經(jīng)病理性疼痛的影響。該模型是目前研究T2D 的經(jīng)典模型之一，也是較為理想的能夠模擬臨床T2D 特征的動物模型。

臨床上糖尿病神經(jīng)病理性疼痛最重要的表現(xiàn)是痛覺過敏和超敏，而通過行為學(xué)的足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值檢測，能夠很好地反映T2D 大鼠對于外界刺激的疼痛忍受能力[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，小劑量的單次STZ 注射協(xié)同高脂高糖飲食所誘發(fā)的T2D 在實驗的各時間點（第0、2、4、6、8 周）均表現(xiàn)出明顯的足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的降低，這一結(jié)果也表明T2D 模型表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)病理性疼痛的特征，提示T2D 神經(jīng)病理性疼痛模型構(gòu)建成功。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度的脈沖激光治療在短時間內(nèi)（2 周）對T2D 誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛即可產(chǎn)生積極的治療效果，且這種積極的治療效果能夠在治療的全程得以維持，并在第8 周基本達(dá)到正常大鼠的水平（T2D＋laser 組在第8 周與Control 組無統(tǒng)計學(xué)差異）。本文研究結(jié)果提示，低強(qiáng)度脈沖激光療法對于緩解T2D 神經(jīng)病理性疼痛癥狀具有積極的效果。

同時，大量研究揭示，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛與機(jī)體的炎性反應(yīng)密切相關(guān)，諸多炎性因子介導(dǎo)了糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展，而調(diào)控炎性因子的表達(dá)也被認(rèn)為是開發(fā)抗糖尿病神經(jīng)病理性疼痛新的作用靶點[16-17]。大量證據(jù)表明，促炎性因子包括IL-1β、TNF-α 和IL-6 表達(dá)在糖尿病機(jī)體的脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中被誘發(fā)，可以導(dǎo)致神經(jīng)痛敏反應(yīng)[18]。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)了T2D 大鼠脊髓中的IL-1β、TNF-α 和IL-6 表達(dá)水平顯著高于正常大鼠，這也與先前關(guān)于T2D 的動物和臨床研究結(jié)果保持一致[19]。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)經(jīng)過8 周的低強(qiáng)度脈沖激光治療后，T2D 大鼠脊髓中的促炎性因子IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表達(dá)水平均顯著降低，這表明激光療法對于T2D神經(jīng)病理性疼痛的改善效應(yīng)與其抗炎性反應(yīng)有關(guān)。

在T2D 患者機(jī)體中，神經(jīng)再生能力降低，而作為維持神經(jīng)元存活和生長發(fā)育的關(guān)鍵性細(xì)胞因子——NGF 的表達(dá)水平降低參與T2D 神經(jīng)病理性疼痛病變的發(fā)生與進(jìn)展[20]。研究發(fā)現(xiàn)，T2D 患者血液和脊髓中NGF 的表達(dá)水平均顯著降低[21]，而通過外源性的注射，NGF 能夠顯著緩解T2D 神經(jīng)病理性疼痛癥狀[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂高糖聯(lián)合STZ 注射誘發(fā)的T2D 大鼠脊髓中的NGF 表達(dá)水平顯著低于Control 組，這也與先前的臨床研究結(jié)果保持一致[22]。而8 周的低強(qiáng)度脈沖激光治療顯著提高了T2D 大鼠脊髓NGF的表達(dá)水平，這提示激光療法對于神經(jīng)再生具有潛在的積極促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究證實了8 周的低強(qiáng)度脈沖激光治療對于STZ 注射聯(lián)合高脂高糖膳食誘發(fā)的T2D大鼠的神經(jīng)病理性疼痛癥狀具有明顯的改善作用，而該效應(yīng)與激光對于促炎性因子的抑制和對NGF的促進(jìn)有關(guān)。本研究揭示了低強(qiáng)度脈沖激光療法憑借其溫和、經(jīng)濟(jì)、安全等特性有望成為臨床治療T2D神經(jīng)病理性疼痛的可行方法。雖然本研究明確了低強(qiáng)度脈沖激光對于T2D 神經(jīng)病理性疼痛的積極治療效果，但是尚缺乏激光對于T2D 神經(jīng)病理性疼痛分子信號機(jī)制的進(jìn)一步深入探討。在后續(xù)的研究中，將以促炎性因子相關(guān)的調(diào)控通路為切入點，結(jié)合基因測序、模式動物等手段，進(jìn)一步明確低強(qiáng)度脈沖激光改善T2D 神經(jīng)病理性疼痛的分子機(jī)制。