miR-199a-5p調控DDR1抑制人腦膠質瘤細胞增殖和遷移

閆兆月,高玉帥,賈玉龍，步星耀

(河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科,河南 鄭州 450008)

腦膠質瘤是一種顱內常見的惡性腫瘤，約占顱內原發(fā)性腫瘤的46%。目前，有關腦膠質瘤的臨床治療主要是以手術療法、放療和化療為主，但是以上臨床療效不佳，病人預后較差，其原因是由于腫瘤細胞的惡性增殖并伴隨高度的侵襲和轉移能力[1-2]。因此，通過抑制腦膠質瘤細胞增殖和遷移能力對于治療腦膠質瘤具有積極的臨床價值。

miR-199a-5p在多種腫瘤細胞和組織中異常表達，參與調控腫瘤細胞的增殖代謝、血管生成、侵襲轉移和凋亡等過程[3]。研究證實，在不同的腫瘤細胞中miR-199a-5p發(fā)揮不同生物學作用。在乳腺癌細胞MCF7，miR-199a-5p表達明顯下調，過表達miR-199a-5p能夠抑制自噬相關基因(Beclin1)表達，從而調控乳腺癌細胞自噬水平并抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移[4]。另外，在結腸癌細胞中miR-199a-5p負向調控FZD基因。FZD基因能夠影響腫瘤細胞增殖、分化以及遷移等。miR-199a-5p能夠抑制FZD表達從而發(fā)揮抗癌作用[5]。以上研究表明[6]，miR-199a-5p在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。但是有關miR-199a-5p對人腦膠質瘤細胞增殖和遷移的作用尚不清楚。盤狀結構域受體1(discoid domain receptor 1，DDR1)是一種非整合素膠原受體，廣泛參與細胞增殖、遷移和分化等生命活動。在卵巢癌患者中DDR1在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達，抑制DDR1能夠降低卵巢癌細胞增殖和遷移[7]。既往研究證實，miR-199a-5p靶向DDR1抑制大腸癌細胞增殖和遷移[8]。但是有關miR-199a-5p能否靶向DDR1抑制人腦膠質瘤細胞增殖和遷移尚不清楚。因此，本研究擬通過構建miR-199a-5p過表達U251細胞株，探究miR-199a-5p對其增殖和遷移的影響及其作用機制。

1 材料

1.1 實驗細胞與試劑U251腦膠質瘤細胞(中科院上海分院細胞庫)；DMEM細胞培養(yǎng)基(HyClone公司)；細胞裂解液、胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白marker、BCA試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液和ECL發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術研究所)；逆轉錄試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)；miR-199a-5p和DDR1引物設計合成(上海生工生物工程股份有限公司)；DDR1一抗(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：5583)；GAPDH一抗(碧云天生物技術研究所，貨號：AF5001)；CCK-8測定試劑盒(碧云天生物技術研究所，貨號：C0037)；Transwell小室(美國Corning 公司)；HRP辣根過氧化物酶標記鼠、兔二抗(碧云天生物技術研究所)；pcDNA3.1質粒(BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心)；野生型DDR1-WT和突變型DDR1-MUT熒光素報告酶基因載體(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器單功能酶標儀(湖南湘儀技術有限公司)；低溫、高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司)；PCR儀(山東博科科學儀器有限公司)；Western blot檢測裝置(美國Bio-Rad公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與分組人腦膠質瘤U251細胞使用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞置于37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞貼壁生長，待生長融合度達80%-90%時，傾去培養(yǎng)基，PBS潤洗2次，采用0.25%的胰蛋白酶消化3 min至細胞呈卵圓形，10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)基終止消化，進行傳代處理。后續(xù)實驗分為：對照組(無轉染處理的U251細胞，24 h)、陰性對照組(轉染空載體質粒U251細胞，NC)以及實驗組(轉染miR-199a-5p成熟模擬物，mimics)。另外，在細胞生長融合度達到80%時，設置組別：轉染miR-199a-5p成熟模擬物組，轉染miR-199a-5p成熟模擬物+DDR1空載體組(pcDNA3.1組)以及轉染miR-199a-5p成熟模擬物+DDR1質粒組(pcDNA3.1-DDR1組)，以上各組轉染對應質粒24 h后，收集各自細胞進行實驗。

2.2 MTT檢測細胞活力將消化后的U251細胞按照96孔板密度為：1×104/孔接種，細胞貼壁生長24 h后，實驗分為對照組、miR-199a-5p NC組和miR-199a-5p mimics組，其中miR-199a-5p mimics組轉染miR-199a-5p 模擬物24 h，每組設置6個復孔，重復3次。每孔加入5% MTT的溶液22 μL繼續(xù)室溫孵育2 h，酶標儀設定波長為570 nm檢測各孔的吸光度值。

2.3 劃痕試驗檢測各組細胞遷移能力取對數(shù)生長期人腦膠質瘤U251細胞鋪板，待各組細胞在6孔板內生長融合達到約100%時，采用3 μL微量移液槍頭在6孔板內垂直劃痕。PBS潤洗3次后，采用無血清DMEM細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后在顯微鏡下隨機選擇5個100倍視野內拍照并計算各組劃痕后細胞遷移至空隙的細胞數(shù)目。

2.4 Transwell檢測各組細胞遷移能力各組細胞首先采用無血清培養(yǎng)基進行吹打并計數(shù)，將上述細胞密度稀釋為108個·L-1，之后將上述細胞加入至Transwell小室內，體積為200 μL，各自細胞數(shù)目保持為2×104個，下室中加入完全培養(yǎng)基500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24-48 h，傾去小室內細胞培養(yǎng)基，采用PBS潤洗2-3次，對于膜上方的細胞利用棉簽輕輕擦去，Transwell上下小室室溫條件下用4%的多聚甲醛固定約30 min，PBS潤洗2次，0.1%的結晶紫染色15 min，最后再次使用PBS潤洗2次。顯微鏡下觀察同一視野下5個位置的細胞數(shù)目，取各組平均值進行統(tǒng)計學分析。

2.5 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測miR-199a-5p和DDR1 mRNA表達水平依據(jù)RNA提取試劑盒說明書步驟提取U251細胞總RNA，并運用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度與純度。以RNA為模板，參照逆轉錄試劑盒說明書步驟將其逆轉錄為單鏈cDNA。再以cDNA為模板，根據(jù)廣州銳博公司設計合成的 PCR引物進行擴增。擴增條件：92 ℃，30 s；92 ℃，5 s；60 ℃，31 s，共進行30個循環(huán)。采用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，根據(jù)2-ΔΔCt值相對定量樣本中目的基因表達水平。

Tab 1 Primer sequences for RT-qPCR

2.6 Western blot檢測DDR1表達水平將處理完成的U251細胞放置于1.5 mL的組織研磨管內并按照1 ∶4比例加入細胞裂解液放置在已經(jīng)預冷后的細胞組織勻漿儀中進行研磨；4 ℃ 12 000×g離心10 min，收集細胞上清液，采用BCA法進行蛋白質濃度定量檢測；每孔上樣量為30 μg進行蛋白質凝膠電泳實驗，根據(jù)目的蛋白分子量大小以及蛋白Marker指示進行切膠，濕轉轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育DDR1(1 ∶100)，4 ℃過夜，孵育二抗(1 ∶5 000)1-2 h，于搖床搖晃洗膜，含吐溫磷酸鹽緩沖液(TPBS)洗滌后加入ECL，使用膠片曝光，圖片掃描后用 ImageJ 軟件計算各條帶的灰度值，以各目標條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 miR-199a-5p轉染效果驗證轉染miR-199a-5p mimics 8 h后，熒光顯微鏡下觀察U251細胞內可見大量顆粒狀，部分顆粒可呈現(xiàn)細胞樣輪廓。表明miR-199a-5p mimics已經(jīng)成功轉入U251細胞(Fig 1)。qRT-PCR檢測各組miR-199a-5p表達水平顯示，與Control組相比，miR-199a-5p mimics組miR-199a-5p表達增加(P<0.01)，miR-199a-5p NC差異無顯著性(P>0.05)(Fig 2)。

Fig 1 Verification of miR-199a-5p transfection effect(40×)

Fig 2 The expression level of miR-199a-5p **P<0.01 vs control.

3.2 轉染miR-199a-5p對U251細胞增殖和遷移的影響分別采用CCK-8、細胞劃痕實驗以及Transwell實驗檢測U251細胞增殖和遷移。CCK-8檢測顯示，與Control組相比，轉染miR-199a-5p mimics組細胞活力降低(P<0.01)(Fig 3A)。細胞劃痕實驗，與Control組相比，轉染miR-199a-5p mimics組細胞遷移數(shù)目減少(P<0.01)(Fig 3B、3C)。Transwell實驗，與Control組相比，轉染miR-199a-5p mimics組細胞遷移數(shù)目亦減少(P<0.01)(Fig 3D、3E)。以上結果表明miR-199a-5p能夠抑制人腦膠質瘤細胞U251增殖和遷移。

3.3 轉染miR-199a-5p對DDR1表達的影響qRT-PCR和Western blot實驗檢測U251細胞DDR1表達水平。與Control組相比，轉染miR-199a-5p mimics組U251細胞DDR1 mRNA和蛋白水平均下調(P<0.01)(Fig 4)。

3.4 過表達DDR1逆轉miR-199a-5p模擬物對U251細胞增殖和遷移的影響為進一步證實miR-199a-5p靶向DDR1抑制U251細胞增殖和遷移。通過構建DDR1過表達細胞系，探究miR-199a-5p/DDR1在U251細胞增殖和遷移中作用。與Control組相比，轉染pcDNA3.1-DDR1組DDR1表達上調(P<0.01)(Fig 5A)。細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示，與轉染miR-199a-5p mimincs組相比，過表達DDR1能夠促進人腦膠質瘤細胞U251增殖和遷移(P<0.01)(Fig 5B-5E)。

Fig 3 Effect of miR-199a-5p mimics on U251 cell A:The cell viability of U251 cells;B:Scratch assays were performed to test the migration ability of U251cells;C:Quantification of B;D:Transwell experiments were performed to test the migration ability of U251 cells;E:Quantification of D.**P<0.01 vs control.

Fig 4 Effect of miR-199a-5p mimics on DDR1 A:The expression of DDR1 mRNA.B:The expression of DDR1 protein.**P<0.01 vs Control.

Fig 5 Effect of overexpression of DDR1 on miR-199a-5p inhibiting proliferation and migration of U251 A:The expression of DDR1 protein.B:Scratch assays were performed to test the migration ability of U251cells.C:Quantification of B.D:Transwell experiments were performed to test the migration ability of U251 cells.E:Quantification of D.**P<0.01 vs miR-199a-5p mimics.

4 討論

miRNA是一類長度約20-25個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA，其主要機制是與靶基因3′-UTR完全或是不完全配對，進而降解靶基因mRNA或抑制翻譯，并參與機體的生長發(fā)育、增殖、分化等相關生命活動[9]。miRNA在腫瘤的防治以及預后中發(fā)揮重要的調控作用。miR-199a是miRNAs中的一員，研究證實miR-199a在人體中是以miR-199a-5p和miR-199a-3p兩種成熟形式存在[10]。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a在多種腫瘤進程中扮演不同的角色，在卵巢組織以及相應的細胞株中miR-199a表達下調，過表達miR-199a能夠抑制腫瘤細胞增殖、遷移以及血管形成[11]。然而，在胃癌組織miR-199a表達明顯高于癌旁正常的胃黏膜組織，進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a表達水平與胃癌患者的癌細胞轉移成正相關[12]。在膠質瘤U251細胞中，miR-199a-3p表達明顯下調，過表達miR-199a-3p能夠抑制p21蛋白激活激酶4表達進而增加U251對化療的敏感性[13]。另外，在神經(jīng)膠質瘤細胞系中miR-199a-5p表達下調，過表達miR-199a-5p能夠靶向抑制鎂轉運蛋白1表達，進而抑制神經(jīng)膠質瘤細胞系增殖、遷移和侵襲[14]。以上研究均表明，miR-199a-5p在膠質瘤的進程，尤其增殖和遷移中發(fā)揮關鍵的抑制作用。但是，有關miR-199a-5p對膠質瘤增殖、遷移的分子作用機制尚不完全清楚。因此，本研究首先通過轉染miR-199a-5p mimics 8 h發(fā)現(xiàn)U251細胞內可見大量熒光顆粒狀，部分熒光顆?？沙尸F(xiàn)細胞樣輪廓。表明miR-199a-5p mimics已經(jīng)成功轉入U251細胞。進一步qRT-PCR檢測各組U251細胞miR-199a-5p表達水平，結果顯示與Control組相比，轉染miR-199a-5p mimics組細胞miR-199a-5p表達明顯升高。

細胞異常增殖和遷移是膠質瘤惡化的關鍵因素。CCK-8檢測顯示與Control相比，轉染miR-199a-5p mimics能夠明顯降低U251細胞活力，抑制細胞增殖。細胞劃痕實驗和Transwell實驗顯示，與Control組相比，轉染miR-199a-5p mimics組細胞遷移率明顯降低。本研究結果與以往文獻中miR-199a-5p抑制U251細胞增殖和遷移一致。DDR1是受體酪氨酸蛋白酶家族成員之一，廣泛參與了腫瘤細胞的增殖和遷移過程。既往文獻報道，在膠質母細胞瘤和臨床組織樣本中DDR1表達上調，DDR1抑制劑聯(lián)合化療能夠降低增加膠質母細胞瘤對化療藥物的敏感性[15]。另外，DDR1a能夠激活基質金屬蛋白酶2誘導膠質母細胞瘤粘附和侵襲[16]。那么miR-199a-5p是否可以通過降低DDR1表達抑制膠質瘤細胞增殖和遷移呢？為此，本研究通過過表達miR-199a-5p發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p mimics組DDR1 mRNA和蛋白表達水平顯著低于Control。以往文獻通過雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-199a-5p能夠靶向DDR1 3′-UTR抑制DDR1表達，從而調控腫瘤細胞增殖[17]。為進一步確證miR-199a-5p能夠靶向DDR1抑制膠質瘤細胞增殖和遷移。本實驗通過在轉染miR-199a-5p的U251細胞中質粒轉染pcDNA3.1-DDR1，探究過表達DDR1能夠逆轉miR-199a-5p對膠質瘤細胞增殖和遷移的作用。Western blot檢測穩(wěn)轉pcDNA3.1-DDR1組DDR1蛋白表達顯著增加，表明過表達DDR1質粒轉染成功。細胞劃痕實驗和Transwell實驗顯示，與miR-199a-5p mimics組相比，轉染pcDNA3.1-DDR1組膠質瘤細胞增殖和遷移降低。

綜上所述，本研究通過探究miR-199a-5p對膠質瘤細胞增殖和遷移的影響。結果發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p能夠靶向DDR1抑制膠質瘤細胞增殖和遷移。以上研究結果為膠質瘤細胞增殖和遷移的發(fā)生機制提供了新的理論基礎，miR-199a-5p可能成為膠質瘤治療的生物靶點，但是需要進一步在動物模型或膠質瘤患者中確證。