銀杏果外種皮總黃酮提取工藝和抗氧化活性

李超峰 吳雯雯 王靖雯

摘要：以銀杏果肉質(zhì)外種皮為原料、總黃酮含量為指標，采用冷凝回流法和超聲波法提取，分別以料液比、乙醇濃度、提取溫度和超聲波功率、工作時長、超聲時長為試驗單因素，確定影響提取效果的因素及其水平，通過正交法優(yōu)化，確定最佳提取工藝。采用還原力與清除羥自由基、超氧陰離子自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力對總黃酮進行抗氧化活性的評價。結(jié)果表明，當超聲波功率為75 W、液料比為6 mL ∶ 1 g、乙醇濃度為70%、提取溫度為60 ℃、工作總時長為1 080 s、工作時長為3s/次和間隙時長為10 s/次時，銀杏外種皮的總黃酮提取率最高，為221%。研究還發(fā)現(xiàn)，銀杏果外種皮總黃酮具有良好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：銀杏;外種皮;總黃酮;抗氧化活性;提取工藝

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科銀杏屬僅有的植物，素有植物“活化石”之稱，在民間常用作中草藥。銀杏果實、葉片和樹皮均有很高的藥食價值，主要含有黃酮類、內(nèi)酯類、有機酚酸類、聚戊烯醇類、多糖類等生物活性物質(zhì)，其中黃酮類和內(nèi)酯類是主要藥用成分[1-4]。目前，銀杏的藥用成分在臨床上主要用于治療心腦血管疾病、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、降低血液黏度、降血脂、提高機體免疫力等方面[4-8]，因而受到廣泛關(guān)注，具有廣闊的市場前景。銀杏果外種皮是銀杏種子（白果）硬殼外的肉質(zhì)部分，俗稱白果衣胞。我國在生產(chǎn)銀杏種核時，每年約產(chǎn)生4.8萬t外種皮，且常常被作為廢棄物丟棄于環(huán)境中，既浪費了資源，又造成了嚴重的環(huán)境污染。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，銀杏外種皮含有多糖、酚酸、黃酮、萜內(nèi)酯等多種化合物，具有較高的藥用價值[9]，因此，加大對銀杏外種皮的開發(fā)利用，可以節(jié)約有限的生物資源，減輕環(huán)境污染。

本研究采用冷凝回流提取法和超聲波法提取銀杏果外種皮總黃酮，以提取率為評價指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化提取工藝，并明確該總黃酮的抗氧化活性。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

銀杏果于2019年10月采自鹽城師范學院校園內(nèi)，去核后于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗試劑

主要試劑：蕓香苷標準品，購自上海佳和生物科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁（AlNO3）、氫氧化鈉（NaOH）、1，10-菲咯啉、亞硫酸鐵（FeSO4）、H2O2、氯化硝基四氮唑藍（NBT）、L-蛋氨酸（L-Met）、乙二氨四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、核黃素（VB2）、鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸、三氯化鐵（FeCl3）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、甲醇、乙醇、石油醚等其他試劑均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗儀器

電子天平，購自ME204E 瑞士梅特勒公司;勻漿機[AD145S-P（8G/10G）]，購自上海昂尼公司;索氏抽提器（SXT-06型），購自上海洪紀儀器有限公司;超聲波破碎儀（VCX150PB），購自美國SONICS公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-210型），購自瑞士Buchi公司;真空冷凍干燥機（Labconco立式18），購自美國Labconco公司;紫外可見分光光度計（UV-2100型），購自尤尼可上海儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 銀杏果外種皮的預處理 摘取銀杏果，去除果蒂后，清洗、自然風干表皮水分，剔除果核并勻漿，再用2倍量石油醚混合，用50 ℃回流法去除脂溶性物質(zhì)，剩余濾渣備用。

1.4.2 銀杏果外種皮總黃酮的提取

1.4.2.1 冷凝回流法 將10 g銀杏果外種皮經(jīng)過勻漿和脫脂后，加入不同濃度和體積的乙醇溶液，并將冷凝回流提取器于不同溫度提取3 h后取出，冷卻，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無醇味，定容至 100 mL，4 ℃保存，用于總黃酮含量的測定。根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，用正交試驗法對其工藝參數(shù)進行進一步優(yōu)化，以明確該提取方法的最佳技術(shù)參數(shù)。

1.4.2.2 超聲波法 將10 g銀杏果外種皮經(jīng)勻漿和脫脂后，按1 g ∶ 5 mL的料液比與70%乙醇溶液混合，經(jīng)不同功率超聲波作用不同時間后取出，于 4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無醇味，定容至100 mL，于 4 ℃ 保存，用于總黃酮含量的測定。根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，采用正交試驗法對其工藝參數(shù)進行進一步優(yōu)化，以明確該提取方法的最佳技術(shù)參數(shù)。

1.4.3 總黃酮的測定 稱取蕓香苷標準品 5.00 mg，加水溶解后定容于50 mL容量瓶內(nèi)，得100 mg/L蕓香苷標準溶液。分別移取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL蕓香苷標準溶液于25.00 mL容量瓶內(nèi)，定容得濃度梯度標準液的稀釋液。取 1 mL 梯度稀釋液和4.00 mL 30%乙醇溶液混合，再加入0.40 mL 5% NaNO2，搖勻靜置6 min，加入040 mL 10% AlNO3顯色劑，搖勻靜置10 min，再加入4% NaOH，搖勻靜置15 min，以不添加蕓香苷的標準溶液作為空白對照，于波長510 nm處測定吸光度。以標準溶液濃度為橫坐標、以吸光度為縱坐標建立回歸方程。按上述方法測定銀杏果外種皮提取液的吸光度，根據(jù)回歸方程計算總黃酮含量。

1.4.4 銀杏果外種皮總黃酮的抗氧化活性

1.4.4.1 還原力 按照Oyaizu的方法測定還原力[10]。取不同濃度的0.25 mL樣品，依次加pH值為6.6的0.2 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）和1% K3[Fe（CN）6]各2.5 mL，充分混勻后于50 ℃恒溫水浴20 min，取出后再加入2.5 mL 10%三氯乙酸混勻，10 000 r/min離心10 min。取5.0 mL上清液，依次加入5.0 mL H2O、1.0 mL 0.1% FeCl3，于 700 nm 處測定吸光度。

1.4.4.2 清除羥自由基 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定清除羥自由基的能力，具體步驟參照Jin等的方法[11]，并略有改動。（1）依次取1 mL 0.75 mol/L 鄰二氮菲、2 mL 0.2 mmol/L pH值為74的PBS和1 mL ddH2O，充分混勻，再加1 mL 075 mmol/L FeSO4，混勻后加入1 mL 0.01% H2O2，于37 ℃恒溫水浴60 min，在波長536 nm處測定吸光度（Df）。步驟（2）與步驟（1）相同，僅H2O代替H2O2，吸光度記作D0。步驟（3）與步驟（1）相同，僅樣品代替ddH2O，吸光度記作Dx。步驟（4）與步驟（1）相同，僅樣品代替H2O2，吸光度記作Ds。清除羥自由基活性計算方法為：

1.4.4.3 清除超氧陰離子自由基 采用氯化硝基四氮唑藍光還原法測定清除超氧陰離子自由基的能力，具體步驟見Duan等的方法[12]，并略有改動。取5 mL含有15.6 mmol/L L-Met、0.112 5 mmol/L NBT、0.3 mmol/L EDTA-Na2和pH值為7.8的005 mol/L PBS反應(yīng)混合液，對照組加入0.5 mL ddH2O，樣品本底吸收校正組和試驗組各加0.5 mL不同濃度的總黃酮提取液，3種試驗組再加1 mL VB2后，將調(diào)零組和校正組立即置于暗處，試驗組于25 ℃照光15 min后，立即遮光，在波長560 nm處測定吸光度。清除超氧陰離子活性按下式計算：

1.4.4.4 清除DPPH自由基 具體參照Manivasagan等的方法并略有改動[13]。將0.2 mL不同濃度的樣品與5 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液混合，在室溫下遮光反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測定吸光度（D）;以0.2 mL ddH2O代替樣品作為空白對照（D′），以甲醇代替含有DPPH的甲醇溶液作為樣品本底吸收校正（Dj）。清除二苯代苦味?；杂苫钚园聪率接嬎悖?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凝回流法提取率的影響因素及其水平的確定

2.1.1 液料比對提取率的影響 由圖1可知，在乙醇濃度為70%、提取溫度為60 ℃、提取時間為3 h和液料比為1～5 mL ∶ 1 g的條件下，隨著液料比的增加，銀杏外種皮總黃酮提取率逐漸提高;當液料比從1 mL ∶ 1 g增加到2 mL ∶ 1 g時，提取率線性提高;當液料比從4 mL ∶ 1 g增加到 5 mL ∶ 1 g 時，提取率從1.22%提高到1.45%，變化平緩，僅增加023百分點。因此，綜合提取效率，選擇4 mL ∶ 1 g、 5 mL ∶ 1 g和6 mL ∶ 1 g等3個液料比水平進行正交試驗。

2.1.2 溫度對提取率的影響 如圖2所示，在提取時長為3 h、液料比為5 mL ∶ 1 g、乙醇濃度為70%、溫度為30～70 ℃的條件下，隨著提取溫度逐漸提高，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢;當提取溫度為60 ℃時，總黃酮提取率最高，為1.49%。因此，選擇50、60、70 ℃這3個溫度水平進一步進行正交試驗。

2.1.3 乙醇濃度對提取率的影響 如圖3所示，在提取溫度為60 ℃、提取時間為3 h、液料比為 5 mL ∶ 1 g 和乙醇濃度為60%～100%的條件下，隨著乙醇濃度的提高，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢。當乙醇濃度為80%時，總黃酮提取率最高，為1.73%。因此，選擇70%、80%、90% 3個水平的乙醇濃度進一步進行正交試驗。

2.1.4 正交優(yōu)化 冷凝回流法正交試驗因素與水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果見表2。由極差大小可知，3個因素對提取率的影響程度依次為液料比（C）>乙醇濃度（A）>溫度（B）。均值代表了每個因素的最佳水平條件，對同一因素的3個水平進行比較可知：A1>A3>A2，B2>B3>B1，C3>C2>C1，因此，在該冷凝回流試驗中，A1B2C3組成了最優(yōu)水平，即在冷凝回流提取中，乙醇濃度為70%，提取溫度為60 ℃，液料比為6 mL ∶ 1 g。

2.2 超聲波法提取率的影響因素及其水平的確定

2.2.1 工作總時長對提取率的影響 由圖4可知，在超聲波功率為150 W、工作時長為3 s/次、間隙時長為10 s/次、乙醇濃度為70%和液料比為5 mL ∶ 1 g的條件下，隨著工作總時長的增加，銀杏外種皮總黃酮提取率基本呈升高趨勢。當超聲波工作總時長為 900 s 時，總黃酮提取率最高，為 1.47%。因此，選擇720、900、1 080 s 3個水平的超聲波工作總時長進行正交試驗。

2.2.2 工作時長對提取率的影響 由圖5可知，在工作總時長為360 s、功率為150 W、間隙時長為 10 s/次、乙醇濃度為70%和液料比為5 mL ∶ 1 g的條件下，隨著超聲波工作時長的延長，銀杏外種皮的總黃酮提取率呈“S”形趨勢。當超聲波工作時長為4 s/次時，總黃酮提取率最高，為0.78%。因此，選擇3、4、5 s/次3個水平的超聲波工作時長進行正交試驗。

2.2.3 功率對提取率的影響 由圖6可知，在工作總時長為360 s、超聲波工作時長為3 s/次、間隙時長為10 s/次、乙醇濃度為70%和液料比為5 mL ∶ 1 g的條件下，隨著超聲波功率的提高，銀杏外種皮的總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢。當超聲波功率為60 W時，總黃酮提取率最高，為1.40%。因此，選擇45、60、75 W 3個水平的超聲波功率進行正交試驗。

2.2.4 正交優(yōu)化 超聲波正交試驗因素與水平設(shè)計見表3，正交試驗結(jié)果見表4。由極差大小可知，3個因素對提取率的影響程度依次為超聲波功率（E）>工作時長（F）>總時長（D）。均值代表了每個因素的最佳水平條件，對同一因素的3個水平進行比較可知：D3>D2>D1，E3>E2>E1，F(xiàn)1>F2>F3。因此，在該冷凝回流試驗中，D3E3F1組成了各因素最優(yōu)水平，即在超聲波提取過程中，工作總時長為 1 080 s，功率為75 W，工作時長為3 s/次。

將優(yōu)化后的提取條件相結(jié)合，在液料比為 6 mL ∶ 1 g、乙醇濃度為70%、提取溫度為60 ℃、超聲波功率為75 W、工作總時長為1 080 s、工作時長為3 s/次和間隙時長為10 s/次的條件下，外種皮總黃酮的提取率為2.21%。因此可見，與單一提取法相比，2種方法結(jié)合的效果較好，既可以提高銀杏外種皮總黃酮的提取率，又可以縮短提取時間，提高效率，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 還原力 物質(zhì)的還原能力是潛在抗氧化性能的重要體現(xiàn)[14]。如圖7所示， 隨著濃度的提高，銀杏果外種皮總黃酮的還原力逐漸增強，且在試驗濃度范圍內(nèi)，二者呈線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0969 4，回歸方程為y=0.000 3x+0.208 4。

2.3.2 清除羥自由基活性 羥自由基是已知活性最強、危害最大的活性氧，對脂類、蛋白和核酸等生物大分子具有強烈的氧化脅迫作用，使其正常生理功能難以進行，進而產(chǎn)生畸變，甚至可累積致死[15]。由圖8可以看出，在濃度為0.2～0.8 g/L的范圍內(nèi)，銀杏果外種皮總黃酮清除羥自由基的活性逐漸升高，清除率最高達59.13%;而當濃度為1.0 g/L時，其活性略有降低，清除率為57.85%。

2.3.3 清除超氧陰離子自由基活性 超氧陰離子活性相對較低，但卻是生物體內(nèi)羥自由基、過氧化氫等其他自由基形成的基礎(chǔ)，它們均由超氧陰離子自由基衍生而來[16]。同時，超氧陰離子自由基可以使DNA損傷，進而引發(fā)突變，也可以使過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶、肌酸激酶失活，從而對生物產(chǎn)生毒害作用[17]。由圖9可知，隨著濃度的提高，銀杏果外種皮總黃酮清除超氧陰離子的活性逐漸增強，且在0.2～1.0 g/L范圍內(nèi)二者呈線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.990 5，回歸方程為y=0.046 8x+7238 3。

2.3.4 清除DPPH自由基活性 自由基與衰老、心血管疾病、癌癥、糖尿病、帕金森綜合癥等多種疾病發(fā)生有著潛在聯(lián)系[18]。DPPH自由基結(jié)構(gòu)簡單、性質(zhì)穩(wěn)定、反應(yīng)易于控制，是抗氧化劑自由基清除活性篩選的首選試劑[19]。由圖10可知，銀杏外種皮總黃酮具有清除DPPH自由基的能力，且在試驗條件下，清除DPPH自由基的活性與濃度呈線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.972 2，回歸方程為y=0.027 6x+42.258 0。

3 結(jié)論

在上述單因素研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗分析，確定了相應(yīng)的工藝條件。在超聲波功率為 75 W、液料比為6 mL ∶ 1 g、乙醇濃度為70%、提取溫度為60 ℃、工作總時長為1 080 s、工作時長為 3 s/次、間隙時長為10 s/次的條件下，銀杏果外種皮的總黃酮提取率為2.21%。此外，銀杏果外種皮總黃酮具有較強的抗氧化活性，對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基都具有顯著的清除活性。研究結(jié)果為新一代安全抗氧化等產(chǎn)品的開發(fā)及銀杏加工廢棄物的高值化利用提供了有益參考，具有重要的經(jīng)濟和理論意義。

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