雷帕霉素通過活化MAPK促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細胞自噬*

曹相玫，徐 輝，武艷瑋，游南林，于佳翔，馬 杰

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，寧夏銀川 750004）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是由神經(jīng)干細胞或祖細胞引起的神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)腫瘤，呈侵襲性生長，對放化療不敏感，治療效果有限［1］。細胞自噬是一種亞細胞水平的自我吞噬，自噬基因的異常表達能夠啟動或抑制某些腫瘤的形成［2］。研發(fā)新的自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑促使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生自噬性死亡，已經(jīng)成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的新方向。雷帕霉素（rapamycin，Rapa）是一種抗真菌的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，與細胞毒性藥物或酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制腫瘤［3］，其機制主要是通過誘導(dǎo)細胞自噬而不是凋亡發(fā)揮作用［4］。本項工作通過在細胞體外實驗中觀察Rapa 神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG 細胞的抑制作用和對自噬相關(guān)蛋白的影響，進一步探討Rapa 促進U87-MG 細胞自噬的作用和可能機制。

材料和方法

1 細胞和主要試劑

人膠質(zhì)瘤細胞株U87-MG 由本實驗室儲存。Rapa 批號CAS 53123-88-9；0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA）和SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)液（HyClone）；Ⅰ抗兔抗［哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR、LC3-II、beclin-1、70 kD核糖體蛋白S6 激酶（70 kD ribosomal protein S6 ki?nase，p70S6K）、p-S6、p-MAPK 和膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic pretein，GFAP）］、鼠抗β-actin 抗體和Ⅱ抗（HRP 標記的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG）均購自Cell Signaling Technology；二甲基亞砜（DMSO）和噻唑藍（MTT）購自Sigma。

2 實驗儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（ESCO）；低溫冷凍離心機（Sigma）；超凈工作臺（Thermo）；連續(xù)光波酶標儀和凝膠化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔儀器廠）。

3 實驗方法

3.1 細胞培養(yǎng)與藥物分組 將U87-MG細胞以1×105個接種于25T 透氣培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)中，隔日換液，3～4 d 傳代。培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，棄去原培養(yǎng)液，更換含Rapa的培養(yǎng)液，正常對照（normal control，NC）組用等量DSMO 配制，按濃度梯度分組，即NC組（0 μmol/L Rapa）和實驗組（1、2.5、5、10、20和40 μmol/L Rapa［5］），經(jīng)過預(yù)實驗各梯度濃度的設(shè)置，觀察蛋白水平的表達情況，后續(xù)實驗按此分組進行。

3.2 平板集落形成實驗檢測細胞集落形成能力平板集落形成實驗用于貼壁細胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞呈貼壁生長。將對數(shù)生長期的U87-MG 細胞以每孔2 000 個接種在6 孔板上，待8 h 貼壁后更換含20 μmol/L Rapa 培養(yǎng)液，于倒置顯微鏡下觀察（40 μmol/L Rapa 干預(yù)使細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變及活力下降，而20 μmol/L Rapa 干預(yù)后細胞的形態(tài)變化不明顯，因此平板集落形成實驗采用濃度為20 μmol/L），干預(yù)48 h 后更換常規(guī)培養(yǎng)液，14 d 后，棄掉培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛常溫固定30 min，0.05%的結(jié)晶紫染色15 min，清水沖洗皿底，晾干拍照。ImageJ 軟件計數(shù)集落形成數(shù)量。計算集落形成率（%）=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

3.3 軟瓊脂集落形成實驗驗證細胞集落形成能力 軟瓊脂集落形成實驗用于懸浮細胞，呈貼壁生長的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中會有少數(shù)細胞懸浮在細胞表面。配制0.05% 的結(jié)晶紫和100 mL 的1.2% 和0.7%瓊脂糖，高壓滅菌后置于55℃水浴中，保持融化狀態(tài)。配制500 mL 的2×培養(yǎng)液（20%FBS+2×DMEM+2×抗生素），37℃預(yù)熱。鋪下膠：按1∶1 比例使1.2%瓊脂糖下膠和2×培養(yǎng)液混合，6 孔盤每孔迅速加入1.5 mL混合液，輕輕混勻，室溫靜置待下膠凝固（加混合液時不能產(chǎn)生氣泡），待下層膠凝固過程中處理細胞。Rapa組細胞用20 μmol/L Rapa處理，于倒置顯微鏡下觀察（40 μmol/L Rapa 干預(yù)使細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變及活力下降，而20 μmol/L Rapa干預(yù)后細胞的形態(tài)變化不明顯，因此軟瓊脂集落形成實驗采用濃度為20 μmol/L），對照組細胞為等量DSMO 處理，干預(yù)48 h后（基本過程為，用吸管反復(fù)吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液輕微沖洗細胞表面30 s，即可獲得U87-MG 的懸浮細胞），進行細胞計數(shù)，該過程不用胰蛋白酶消化液。離心培養(yǎng)液后調(diào)整細胞濃度至5×107/L。待下層膠凝固后，鋪上膠：按1∶1比例混合0.7%瓊脂糖和2×培養(yǎng)液，加100 μL 細胞懸液，即5 000 細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)2～3周。結(jié)晶紫染色。

3.4 MTT 比色法檢測細胞活力 細胞計數(shù)，調(diào)整密度為1×1013/L，取10 μL 細胞懸液種于96 孔板中（96孔板中預(yù)先加入含梯度濃度Rapa 的培養(yǎng)液140 μL），每組設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2、100%濕度的孵箱中孵育48 h，每孔分別加入20 μL MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，若藥物與MTT 能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS 沖2～3 遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，結(jié)束前5 min 每孔加入DMSO 100 μL，緩慢振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解，均勻分布后，用連續(xù)光波酶標儀于450 nm波長處測定吸光度（A）。

3.5 Western blot 法檢測相關(guān)蛋白表達 細胞經(jīng)各濃度Rapa 干預(yù)48 h 后，分別收集1×106個細胞離心提取蛋白，用BCA 法進行蛋白定量。配制8% SDSPAGE 凝膠，上樣蛋白濃度為4 g/L，80/120 V 恒壓電泳后，300A 恒流濕轉(zhuǎn)PVDF 膜，TBST 洗膜后，10%牛奶封閉1 小時，再次洗膜，孵育1∶500 兔抗人Ⅰ抗（mTOR、p-mTOR、LC3-II、beclin-1、p70S6K、p-S6、p-MAPK 和β-actin），4℃過夜。次日，室溫下復(fù)蘇1 h后，用TBST 洗膜3 次，1∶3 000 山羊抗兔或山羊抗鼠IgG Ⅱ抗于室溫下孵育1 h，洗膜后，ECL 發(fā)光液與條帶反應(yīng)1 min后，上機曝光并記錄蛋白表達灰度值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

各實驗結(jié)果采用SPSS 23.0 軟件分析。計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 法。各實驗重復(fù)3次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Rapa 促進膠質(zhì)瘤U87-MG 細胞自噬相關(guān)蛋白表達

Western blot 結(jié)果顯示，經(jīng)梯度Rapa 處理后，U87-MG 細胞中自噬標志蛋白LC3-II 水平升高，在20 μmol/L 組達到峰值，40 μmol/L 組略低于20 μmol/L 組；自噬相關(guān)蛋白beclin-1 在各實驗組（1、2.5、5 和10 μmol/L Rapa）中的表達量呈梯度升高，于10 μmol/L 達到峰值，20 μmol/L 和40 μmol/L 呈梯度下調(diào)趨勢（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.The protein levels of beclin-1 and LC3-II in U87-MG cells treated with gradient concentrations of rapamycin（Rapa）were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖1 Rapa對U87-MG膠質(zhì)瘤細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響

2 Rapa對U87-MG細胞的抑制作用

軟瓊脂集落形成實驗顯示，結(jié)晶紫染色后，與NC 組相比，Rapa 干預(yù)組無顯著集落形成（P＜0.05），見圖2A。

平板集落形成實驗顯示，NC 組細胞集落呈深藍色，針尖至針冒大小不等；Rapa處理組形成的新集落染色淺，呈淡藍色，面積小，且數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖2B。

MTT 實驗顯示，梯度濃度的Rapa 干預(yù)能夠顯著抑制U87-MG 細胞活力，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05），見圖2C。

3 Rapa對U87-MG 細胞mTOR 及相關(guān)通路信號分子的影響

Western blot 結(jié)果表明，U87-MG 細胞給予Rapa處理后，mTOR 及磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白水平降低，與NC 組相比，5、10、20 和40 μmol/L Rapa 均使mTOR 下調(diào)，且p-mTOR 水平呈劑量依賴性降低，40 μmol/L 組下調(diào)最顯著（P＜0.05）；p70S6K 先輕度增高而后降低，表達趨勢呈拋物線軌跡，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；p-S6 表達趨勢相反，Rapa 干預(yù)后p-S6 水平顯著降低，在40 μmol/L 上升至NC 組的水平（P＜0.05），見圖3。

Figure 2.The colony-forming and proliferation abilities of U87-MG cells treated with rapamycin（Rapa）.A and B：the U87-MG cells were treated with 20 μmol/L Rapa，and the numbers of new colonies were observed by plate colony formation assay and soft agar colony formation assay，respectively；C：the viability of U87-MG cells treated with gradient concentrations of Rapa for 48 h was determined by MTT assay.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖2 Rapa處理膠質(zhì)瘤U87-MG細胞后集落形成和增殖能力的變化

Figure 3.The protein levels of mTOR，p-mTOR，p70S6K and p-S6 in U87-MG cells treated with gradient concentrations of rapamy?cin（Rapa）were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖3 Rapa對U87-MG細胞mTOR及其信號分子p70S6K和p-S6表達的影響

4 Rapa促進U87-MG細胞自噬的相關(guān)機制

Western blot 結(jié)果表明，梯度濃度的Rapa 處理后p-MAPK 蛋白水平呈梯度增加，具有劑量依賴性，與NC組相比，40 μmol/L Rapa組上調(diào)最顯著（P＜0.05）；GFAP 的表達水平在Rapa 濃度為1、2.5、5 和10 μmol/L 時上調(diào)不明顯，在20 和40 μmol/L 時顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.The protein levels of p-MAPK and GFAP in U87-MG cells treated with gradient concentrations of rapamycin（Rapa）were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖4 Rapa對U87-MG細胞p-MAPK和GFAP蛋白水平的影響

討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤約占腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%，占惡性腦腫瘤的80%，其侵襲性強，手術(shù)后常輔以放化療治療。通過放療和化療影響腫瘤細胞自噬是目前腫瘤輔助治療的新理論［6］。自噬是一種亞細胞水平的自我吞噬，細胞通過自噬可以實現(xiàn)自身代謝和細胞器更新，以適應(yīng)環(huán)境、維持穩(wěn)態(tài)。自噬活性的改變、自噬信號通路的異常調(diào)控與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、密切相關(guān)，自噬基因的異常表達能夠啟動或抑制某些腫瘤的形成［2］。

Rapa 是mTOR 的抑制劑，其衍生物與其他藥物聯(lián)合作用，有效的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的生長與增殖。mTOR 是自噬誘導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Rapa 可以與mTOR 發(fā)生靶向組合，阻滯信號向下傳遞。在酵母細胞中，mTOR 是自噬途徑中的必須激酶，通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因1（autophagy-related gene 1，Atg1）在自噬中起重要作用［7］。除了mTOR 途徑，腺苷酸活化蛋白酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途徑和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）途徑也是自噬過程的重要信號通路。當細胞自噬刺激信號加強時，AMPK 途徑活化，間接抑制mTOR，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生；I 型PI3K 在自噬進程中起相反作用。本研究進行細胞體外實驗中，給予Rapa處理后mTOR 和p-mTOR 的蛋白水平均呈劑量依賴性降低。

為了進一步明確Rapa 干預(yù)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的自噬情況，檢測了自噬標志蛋白和beclin-1的表達水平。beclin-1 是一個能抑制腫瘤發(fā)生的哺乳動物自噬蛋白［8］，LC3被認為是自噬性細胞死亡的特異性標志物［9］。內(nèi)源性beclin-1 蛋白在人乳腺上皮癌細胞系和組織中表達較低，但在正常乳腺上皮細胞中廣泛高表達，因此自噬蛋白表達的減少可能導(dǎo)致乳腺和其他人類惡性腫瘤的發(fā)展或進展［10］。在哺乳動物中，LC3 是Atg 8 的同源物［8］，大鼠LC3 的C 端被半胱氨酸蛋白酶Atg4 裂解，產(chǎn)生LC3-I，它位于胞質(zhì)部分；Atg7 和Atg3 可以將LC3-I 轉(zhuǎn)化為LC3-II，LC3-II在C 端被磷脂酰乙醇胺修飾，并與自噬體膜緊密結(jié)合。另有研究顯示，高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中自噬相關(guān)蛋白的表達水平比低級別者高，LC3-II/Beclin 高表達與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的低生存率相關(guān)，支持了自噬在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中的重要作用［11］。因此，腫瘤自噬呈現(xiàn)“雙刃劍”的功能，過度上調(diào)的自噬作用也可以引起細胞死亡，即“自噬性細胞死亡”，也稱為II 型程序性細胞死亡，從而起到抑制腫瘤生長的作用［12］。本研究顯示，梯度濃度的Rapa 處理后，U87-MG 細胞中自噬標志蛋白LC3-II 呈持續(xù)增高的趨勢，在20 μmol/L 組和40 μmol/L 組，其表達量顯著增加，提示Rapa 作用下U87-MG 細胞出現(xiàn)了“自噬性細胞死亡”，從而細胞增殖被抑制。beclin-1 蛋白的表達量呈現(xiàn)了拋物線樣的趨勢，即表達先梯度升高，在10 μmol/L 組達到峰值，在20 μmol/L 和40 μmol/L 組呈梯度下調(diào)趨勢，推測這是U87-MG細胞對過度自噬發(fā)生的保護性反應(yīng)?？傊琑apa 能夠促進U87-MG 細胞自噬。

Rapa 通過促進U87-MG 細胞自噬從而產(chǎn)生的增殖抑制作用，MTT 實驗顯示Rapa 能夠抑制U87-MG細胞活力，平板集落形成實驗顯示Rapa 能夠抑制膠質(zhì)瘤U87-MG細胞的集落形成能力。進一步，將狀態(tài)好的U87-MG 細胞的表層懸浮細胞收集起來進行軟瓊脂集落形成實驗，此前已證實了這些懸浮細胞具有干細胞特性［13］，Rapa 處理后這些懸浮細胞集落形成能力幾乎喪失。這些結(jié)果說明Rapa 通過抑制mTOR，促進細胞自噬，從而抑制U87-MG 細胞增殖。類似的報道可見，白藜蘆醇處理能夠促進U87-MG細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-II 和beclin-1 的表達，促進細胞自噬從而抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖［13］。由此可見，自噬與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞自噬從而起到抑制腫瘤生長的手段是重要的。

MAPK/ERK1/2 是mTOR 的上游調(diào)節(jié)因子，既往研究中已經(jīng)證明MAPK/ERK1/2 信號通路的激活是自噬性細胞死亡誘導(dǎo)的經(jīng)典機制［14］，p70S6K 和p-S6是自噬相關(guān)的mTOR 通路關(guān)鍵信號分子。S6K 受mTOR 和PI3K 的控制，從絲裂原刺激的小鼠3T3 細胞中分離出的磷酸化S6 被稱為p70S6K［15］。S6K 的物種為果蠅。Rapa 及其胞內(nèi)受體形成復(fù)合物RAFT1/FRAP/mTOR，RAFT1 可以直接磷酸化p70S6K，從而促進S6 激酶活性［16］。檢測p70S6K 和p-S6 的表達情況顯示，梯度濃度的Rapa 干預(yù)后，p70S6K 先輕度增高而后降低，表達趨勢呈拋物線軌跡，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；p-S6 表達趨勢相反，Rapa干預(yù)后p-S6 表達明顯降低，在40 μmol/L 驟然上升至NC組的水平。因此，這些結(jié)果并未明顯提示Rapa促進U87-MG 細胞自噬的過程是通過復(fù)合物RAFT1/FRAP/mTOR發(fā)揮作用的。

為了進一步觀察Rapa 抑制U87-MG 細胞的作用，我們檢測了GFAP 的表達。GFAP 是神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷中的重要腫瘤標志物，是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標志蛋白［17］。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞分化的過程中，GFAP 表達增加，mTOR 信號通路活化，所以，mTOR 增高同時GFAP 增加，這是合理的解釋。然而在本研究中觀察到，在Rapa 促進U87-MG 細胞自噬的過程中，mTOR降低，GFAP 增加。因此我們推測，Rapa 抑制mTOR，促進自噬；同時促進U87-MG 細胞分化，GFAP 表達升高，后者不是通過抑制mTOR 信號通路影響的。為了解釋這些現(xiàn)象，我們查閱文獻：GFAP 的增加可以促使巨噬細胞發(fā)生自噬，這種自噬反應(yīng)受p38 MAPK 的調(diào)控［18］。MAPK 是一種連接細胞表面受體和細胞內(nèi)關(guān)鍵調(diào)控靶點的進化保守酶，ERK 是MAPK 的一個主要級聯(lián)［19］。MAPK（ERK）/mTOR 通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，MAPK/ERK1/2 是mTOR 的上游調(diào)節(jié)分子［20］。MAPK/ERK1/2 信號通路的激活是自噬性細胞死亡誘導(dǎo)的經(jīng)典機制［14］。相關(guān)研究顯示，anisomycin 是MAPK 的激活劑，大鼠脊髓損傷后，用anisomycin 上調(diào)MAPK，且GFAP 的表達顯著升高［21］，說明MAPK 活化，GFAP 升高。我們因此檢測了p-MAPK 的水平，梯度濃度Ra?pa處理后，p-MAPK蛋白水平呈劑量依賴性增加。這表明自噬激活MAPK/ERK1/2 信號通路，促進MAPK活化，相應(yīng)的促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤GFAP表達增加。

綜上所述，本研究證實了Rapa 能使MAPK/ERK1/2 通路磷酸化激活，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細胞自噬增加，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細胞增殖。這從體外的角度表明Rapa 具有一定的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細胞生長的潛能。