無機多聚磷酸鹽在神經(jīng)變性疾病中的作用、機制及潛在應用*

耿雪薇，陳曉丹，黃筱鈞，黃 勝，羅洪斌，石廷玉

（湖北民族大學醫(yī)學部病原生物學教研室，湖北恩施 445000）

無機多聚磷酸鹽（inorganic polyphoshpate，polyP）是由磷酸根通過高能磷酸鍵連接而成的線狀聚合物［1］。在生物出現(xiàn)之前polyP就已經(jīng)存在于地球。在早期地球的高壓和干燥環(huán)境中能產(chǎn)生polyP，比如在類似地球早期環(huán)境的火山口存在polyP。polyP 的廣泛存在表明其在生物的起源和生存方面起到非常關鍵的作用［2］。polyP在細菌中起到多種作用，如細菌的運動性、生物膜形成、毒性和壓力抗性等［3］。雖然哺乳動物的polyP 合成酶還未被鑒定［4］，但其水解是由外切酶——堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）所催化，從polyP 末端裂解持續(xù)釋放磷酸根。另一個人類polyP 外切酶h-prune 能降解任何長度的polyP。人們逐漸認識到polyP在真核生物中也具有廣泛的功能，比如在細胞能源的動態(tài)平衡，血液凝固、炎癥反應、細胞凋亡、線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的形成、成骨細胞的功能、DNA 修復和基因的轉錄、離子通道的功能、哺乳動物大腦內細胞信號轉導以及在淀粉樣蛋白形成過程中對神經(jīng)元的保護作用［5］等方面，polyP均參與或發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，polyP 在腦部的含量隨著年齡增加而減少［6］，提示polyP 可能參與年齡相關性神經(jīng)變性疾病如阿爾茲海默癥（Alzheimer disease，AD）和帕金森疾?。≒arkinson disease，PD）的發(fā)病過程。

1 哺乳動物腦中的polyP

因為哺乳動物組織中的polyP 濃度很低，因此定量分析其水平很有挑戰(zhàn)，從而限制了對它們的研究。Arthur Kornberg 是最先研究哺乳動物不同組織中polyP 水平的科學家［7］。根據(jù)他們的研究，兔腦組織中的polyP 水平最高為25～129 μmol/L，其次是肝組織為22～42 μmol/L［7］。雖然哺乳動物polyP 合成酶還未鑒定，但基于對完整的星形膠質細胞和分離的線粒體進行的研究表明polyP 水平與細胞的呼吸相關［8］，不管是干擾F1F0-ATP合成酶或膜電位，還是干擾電子傳遞鏈都會顯著降低線粒體和細胞質內的polyP水平［8］。

研究表明雖然兔肝組織polyP 總水平比較恒定，但腦組織polyP水平在一生中有顯著改變。研究發(fā)現(xiàn)polyP水平在12個月齡時達到峰值，然后在28個月齡時逐步下降到只有最高水平的50%左右［6］。目前仍不清楚polyP代謝酶的活性或水平是否以及如何在一生中被調節(jié)，以及是否還存在其它因素導致polyP 的減少。此外，關于腦中polyP在空間和/或細胞類型的分布情況，以及是否全部或部分區(qū)域存在polyP 減少的情況仍不清楚。另外，除了年齡會導致腦中polyP水平改變以外，某些生理條件似乎也改變了腦中的polyP水平。例如AD小鼠腦中的polyP水平比相同年齡的健康小鼠腦中的polyP水平顯著降低［9］。然而在另一項研究中發(fā)現(xiàn)PD 相關性突變會導致細胞內polyP 水平增加［10］。大多數(shù)類似PD 疾病表現(xiàn)出線粒體功能障礙［11］，這與polyP 水平與線粒體能源狀態(tài)相關的結果一致，或許是polyP水平改變的原因［10］。

哺乳動物細胞中的polyP 長度通常在50～800 個磷酸根，其長度與細胞類型和生理條件相關［7］。對哺乳動物腦中polyP 長度的研究結果并不一致，有研究認為腦細胞中主要是800個磷酸根的polyP［7］，然而有的研究發(fā)現(xiàn)polyP 鏈長在10～100 個磷酸根。導致這些差異可能的原因是實驗設備不同，或者是提取和定量哺乳動物細胞中不同長度polyP的實驗技術差異。

2 polyP 發(fā)揮淀粉樣蛋白形成過程中的細胞保護劑作用

淀粉樣蛋白纖維形成過程中的限速步驟是起始階段的成核步驟，即從單體肽或蛋白轉換成β 片層富集、具有成核傾向的構象。然后其它單體轉換成這種構象，最終形成纖維，沉積在細胞內或細胞外空間。大量研究表明在纖維形成過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物寡聚體和/或原纖維是導致神經(jīng)毒性的主要原因［12］，因為它們影響了線粒體的功能、膜的通透性和/或細胞骨架，或許這些作用導致了神經(jīng)炎癥反應和細胞死亡［13］。另外，淀粉樣蛋白寡聚體是在細胞中擴散的主要形式［14］，導致PD 疾病具有類似于朊病毒擴散的特征。不僅如此，有證據(jù)表明成熟的纖維也是有毒的，因為它們可以作為成核源催化新的淀粉樣蛋白纖維形成，也可以不斷的釋放有毒的寡聚體［15］。在脫落的過程中，成熟的纖維能夠分解，因此增加了自由寡聚體的數(shù)量和纖維末端，從而導致更多纖維的產(chǎn)生［15］（圖1A）。

對α-突觸核蛋白的研究表明polyP 的存在影響了上述所有過程。（1）polyP 加速了成核作用和纖維形成。在生理學濃度下的α-突觸核蛋白，在體外很長時間都不會形成纖維，但是在polyP 存在的情況下，幾天之內就會形成［9］。polyP 的這種作用與長度相關，長度越長越有效。這種加速作用減少了在纖維形成過程中毒性寡聚體的量（圖1B）。（2）在polyP存在情況下形成的α-突觸核蛋白纖維表型也顯著不同，無polyP 存在情況下形成的α-突觸核蛋白由兩個原絲螺旋纏繞在一起［16］，在polyP 存在情況下形成的纖維非常的薄，并且無相互纏繞結構［9］，這些結果表明它們具有更少的可能性催化之后的成核過程。（3）polyP 導致成熟的α-突觸核蛋白纖維更穩(wěn)定，即使在缺失polyP 情況下形成的纖維，polyP 也能阻止它們解聚（圖1B）。（4）相對于無polyP 存在時形成的纖維，polyP 結合的α-突觸核蛋白纖維對蛋白酶K 更敏感。而且，polyP 介導的α-突觸核蛋白纖維的形成，不僅僅是簡單的非特異性電荷相互作用，而是polyP的一個獨特功能，即使在復雜的細胞裂解物中仍然能發(fā)揮作用［7］。這些作用單獨或共同導致了polyP的細胞保護作用。

polyP 不僅對α-突觸核蛋白具有上所述作用，對其他的淀粉樣蛋白也有類似作用。與α-突觸核蛋白一樣，polyP 的存在加速了Aβ1-40和Aβ1-42兩個蛋白最初的成核反應和增加了纖維的延長期［17］，保護細胞不受Aβ1-40/42和Aβ25-35肽的神經(jīng)毒性作用［5］。比如，秀麗線蟲的AD 突變體通過攝取外源polyP 表現(xiàn)出對Aβ1-42誘導的麻痹作用延遲［9］。

人類tau 蛋白即使在高濃度條件下幾個月也不會形成纖維［18］，polyP 的存在促進了纖維的形成，把T1/2降低到兩天之內［9］。polyP 能夠增加tau 聚集的速率，可能涉及3 個方面的原因：（1）polyP 能夠與tau蛋白上的微管結合區(qū)和脯氨酸富集區(qū)結合，從而改變了tau 單體的構象；（2）polyP 屏蔽tau 結構域上的靜電相互作用，破壞了N 末端和微管結合區(qū)的長距離的靜電相互作用；（3）polyP 促進了tau單體分子間的結合。因此，polyP 通過與tau 分子內部的多個結合位點結合能夠作為分子內支架，同時通過與多個tau 分子的結合位點結合作為分子間的支架，最終促進了tau的聚集。

Figure 1.PolyP accelerates the formation of fibers and increases its stability.A：the natively unfolded amyloid mono?mers undergo structural rearrangement，resulting in the formation of β-sheet-rich oligomers and protofibrils.In addition，the cross-β-sheet fibers formed by assembly can dissociate into toxic oligomers in a process termed shedding.B：PolyP significantly accelerates the forma?tion of initial fibers，and increases the stability of fibil，thus reducing the formation of toxic oligomers.圖1 polyP加速纖維的形成并增加其穩(wěn)定性

在體內，polyP 促進淀粉樣蛋白形成和穩(wěn)定成熟纖維的作用具有廣泛性。這些結果表明polyP是高度保守的淀粉樣蛋白形成過程中的細胞保護劑［9］。polyP 水平的增加保護了神經(jīng)元。由于大腦中polyP的水平隨著年齡增加而下降［6］，polyP 水平的下降可能會導致老年個體更容易受到淀粉樣蛋白的細胞毒性作用。靶向淀粉樣蛋白相關蛋白折疊疾病的治療措施目前主要聚焦于穩(wěn)定非毒性早期中間體。然而，加速纖維的產(chǎn)生和穩(wěn)定形成的纖維減少了毒性寡聚體的聚集也能達到減緩毒性的目的。對polyP及其作用機制的進一步研究可以開發(fā)出新的干預措施以治療這些破壞性的淀粉樣蛋白相關疾病如AD和PD。

3 polyP 發(fā)揮淀粉樣蛋白形成過程中細胞保護劑的作用機制

polyP 對神經(jīng)變性疾病的神經(jīng)保護作用，可能加速淀粉樣蛋白的形成，減少了在纖維形成過程中的毒性寡聚體，改變形成的纖維形態(tài)，穩(wěn)定成熟的蛋白纖維結構等，從而減少淀粉樣蛋白的細胞毒性。然而，這些功能是通過什么機制實現(xiàn)的呢？本文討論以下可能的作用機制。

3.1 polyP 作為穩(wěn)定β 片層結構的支架 polyP 的結構是非常簡單的。這就產(chǎn)生了一個問題，polyP 是如何影響一系列看似不相關過程的，從細菌的壓力抗性和致病性，到哺乳動物骨的礦化、血液凝固和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號轉導，以及polyP 將解折疊蛋白穩(wěn)定為β片層富集的構象［19］。在生理pH值條件下，polyP上的每一個磷酸根都攜帶了一個負電荷，這使得polyP 是已知的負電荷密度最高的分子。因此，polyP 很可能通過靜電相互作用與蛋白結合。例如，polyP 與淀粉樣蛋白單體的正電荷區(qū)結合穩(wěn)定了淀粉樣蛋白的構象［20］。也有可能polyP 是通過靜電相互作用，穩(wěn)定了淀粉樣蛋白單體，使得它們更容易遭受構象的改變。

polyP 也可能與多肽的酰胺鍵主架結合，從而促進淀粉樣蛋白成為小纖維形成傾向的β 片層結構，從而促使淀粉樣蛋白轉換為β 片層富集的纖維并加速了淀粉樣蛋白的形成，表明polyP 發(fā)揮作用的統(tǒng)一機制是作為穩(wěn)定β 片層的支架［9］。這種機制解釋了為什么polyP 能結合到正電荷非常少的淀粉樣蛋白如CsgA 蛋白并導致構象的轉化；或者能夠穩(wěn)定完全無關的、僅具有α 螺旋的酶如熒光素酶和檸檬酸合酶形成β 片層結構構象［19］。此外，polyP 在參與血液凝固的纖維形成過程中可能也是基于其能夠將蛋白穩(wěn)定在β 片層樣構象的原因［21］。但是研究polyP 與多肽相互作用的精細特征仍具有很多挑戰(zhàn)，因為polyP 缺乏能被一般的光譜技術檢測的化學特征，以及很多polyP 結合的多肽要么是不穩(wěn)定的折疊中間體或淀粉樣蛋白形成纖維。

3.2 polyP 作為成核劑 判斷淀粉樣蛋白纖維是否形成的指標通常是能否檢查到硫磺素T（thioflavin T，ThT）熒光。ThT是一種小分子染料當插入到淀粉樣蛋白寡聚體和纖維中的β 片層后發(fā)光。淀粉樣蛋白纖維形成的ThT動力學能夠分成3個不同的階段：成核期（即延滯期），此階段可溶的單體遭受結構的改變和成核；延長期（即生長期），在此階段ThT 陽性寡聚體和原纖維形成；平衡期（即穩(wěn)定期），在此階段成熟纖維脫落和成核動態(tài)平衡。Cremers 等［17］的研究表明，低劑量的中等長度polyP 刺激了淀粉樣蛋白的成核和纖維的延伸，以及與成熟纖維的結合。計算結果表明，1 個淀粉樣蛋白單體能夠結合10～20 個磷酸根。幾個淀粉樣蛋白單體結合到任何一條pol?yP 都能有效增加淀粉樣蛋白的局部濃度，這使得polyP 成為一個有效的淀粉樣蛋白成核劑。因為纖維形成的限速步驟是解折疊或α 螺旋淀粉樣蛋白轉換為具有成核能力的β 片層構象，所以polyP 加速纖維形成的主要步驟是加速成核源的產(chǎn)生。這些結果與短的polyP（如polyP16）在促進纖維形成方面作用非常弱的結果一致，也解釋了為什么在淀粉樣蛋白低于生理濃度的情況下，更長的polyP 能夠作為成核源并促進纖維的形成。

polyP 促進纖維形成的動力學和最終纖維的產(chǎn)量與蛋白本身形成纖維的能力有關。比如polyP 對α-突觸核蛋白和tau40具有最強的促進作用，因為這兩個蛋白自身在長時間內（幾天到數(shù)月）才能夠形成纖維；相反，Aβ1-40/42在體外形成纖維非?？?，polyP 刺激它們形成纖維的能力相對較弱。

polyP 不能與α-突觸核蛋白單體相互作用，但一旦ThT 陽性寡聚體形成，polyP 能夠促進原纖維的形成，表明α-突觸核蛋白在沒有polyP 參與的情況下，就已經(jīng)發(fā)生了構象的改變和（或）寡聚化過程，產(chǎn)生寡聚體后polyP 才能促進后續(xù)的過程。這也意味著polyP 和α-突觸核蛋白單體僅僅是簡單地共存于細胞內外，polyP 的存在不能導致纖維的從頭形成［22］，不會誘導天然的蛋白單體形成纖維。

4 polyP發(fā)揮其它保護作用及機制

4.1 polyP 干擾α-突觸核蛋白與細胞膜的結合 有研究表明，α-突觸核蛋白進入細胞是由肝素聚糖受體介導的［23］，稱為微胞飲作用。Lempart 等［22］發(fā)現(xiàn)，polyP 與細胞外的α-突觸核蛋白結合降低了α-突觸核蛋白與細胞膜的結合，顯著性降低了進入細胞的α-突觸核蛋白纖維，可能解釋了polyP 對細胞的保護作用。這些結果表明，polyP 保護神經(jīng)元不受α-突觸核蛋白的毒性機制是通過其與細胞外的α-突觸核蛋白原纖維的特殊相互作用，從而有效阻止了它們與細胞膜的結合，并最終限制其進入神經(jīng)元。

Cremers等［17］發(fā)現(xiàn)，polyP的這種作用對于淀粉樣蛋白纖維是高度特異的，對α-突觸核蛋白單體的攝取不受影響。此外，短鏈polyP 在阻止纖維攝取上的作用相對于長鏈polyP 來說更弱。這些結果表明，polyP 與α-突觸核蛋白的直接相互作用，通過改變纖維的構象和/或負電荷結合的α-突觸核蛋白的豐度，阻止了α-突觸核蛋白纖維與細胞膜上負電荷脂質的相互作用，導致其從細胞膜上的解離［24］。α-突觸核蛋白淀粉樣纖維的毒性是由于它們能夠結合、傳入和損壞細胞膜，因此polyP 可能在阻止這些疾病的發(fā)生和（或）進展過程中起到非常重要的作用。

4.2 polyP 恢復Aβ 誘導的ATP 水平降低 通常，神經(jīng)元和膠質細胞消耗大量的ATP。而中樞神經(jīng)系統(tǒng)沒有有效的能源儲存系統(tǒng)，但又需要大量的ATP 供應保證維持能源需求［25］。進入細胞內的Aβ 通過與細胞內的識別位點密切接觸，導致了細胞器膜的損傷，如對線粒體呼吸鏈的損傷。在PC12 細胞中的研究發(fā)現(xiàn)Aβ 誘導了線粒體的功能障礙和糖酵解的損壞，導致ATP 的缺失［26］。Aβ25-35的存在導致神經(jīng)元中的ATP 水平減少50%以上。polyP 既可以存在于細胞內也可以存在于細胞外，并可以增加細胞內和細胞外的ATP 水平（見4.3 和4.4）。而且，細胞外的ATP 還能增加細胞內的ATP 供應［27］。由于polyP 導致細胞內ATP 水平升高，polyP 的存在可能逆轉了Aβ 導致的神經(jīng)元能源狀態(tài)受損，并且因此阻斷了Aβ25-35的神經(jīng)毒性作用［5］。

4.3 polyP 影響細胞內能源的產(chǎn)生 雖然polyP 作為原核生物的能源已得到確認，比如在細菌中一系列polyP 依賴性激酶能夠催化polyP 水解和能源利用［28］，但最近幾年才發(fā)現(xiàn)polyP 可能在哺乳動物中起到類似的作用，比如線粒體的NAD 激酶能夠利用polyP 和ATP［4］。通過表達外切聚磷酸酶（exopoly?phosphatase，PPX）消除細胞內的polyP，能顯著改變哺乳動物線粒體的功能，降低線粒體膜動勢，抑制呼吸鏈復合物I［29］。不僅如此，在分離的線粒體和完整細胞的線粒體中，polyP 的產(chǎn)生都能被F1F0-ATP 合成酶抑制劑寡霉素所抑制［10］，表明polyP 的產(chǎn)生與ATP 的產(chǎn)生是由相同的酶所催化。在正常的生理條件下polyP 影響線粒體的呼吸作用［29］，表明線粒體的能源產(chǎn)生系統(tǒng)和polyP 的合成系統(tǒng)之間存在相互作用，包括3 個方面：（1）polyP 作為高能聚合物，可能是不依賴跨膜質子動勢的ATP 來源，因此改變質子動勢將改變跨膜電流，通過影響ATP 合成酶活性和呼吸鏈，從而最終影響能量轉化為ATP 的效率；（2）因為polyP 是二價金屬離子的強螯合劑，polyP 可能改變線粒體Ca2+緩沖能力，從而影響了線粒體酶的活性；（3）高電荷的多聚陰離子可能直接與線粒體蛋白結合，導致其活性的調節(jié)，而且polyP是復合物IV（細胞色素C 氧化酶）的重要組分，能夠催化線粒體電子傳遞鏈的最后一步反應。

如果以Ca-polyP 納米顆粒形式將polyP 與細胞孵育，將改變線粒體的豐度和細胞內的ATP 水平［29］，線粒體的數(shù)量和豐度顯著增加。定量結果表明，在存在polyP 納米顆粒的情況下孵育3 d，細胞內的ATP 水平顯著增加，這些結果表明polyP 的攝取促進了線粒體ATP的產(chǎn)生［30］。

polyP 涉及線粒體的代謝和細胞能量的產(chǎn)生可以通過在神經(jīng)元和星形膠質細胞中的線粒體表達酵母PPX 得到證實［10］。在神經(jīng)元和星形膠質細胞中，通過阻止糖酵解和氧化磷酸化抑制ATP 的產(chǎn)生，同時導致線粒體polyP 的減少，并在更短的時間內誘導細胞的死亡［10］。在哺乳動物星形膠質細胞中的研究表明polyP 的聚集與線粒體代謝和呼吸相關，而且在polyP 的產(chǎn)生和細胞內能源代謝之間存在反饋機制，并起到相互調節(jié)的作用。

細胞內polyP 水平與焦磷酸肌醇之間的聯(lián)系進一步支持了polyP 調節(jié)能源代謝的觀點［31］。polyP 和焦磷酸肌醇在真核細胞中具有非常重要的功能［4］，焦磷酸肌醇可能調節(jié)polyP 的代謝，從而控制了細胞內磷酸根水平，最終影響線粒體ATP合成。

4.4 細胞外能源的產(chǎn)生 在體外，細胞與polyP 孵育會導致細胞內和細胞外的ADP/ATP 水平增加2～3倍［32］。如果添加ALP 抑制劑左旋咪唑和腺苷酸激酶（adenylate kinase，ADK）抑制劑Ap5A，ADP/ATP 水平不再增加［33］，表明這兩個酶參與polyP 介導ADP/ATP的產(chǎn)生。

ALP是二聚體復合物，發(fā)生反應時其中一個ALP亞基在polyP分子末端的P―O鍵之間裂解，形成偏磷酸中間產(chǎn)物，酶結合的偏磷酸中間產(chǎn)物親核攻擊AMP，產(chǎn)生一分子的ADP。同時，釋放了一個磷酸根的polyP 轉移到另一個ALP 分子上，并再一次裂解形成酶結合的偏磷酸中間體，然后將其轉移到新的AMP 分子上，并形成和釋放更多的ADP 分子。這個反應不斷的循環(huán)重復直至polyP分子完全降解為止。

ALP 反應與ADK 反應偶聯(lián)不斷產(chǎn)生ATP 分子。因為ALP 產(chǎn)生的ADP，隨后能夠作為ADK 的底物參與反應，從而將polyP 儲存的能量轉換為可以利用的ATP［32］。ADK 和ALP 都位于細胞外膜從而暴露于細胞外空間［32］，催化了AMP、ADP和ATP之間的可逆轉化。ALP和ADK協(xié)同作用催化產(chǎn)生的ATP存在于細胞外空間。在不同的ADK 亞型中，其中AK1β 被分泌到細胞外空間是最有可能涉及ALP-ADK 協(xié)同反應的亞型。這些結果表明ALP 介導polyP 裂解釋放的磷酸根轉移到AMP 上形成ADP，隨后在ADK 的作用下轉化為ATP。

polyP作為能源載體在細胞外空間傳遞能量。雖然細胞內的ATP 濃度很高，比如在神經(jīng)元的突觸小泡中的ATP濃度高達100 mmol/L，但細胞外空間只有10 nmol/L［34］。不僅如此，ATP 在細胞外空間的半衰期只有15 min，不能作為細胞外的能源。已知維持細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的結構需要消耗大量的能量。從細胞內釋放的ATP不能維持ECM的結構。ALP-ADK 的協(xié)同偶聯(lián)作用可以將polyP 轉化為ATP，保證了細胞外空間中ATP的需求。

細胞內能量傳輸?shù)臋C制和優(yōu)點已有廣泛的討論［35］。因為ATP 和其它能源攜帶的三磷酸核苷酸（nucleoside triphosphates，NTP）通過細胞質的擴散是有限的，因此在細胞外空間polyP 和膜結合的ALP和ADK 形成的能量產(chǎn)生系統(tǒng)，與ATP 消耗系統(tǒng)共同形成能源轉移或運輸系統(tǒng)。由于細胞的能量需求涉及多種微空間，這種模型保證NTP 的產(chǎn)生和消耗的位置很靠近，從而允許NTP 的產(chǎn)生到NTP 消耗的直接轉移［35］。由于ALP 是持續(xù)性水解，因此其能夠產(chǎn)生大量的能量，與ADK一起協(xié)同產(chǎn)生大量的ATP，隨后能被能源消耗過程所利用。這種系統(tǒng)的好處是：兩個反應的偶聯(lián)允許ATP 的產(chǎn)生能夠快速滿足需要ATP 的過程。在細胞內，磷酸根的轉移網(wǎng)絡甚至能夠偶聯(lián)空間上隔離的ATP產(chǎn)生和ATP消耗過程。

5 polyP發(fā)揮神經(jīng)信號轉導的功能

5.1 polyP 影響Aβ 誘導的mPTP 開放 線粒體的退化是AD 的早期癥狀之一，早于神經(jīng)纖維纏結出現(xiàn)之前［36］。Aβ 對分離的線粒體具有多種直接作用，包括導致酶學活性的改變、呼吸鏈的損傷和mPTP 的開放［37］。mPTP 的開放要么通過促進細胞色素C 的釋放導致細胞凋亡，要么通過能源缺失導致細胞壞死。很多的研究表明腦中的線粒體存在mPTP。mPTP 是非選擇性的，跨膜的高轉導性通道。mPTP 的開放是神經(jīng)變性疾病導致細胞死亡的重要原因之一［38］，阻止mPTP 的開放是阻止病理生理條件下細胞死亡的有效途徑。實驗表明mPTP 誘導的典型特征是膜電位的去極化和Ca2+的外流［39］。Aβ25-35通過Ca2+誘導的方式促進腦mPTP 的開放［40］。polyP 本身可以作為mPTP的組成成分，實驗表明polyP保護了細胞免受β淀粉樣蛋白的毒性，可能通過增加線粒體內的Ca2+容量和降低這些細胞對mPTP開放的敏感性［29］。

5.2 polyP 可構成離子通道 早期在細菌中的研究意外發(fā)現(xiàn)感受態(tài)細菌存在高濃度的跨膜復合物，由聚羥基丁酸（polyhydroxybutyrate，PHB）、中短長度的polyP 和Ca2+構成，形成由polyP-PHB-Ca2+復合物構成的通道［41］。這種通道的精確結構還不清楚，有人認為通過PHB 的作用，polyP 可以穿過脂質雙分子層，從而實現(xiàn)了二價陽離子的跨膜轉運［42］。這種通道能夠在重組的脂質雙分子層上重構其作為電壓門控離子通道的功能，在二價金屬離子如Ca2+和磷酸根轉運方面起到非常重要的作用［42］。細菌的polyP-PHBCa2+離子通道發(fā)現(xiàn)之后不久，類似的結構也在兔肝細胞的線粒體中發(fā)現(xiàn)［43］。純化的復合物能夠在脂質雙分子層上形成類似于mPTP?；谶@種特性，這種復合物可能是mPTP的離子轉導模塊。

5.3 polyP 發(fā)揮膠質遞質和神經(jīng)遞質的功能 大量的研究認識到神經(jīng)元和星形膠質細胞之間的相互關系，不僅僅是星形膠質細胞起到支持神經(jīng)元的功能，而且還積極調控神經(jīng)元［44］。神經(jīng)元和星形膠質細胞之間存在快速的雙向交流。比如，從神經(jīng)末端釋放的遞質刺激附近星形膠質細胞表面受體并觸發(fā)細胞內鈣離子升高［45］。另外，星形膠質細胞內鈣離子濃度的升高可能通過積極釋放膠質遞質（通常興奮性遞質谷氨酸）觸發(fā)對神經(jīng)元的反饋激活［46］。該調節(jié)過程可能作為生理功能控制神經(jīng)元興奮性和突觸傳遞。然而，在病理條件下，相同的機制對神經(jīng)元產(chǎn)生有害的影響。星形膠質細胞中谷氨酸釋放和星形膠質細胞-神經(jīng)元協(xié)調作用的改變會在特異性腦部疾病如AD中發(fā)生改變［47］。Aβ尤其是其寡聚體對谷氨酸受體具有高的親和性［48］，介導了重要介質如Ca2+的流出/流入的速率。AD 疾病過程中Aβ 介導這些受體，尤其是N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyle-D-aspartate，NMDA）受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）受體的失調損傷了突觸的可塑性，導致了突觸的退化［49］。目前已獲批的治療AD 疾病的藥物如美金剛（memantine）就是NMDA 的受體拮抗劑［50］。NMDA 受體拮抗劑減少了能夠導致興奮性中毒和導致細胞死亡的谷氨酸活性。polyP 調節(jié)AMPA 和NMDA 受體，并通過P2Y 受體保護神經(jīng)元細胞的谷氨酸興奮性中毒（如神經(jīng)變性疾病過程中導致神經(jīng)元損傷的最主要原因之一）［51］。而且，polyP作為膠質遞質和神經(jīng)遞質可能協(xié)調了星形膠質細胞―神經(jīng)元之間的關系，維持了神經(jīng)元和星形膠質細胞之間存在的雙向交流。

研究發(fā)現(xiàn)polyP能發(fā)揮膠質遞質的功能。在一般的細胞中polyP主要位于線粒體、細胞核和溶酶體［7］。而在星形膠質細胞中，polyP 大量存在于囊泡樣結構中，以Ca2+依賴方式通過胞吐作用分泌到細胞外。分泌的polyP隨后被其它星形膠質細胞或神經(jīng)元細胞攝取，從而起到膠質遞質和神經(jīng)遞質的作用［52］。作為膠質遞質，polyP介導了星形膠質細胞之間的通訊，通過與嘌呤型受體P2Y1 結合，導致磷脂酶C（phospholi?pase C，PLC）激活，從而催化PIP2產(chǎn)生IP3，誘導內質網(wǎng)中的Ca2+外流，導致細胞的去極化，以及polyP從星形膠質細胞中的進一步釋放，最終傳播了信號波［53］。這種活性與polyP的長度和在腦中的位置無關［52］。

研究發(fā)現(xiàn)polyP 能發(fā)揮神經(jīng)遞質的功能。作為神經(jīng)遞質，polyP 通過差異性調節(jié)神經(jīng)元的電壓依賴性離子通道，在外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中誘導了動作電位［54］。Stotz 等［54］發(fā)現(xiàn)，polyP 直接影響了神經(jīng)元的活性，通過改變電壓門控Na+通道對神經(jīng)元靜息膜電位的電壓敏感性，阻斷電壓門控K+通道和激活電壓門控Ca2+通道，誘導了外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)的動作電位的產(chǎn)生。另外，polyP 刺激了神經(jīng)元網(wǎng)絡的活性和誘導了膠質細胞中的Ca2+離子流。polyP 存在于突觸體，通過添加氯化鉀導致細胞膜去極化會導致polyP 的釋放［54］。polyP 通過改變局部的表面電荷從而影響神經(jīng)元離子通道門控性質。長鏈polyP是高度負電荷分子，能夠增加通道周圍負電荷密度。因此，polyP 可能產(chǎn)生一個促進Na+通道和Ca2+通道活性環(huán)境，而K+通道能夠被polyP 直接抑制。polyP 同時調節(jié)多種通道活性的事實表明polyP 的作用是導致通道靜電環(huán)境的改變，而不是結合到特定位點起作用。polyP 對神經(jīng)元離子通道的作用促進動作電位的產(chǎn)生，當過量polyP 釋放可能導致興奮過度如癲癇病。這些結果表明polyP 可能作為神經(jīng)遞質，以及外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)內源性神經(jīng)調質在生理條件下發(fā)揮作用［55］。由于星形膠質細胞和神經(jīng)元之間的相互作用涉及神經(jīng)變性疾病，polyP 信號轉導的改變可能與中樞神經(jīng)疾病的致病機制相關。

此外，Aβ誘導的星形膠質細胞中的Ca2+信號，最終導致了神經(jīng)元的死亡［56］。Aβ1-40/42以及不同的短鏈形式Aβ25-35、Aβ25-40或Aβ1-28都能夠誘導星形膠質細胞內的Ca2+濃度的改變，這與任何受體或通道的活性無關［56］，而是Aβ整合到細胞膜形成孔的原因［57］。Aβ能夠形成孔并刺激鈣信號，新的發(fā)現(xiàn)表明僅僅一個寡聚體Aβ1-42分子能夠刺激星形膠質細胞的Ca2+內流［58］。polyP 的水平影響了線粒體處理Ca2+的能力，減少了Aβ誘導的依賴Ca2+導致的神經(jīng)元細胞的死亡［29］。

6 polyP作為潛在藥物的可能機制

如前所述，polyP 能對抗淀粉樣蛋白細胞毒性，對神經(jīng)細胞有保護作用，因此polyP 具有作為神經(jīng)變性疾病的潛在藥物的可能。下面我們討論polyP 的一些生物學特性，而這些特性保證其作為潛在藥物發(fā)揮作用的可能機制或理論依據(jù)。

6.1 polyP 釋放到細胞外空間 在生理條件下，細胞能夠分泌polyP 并參與神經(jīng)系統(tǒng)的信號轉導。哺乳動物細胞中的polyP 是以聚合物的形式釋放。激活的人類血小板釋放的polyP 長度在60～100 個磷酸根長度，可能涉及調節(jié)止血的復雜過程。動力學研究表明血小板的polyP 的釋放/分泌遵循時間效應類似于血小板密度顆粒分泌ATP、ADP 和血清素［59］。有趣的是，polyP 能夠在星形膠質細胞中形成并作為膠質遞質，在星形膠質細胞之間建立通訊網(wǎng)絡［52］。從這些細胞釋放的polyP 以Ca2+依賴方式，并與鄰近的星形膠質細胞通過P2Y1 嘌呤受體相互作用，激活磷脂酶C，導致Ca2+離子從細胞儲存庫中釋放。polyP在這些神經(jīng)元網(wǎng)絡中的信號轉導作用能夠被神經(jīng)元感應。polyP 的這些特征表明外源添加的polyP 能夠發(fā)揮類似的功能。

6.2 polyP在細胞外空間的轉運 polyP作為藥物使用，要考慮其在細胞外空間的轉運問題。細胞外空間由液體和細胞外基質構成。細胞外基質的結構和組成能夠影響細胞外空間的polyP或polyP顆粒的轉運、穩(wěn)定性和降解。細胞外基質中的帶電纖維、膠原，以及蛋白聚糖和葡糖氨基聚糖等可能能通過靜電相互作用與多聚陰離子polyP或polyP顆粒相互作用，這可能促進或影響了細胞外空間的polyP的轉運和分布。

6.2.1 通過細胞外基質進行轉運 細胞外的polyP轉運可能是通過游離的polyP 或polyP 顆粒，或者細胞外小泡進行轉運［60］。如果是通過游離的polyP 或polyP顆粒進行轉運，polyP的轉運可能通過以下幾種方式進行：（1）自由擴散（濃度梯度相關）；（2）阻礙擴散（短暫的結合或固定在細胞外基質上的某種分子上）；（3）促進擴散（與促進擴散的細胞外基質中的組分相互作用）。如同在細胞內一樣，細胞外具有較高的黏度和一定的物理性質，并不是理想的溶液環(huán)境，因此會影響各種分子的擴散甚至是小分子的擴散。尤其是大分子如polyP 和polyP 顆粒的擴散還受空間限制或細胞外基質的某種組分的影響。一般來說，顆粒在細胞外基質中的運動受布朗運動的影響。分子在細胞外基質的運動與其中纖維的濃度成負相關，還受細胞外基質帶電成分靜電相互作用的影響。

根據(jù)Stylianopoulos 等提出的模型，靜電相互作用對細胞外基質中納米顆粒擴散的影響只有在顆粒的直徑與Debye 長度（溶液中帶電顆粒的靜電相互作用的測量單位）相當時才會顯著。因此，對于負電荷分子（如葡糖氨基聚糖）來說，大小在幾個納米左右靜電相互作就有效，而對于正電荷分子（如膠原纖維）來說幾個微米靜電相互作用都不明顯。而中性納米顆粒可能比負電荷顆粒擴散更快。因此，polyP顆粒通過細胞外基質進行擴散可以通過改變顆粒的ζ電位進行調節(jié)［61］。

6.2.2 基于細胞的轉運 細胞外空間中polyP 的最常見的轉運方式可能是以血小板顆粒的形式發(fā)生［62］。最近發(fā)現(xiàn)polyP也存在于外泌體（exosome）中。外泌體是細胞外的小泡，大小在30～100 nm，作為細胞與細胞之間通訊的媒介受到越來越多的關注［63］。

6.2.3 受體介導的對polyP 的胞吞作用 真核細胞通過受體介導的胞吞作用（也叫網(wǎng)格蛋白依賴性胞吞作用）從細胞外環(huán)境攝取大分子（包括生長因子、細胞因子、激素以及低密度脂蛋白顆粒）進入細胞內降解或成為細胞內的信號分子［64］。在骨細胞、骨髓細胞、神經(jīng)元甚至是血小板中的polyP 受體介導的胞吞作用的轉運機制已得到鑒定。血小板分泌的pol?yP是完整的聚合物，然后被附近的細胞攝取。然而，對于受體介導的胞吞作用，被攝取的分子必需與結合到細胞表面的受體接觸，隨后允許這個復合物被網(wǎng)格蛋白覆蓋的凹陷吞入細胞內。隨后，膜結合的受體與其配體進入內吞體，酸化并進入溶酶體，在這里復合物可能被降解。在受體介導的胞吞作用中除了分解代謝功能外，內吞的配體可能通過激活NFκB效應途徑導致基因的激活。

按照這個假設polyP 能夠通過受體介導的胞吞作用進入細胞，意味著polyP 會與配體結合。有證據(jù)證明polyP 能夠廣泛和特異地與不同蛋白相互作用。Vandegrift 等［65］證明polyP 能夠結合到血清中的很多蛋白。細菌來源的一些酶能夠強烈與polyP 結合［66］。相互作用的強度與溶液中的pH值、離子強度和polyP的長度相關。

6.3 polyP發(fā)揮功能的形式 polyP是以什么樣的形式發(fā)揮功能，這對于藥物的開發(fā)具有重要的意義。在最近十幾年時間里，polyP 在哺乳動物細胞中的功能開始被認識。涉及各種信號通路（如ERK1/2）、轉錄因子（Fra-1 和Runx2）和磷轉運體（PiT1 和PiT2）已經(jīng)找到。然而，關于哺乳動物細胞polyP 的感應機制知之甚少。推測細胞外的polyP 被ALP 水解為磷酸根后發(fā)揮功能。然而，細胞外空間中自由磷的濃度是受到嚴格控制，通常為10 mmol/L 左右。而polyP 對細胞的調節(jié)作用只需要非常低的濃度，如激活成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）信號轉導途徑，誘導間質干細胞的分化只需要1 mmol/L［67］，或在體外對骨的礦化只需要是1 μmol/L。基于這些結果，細胞外添加的polyP 發(fā)揮功能應該是以完整的polyP形式而不是水解產(chǎn)生的磷酸根影響細胞內的途徑。已知細胞對大分子（如蛋白和DNA）的攝取是受到阻礙的。因此，已開發(fā)出納米顆粒以促進這些分子進入細胞，顆粒的最佳直徑在60 nm左右［68］。

6.4 polyP納米顆粒 為了模擬polyP攝取的生理學過程，通過調節(jié)polyP 和CaCl2的比例合成polyP 的納米顆粒［69］。在缺失Ca2+的情況下，Na-polyP 形成無規(guī)則的錐形大沉淀。將CaCl2以1∶1加入polyP中形成大小在2 μm左右的圓形顆粒。將CaCl2濃度增加到2∶1更容易形成約200 nm大小的顆粒。進一步添加聚乙二醇［poly（ethylene glycol），PEG］到Na-PolyP和CaCl2中，形成大小在100 nm 大小的納米顆粒［70］。而對于受體介導的胞吞作用，直徑小于200 nm效果更佳［71］。

相比于可溶的Na-polyP，包埋進納米顆粒中的polyP 展示了更強的生物學作用［8］，這些發(fā)現(xiàn)表明polyP 以100 nm 左右大小顆粒攝取進入細胞將更為有效。為了證明polyP 的攝取是以受體介導的胞吞作用，用網(wǎng)格蛋白介導的胞吞作用抑制劑三氟丙嗪進行的抑制研究表明納米顆粒的生物學作用被阻止了70%，表明這些顆粒是通過胞吞作用進入細胞［70］。

7 結語及展望

雖然已經(jīng)證明polyP 可作為淀粉樣蛋白形成過程中的調節(jié)劑，并保護細胞不受淀粉樣蛋白的毒性，但是仍然不清楚這些保護作用對神經(jīng)變性疾病能起到多大的作用。然而，年齡是神經(jīng)變性疾病最大風險的事實，而polyP 水平隨年齡逐漸下降，讓我們合理的推測polyP在神經(jīng)變性疾病中的潛在作用。

或許polyP 通過直接調節(jié)淀粉樣蛋白纖維形成、脫落和成核作用保護細胞不受淀粉樣蛋白的毒性［9］。polyP存在于細胞外空間可能阻止淀粉樣蛋白纖維進入細胞和阻止在細胞間的傳播，因此減少其毒性和阻止了疾病的擴散。另外，polyP 可能將成熟的纖維隔離在惰性的空間內和/或增加淀粉樣蛋白在細胞內的轉歸，因此降低了毒性寡聚體的濃度。除此之外，polyP保護細胞不受淀粉樣蛋白的毒性可能通過其能源平衡的能力和/或線粒體功能［8］。眾所周知腦組織能源平衡受損是AD的特征之一［5］，PD同樣顯示出線粒體功能障礙和信號轉換的改變。年齡和（或）疾病導致的polyP 水平改變可能使得細胞對線粒體功能障礙更敏感，組織和器官更易于遭受神經(jīng)變性損傷。由于polyP 已廣泛作為食品添加劑和化妝品，其作為臨床應用應該比較安全。因此，未來將會有更多的研究聚焦于polyP 在神經(jīng)變性疾病發(fā)育中的作用，以及恢復polyP水平是否會延遲疾病的開始或進展。