UHPLC-MS/MS 法檢測中成藥及保健食品中非法添加文拉法辛的研究

王超眾 王萌萌 劉信奎 張連成 于百青 楊敏 孫偉 初紅濤

抑郁癥是精神類疾病的一種,抑郁癥患者主要表現(xiàn)出心境障礙、情緒低落、思維遲緩,病情嚴重時還會合并厭世、自殘等消極行為,患者自身安全也受到威脅［1-6］。文拉法辛是一線抗抑郁藥之一,也是第一個去甲腎上腺素、5-羥色胺再攝取雙重抑制劑類抗抑郁藥物,可用于治療各型抑郁癥［7-10］。近年,有非法商家向所謂抗抑郁癥類“純中藥”及“保健食品”中非法添加文拉法辛的現(xiàn)象,由于在處方中未標明含有文拉法辛藥物成分,因此容易令患者忽視并大量長期服用,存在較大的安全隱患,有必要建立方法并對這些樣品進行檢驗［11］。為整頓市場亂象、打擊不法份子,本文建立測定非法添加文拉法辛的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,該方法簡便、準確、靈敏度高,可為中成藥及保健食品中非法添加文拉法辛檢測提供技術依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Vanquish H 型高效液相色譜儀,Xcalibur 3.0.63 工作站(美國Thermo 公司)；Thermo TSQ Quantum Access 型質(zhì)譜儀,Chromeleon 7.2.10 工作站(美國Thermo 公司)；Sartorius BP211D 型電子天平(德國Sartorius 公司)；Rotina 380R 型高速冷凍離心機(美國Hettich 公司)；KQ-500VDV 型臺式三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功率為500 W,頻率為45 kHz)。

1.2 試藥 鹽酸文拉法辛對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號100543-202003,含量100.0%)；實測樣品來自于市場抽檢；乙腈、甲酸和乙酸銨均為色譜純,購自美國Fisher 試劑公司；水為超純水,其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACES C18(150 mm×2.1 mm 1.7 μm)色譜柱；流動相：0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸銨(A),乙腈(B),梯度洗脫(0～2 min 時90%A,2～2.1 min時65%A,2.1～4 min 時65%A,4～4.1 min 時60%A,4.1～6.5 min 時60%A,6.5～7 min 時20%A,7～9 min 時20%A,9～9.1 min 時10%A,9.1～15 min 時10%A)；流 速：0.3 ml/min；進樣量：2 μl；柱溫：40℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧正離子模式(ESI+)；檢測方式：選擇反應監(jiān)測(SRM)；霧化氣：N2；鞘氣流速：30 bar；輔助氣流速：10 bar；源電壓：4000V(+)、3500V(-)；毛細管溫度：270℃；定性離子對、定量離子、碰撞能量和離子化模式。見表1。

表1 文拉法辛的主要質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液配制 對照品溶液：取鹽酸文拉法辛對照品適量,精密稱定,用甲醇超聲處理,制成含文拉法辛濃度為100 μg/ml 的對照品貯備液溶液。精密量取上述溶液,用初始流動相稀釋成濃度為500 ng/ml 的對照品溶液。供試品溶液：精密稱取樣品1 g,置50 ml 量瓶中,加甲醇適量,超聲提取15 min,放冷至室溫,用甲醇定容至刻度(若樣品中含有油脂,則將樣品提取液在-20℃條件下放置24～48 h,時間可視樣品是否澄清而定),5000 r/min 離心5 min,上清液經(jīng)微孔濾膜過濾(0.22 μm),取續(xù)濾液作為供試品溶液。

空白溶液：除不加樣品外,配制過程與供試品溶液相同。取上述3 種溶液,按照“2.1”項下的色譜-質(zhì)譜條件進樣分析,記錄反應監(jiān)測(SRM)色譜圖。見圖1。

圖1 A 對照品溶液 B 供試品溶液 C 空白溶液的SRM 色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察精密量取對照品貯備溶液適量,用初試流動相稀釋成濃度為50、100、200、500、1000、1500、2000 ng/ml 的對照品系列溶液,按照“2.1”項下的色譜-質(zhì)譜條件進樣分析,記錄SRM 色譜圖,以濃度(X,ng/ml)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,曲線方程為Y=4.336X+0.2561,r=0.9998,結果見表2,由結果可知,文拉法辛在50～2000 ng/ml 的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

表2 文拉法辛回歸方程、相關系數(shù)、檢測限、定量限結果

2.3.2 檢測限和定量限考察 將“2.3.1”項下的最低濃度溶液用初始流動相繼續(xù)稀釋,進樣2 μl,記錄SRM色譜圖,以信噪比(S/N)=3 為指標確定檢測限,以信噪比(S/N)=10 為指標確定定量限,結果見表2,可見方法的靈敏度完全能夠滿足非法添加化學藥物的檢測要求。

2.3.3 精密度試驗 取對照品溶液,按照“2.1”項下的色譜-質(zhì)譜條件,連續(xù)進樣6 次,記錄SRM 色譜圖,計算文拉法辛的定量離子對質(zhì)譜峰面積的RSD,結果為0.85%,說明該方法的精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取陰性樣品,加入適量對照品儲備液,混勻,按“2.2”項下供試品的制備方法制備并測定,重復操作6 次,計算文拉法辛含量的RSD 值為1.59%,表明該方法重復性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.4”項下供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12 后進樣分析,記錄定量離子對SRM 色譜圖,計算文拉法辛峰面積RSD 值,結果為2.86%,表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取陰性樣品1 g,分別置6 個50 ml 量瓶中,分別精密加入對照品儲備溶液0.25 ml,加甲醇適量,超聲提取15 min,放冷至室溫,用甲醇定容至刻度(若樣品中含有油脂,則將樣品提取液在-20℃條件下放置24～48 h,時間可視樣品是否澄清而定),5000 r/min 離心5 min,上清液經(jīng)微孔濾膜過濾(0.22 μm),取續(xù)濾液進樣分析,文拉法辛的回收率及RSD 值結果見表3,由結果可看出該方法測量準確度良好。

表3 加樣回收試驗結果(n=6)

2.3.7 樣品測定 從市場收集聲稱有抗抑郁作用的中成藥及保健食品樣品共10 批,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,外標法計算非法添加藥品含量,經(jīng)測定,10 批樣品中均未檢出非法添加文拉法辛化學成分。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀中,流動相通常使用乙腈作為有機相,為了增加離子化效率通常在流動相中添加一定濃度的甲酸、甲酸銨或乙酸銨等。本試驗考察了乙腈和0.1%甲酸、20 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸、10 mol/L 甲酸銨溶液和 10 mmol/L乙酸銨溶液、0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸銨溶液等。結果采用乙腈和0.1%甲酸-10 mmol/L 乙酸銨溶液作為正模式流動相,文拉法辛靈敏度更高,故采用為本文方法。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 取濃度為500 ng/ml 的文拉法辛對照品溶液用于質(zhì)譜條件優(yōu)化。本實驗采用ESI 進行離子化,分別用正離子模式和負離子模式進行全掃描,結果均在 ESI+模式下文拉法辛響應更好,故本方法采用正離子模式進行檢測。在ESI+模式下進行母離子掃描,掃描范圍為m/z 100～500,得到［M+H］+峰［278.2］+,并適當調(diào)節(jié)相應的毛細管電壓,使得母離子一級掃描時相應最高。確定母離子及其毛細管電壓,繼續(xù)進行子離子掃描,以得到最佳的二級質(zhì)譜條件,最終將優(yōu)化后得到的定量定性離子對、碰撞能量作為文拉法辛的SRM 掃描參數(shù)。