游豐鋒 楊光勇 涂小華 何亞敏 喻良錦 李雨彤 李 燦 田維毅 何光志
潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)多累及遠(yuǎn)端結(jié)腸,亦可遍及全部結(jié)腸[1]。腸黏膜屏障損傷及由此造成的腸壁通透性增高是UC 發(fā)病的始動(dòng)因素和病情進(jìn)展的核心環(huán)節(jié)[2],腸道微生物群—宿主之間的相互作用被破壞等因素與UC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。腸道益生菌是組成腸道黏膜屏障的重要部分,而腸道菌群失調(diào)與免疫功能異常則直接影響UC 的演變[6]。丙酸為嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila,A.muciniphila)代謝產(chǎn)物之一,具有免疫調(diào)節(jié)作用,并能將黏蛋白進(jìn)行分解和再促合成,從而維持腸道黏膜屏障穩(wěn)定。本研究通過(guò)腸桿菌基因間重復(fù)共有序列(ERIC)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和半定量PCR 技術(shù)分析保和丸對(duì)UC 模型小鼠腸道菌群多樣性和A.muciniphila 菌的含量變化,并通過(guò)觀察腸道組織病理切片從形態(tài)學(xué)改變分析腸黏膜屏障損傷和炎癥預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。
1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)6 周齡KM 小鼠40 只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0014。小鼠以小組單籠喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水,環(huán)境:濕度60%、溫度25°C、12h/12h 的光照/黑暗周期。所有實(shí)驗(yàn)操作符合3R 原則(減少、替代、優(yōu)化)給予人道關(guān)懷。本研究通過(guò)貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核。
1.2 試劑與藥品 右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium,DSS,Sigma-Aldrich 公司,批號(hào)H02J9 B62777);保和丸(北京同仁堂,批號(hào)18081639);美沙拉嗪(莎爾福公司,注冊(cè)證號(hào)H20171358,批號(hào)17G27518L);糞便基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,批號(hào)S8114];快捷型瓊脂糖DNA 回收試劑盒Ⅱ型(北京百泰克生物公司,批號(hào)20170214);2×Taq PCR MasterMix(批號(hào)R6801)。
2.1 藥物制備及給藥 參考徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7],按體表面積計(jì)算劑量,配制成濃度為6.5mg/mL 的美沙拉嗪藥液,按0.1mL/10g 鼠重給藥體積灌胃給藥,每次0.2mL,1 天3 次;制備保和丸水溶劑,配制成濃度為78mg/mL 藥液,按0.1mL/10g鼠重灌胃給藥體積,每次0.2mL,1 天2 次。取0.3g DSS 溶于少量蒸餾水后再稀釋至10mL,即為3%DSS 溶液。
2.2 分組及UC 模型制備 40 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、美沙拉嗪組(0.065g/kg,3 次/天)和保和丸組(0.78g/kg,2 次/天),每組10 只。空白對(duì)照組給予蒸餾水,參考文獻(xiàn)[8-10]誘發(fā)小鼠UC 模型方法,用DSS 誘導(dǎo)制備UC 小鼠模型,除空白對(duì)照組外,其余各組采用灌胃3% DSS 溶液連續(xù)7天,誘導(dǎo)UC 模型,第8 天開(kāi)始全部換成蒸餾水。造模成功后第1 天開(kāi)始灌胃給藥,空白對(duì)照組與模型組給予等體積的蒸餾水,其余各組按上述劑量給予相應(yīng)的藥物,連續(xù)給藥7 天。
2.3 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分 自造模之日起,每天觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食、飲水和活動(dòng)度等一般情況,定時(shí)稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量,觀察糞便情況及便血狀態(tài),參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行DAI 評(píng)分。評(píng)分依據(jù)為黏著在肛門(mén)的水樣便為稀便,不黏著于肛門(mén)的糊狀大便為半稀便,成型的糞便為正常便。計(jì)算方法為DAI=(體質(zhì)量+大便性狀分?jǐn)?shù)+隱血分?jǐn)?shù))/3。
2.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)前期研究[12],設(shè)計(jì)引物序列:ERIC-1:5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3',ERIC-2:5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3';根據(jù)秦倩倩等[13]報(bào)道,合成A.muciniphila 細(xì)菌基因特異性引物,上游引物:5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3',下游引物:5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3',基因全長(zhǎng):329bp;由上海生工生物工程有限公司合成。
2.5 各組糞便樣品基因組模板制備 DNA 實(shí)驗(yàn)第18 天,收集小鼠新鮮糞便樣本,按糞便基因組DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行操作,提取基因組DNA,用核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定提取的DNA 模板的純度及濃度,確保DNA 純度A260/A280nm 比值在1.6~1.8,濃度在200ng/μL 左右,均置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.6 ERIC-PCR 反應(yīng)體系為:DNA 模板2μL,10μmol/L 上、下游引物各0.5μL,2×Taq PCR Master-Mix[0.1U Taq Polymerase/μL,500μmol dNTP each,20mmol Tris-HCl(pH 值為8.3),100mmol KCl,3mmol MgCl2]12.5μL,ddH2O 補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性7min;95℃變性30s,46℃退火90s,72℃延伸3min,共35 個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。
2.7 A.muciniphila 菌半定量PCR 反應(yīng)體系 反應(yīng)采用20μL 體系:模板2μL,10μmoL/L 上下游引物各0.3μL,2×Taq PCR MasterMix 10μL,去離子水補(bǔ)充體系至20μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min;95℃變性30s,60℃退火40s,72℃延伸30s,39 個(gè)循環(huán),65℃延伸10min。
2.8 條帶克隆測(cè)序與序列分析 選取A.muciniphila菌半定量PCR 產(chǎn)物目的條帶,按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收DNA。收集菌體送上海生工生物有限公司測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中已登錄的細(xì)菌DNA 序列用BLAST 軟件進(jìn)行比對(duì)分析。
2.9 結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第18 天摘取結(jié)腸組織,挑選有潰瘍的結(jié)腸組織置于10%甲醛溶液中放置24h 以上,將組織修正大小為1.0cm×1.0cm×0.2cm,放入包埋盒沖洗12h,瀝干水后,分別置于100、95、90、85、80、70%乙醇1h;二甲苯1、二甲苯2,各30min;置于左右蠟缸各1h,冰凍后置于切片機(jī),組織切到5μm 厚,進(jìn)行展片、鋪片,將裝有結(jié)腸組織的載玻片放入烘干箱12h,按照切片盒步驟依次對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行HE 染色,觀察切片結(jié)果。
2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用單因素方差分析比較,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 各組小鼠DAI 評(píng)分比較 造模成功后模型組、美沙拉嗪組及保和丸組小鼠均出現(xiàn)精神呆滯、行動(dòng)緩慢、便血、體質(zhì)量下降,而空白對(duì)照組小鼠精神、活動(dòng)度、飲食、毛發(fā)、大便、體質(zhì)量等一般情況均為正常。藥物干預(yù)前,各實(shí)驗(yàn)組小鼠DAI 評(píng)分顯著高于空白對(duì)照組(P均<0.01);藥物干預(yù)后,美沙拉嗪組及保和丸組小鼠DAI 評(píng)分顯著低于本組干預(yù)前(P均<0.01)和同期模型組(P<0.05),美沙拉嗪組與保和丸組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。
3.2 ERIC-PCR 檢測(cè)腸道菌群的多樣性 與空白對(duì)照組比較,模型組條帶數(shù)量未明顯減少,說(shuō)明腸道菌群的多樣性無(wú)明顯變化,但條帶位置變化較明顯,說(shuō)明菌群紊亂,腸道菌群豐度減少。保和丸組與美沙拉嗪組條帶數(shù)量明顯減少,提示菌群基因組DNA 含量明顯減少,腸道菌群多樣性抑制。見(jiàn)圖1。
3.3 半定量PCR 檢測(cè)A.muciniphila 菌 與空白對(duì)照組比較,模型組條帶稍明顯,提示A.muciniphila 菌群豐度有所升高,美沙拉嗪組稍暗,提示菌群豐度有所降低,保和丸組亮度明顯升高,提示菌群豐度明顯升高。見(jiàn)圖2。
表1 各組小鼠DAI 評(píng)分比較(分,)
表1 各組小鼠DAI 評(píng)分比較(分,)
注:空白對(duì)照組為正常小鼠給予生理鹽水;模型組為UC 模型小鼠給予生理鹽水;美沙拉嗪組為UC 模型小鼠給予0.065mg/kg,3 次/天美沙拉嗪混懸液;保和丸組為UC 模型小鼠給予0.78mg/kg,2 次/天保和丸混懸液;DAI 為疾病活動(dòng)指數(shù);UC 為潰瘍性結(jié)腸炎;與空白對(duì)照組同期比較,aP<0.01;與本組干預(yù)前比較,bP<0.01,與模型組同期比較,cP<0.05;與本組干預(yù)后3 天比較,dP<0.01
圖1 ERIC-PCR 擴(kuò)增結(jié)果
圖2 A.muciniphila 菌半定量PCR 結(jié)果
3.4 條帶克隆測(cè)序與序列分析 克隆測(cè)序結(jié)果顯示,與GenBank 中已登錄的細(xì)菌DNA 序列(NR_042817.1)用BLAST 軟件進(jìn)行比對(duì)分析結(jié)果一致,屬于Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 strain Muc 16S ribosomal RNA,partial sequence,基因全長(zhǎng)329bp。見(jiàn)圖3。
圖3 目的基因片段測(cè)序核酸堿基序列
3.5 各組小鼠結(jié)腸組織病理改變 空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織基本未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象,黏膜層肌層完好,未見(jiàn)潰瘍形成,隱窩和腺體等組織結(jié)構(gòu)完整,排列規(guī)則(見(jiàn)圖4A);模型組小鼠病理組織切片顯示,膜層肌層變薄,見(jiàn)明顯潰瘍形成,組織結(jié)構(gòu)被破壞,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖4B);與模型組比較,藥物干預(yù)后,美沙拉嗪組(見(jiàn)圖4C)和保和丸組(見(jiàn)圖4D)小鼠結(jié)腸組織黏膜損傷恢復(fù)較好,炎性細(xì)胞數(shù)量和浸潤(rùn)深度減少。
圖4 各組小鼠結(jié)腸組織病理改變(HE ×200)
研究顯示,用3% DSS 溶液灌胃造模的小鼠腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬減少,而大腸桿菌、腸球菌和小梭菌菌群等條件致病菌數(shù)量顯著增加[14],即UC 小鼠腸道菌群正常結(jié)構(gòu)失衡,導(dǎo)致機(jī)體腸道的炎癥產(chǎn)生。本研究小鼠DAI 評(píng)分結(jié)果顯示,用3% DSS 溶液給小鼠連續(xù)灌胃7 天可以有效的導(dǎo)致UC 的產(chǎn)生。美沙拉嗪組及保和丸組在治療3、7 天后均有所改善且小鼠各項(xiàng)身體指標(biāo)恢復(fù)情況相似,模型組雖未治療,但小鼠也有一定的自愈。造模后的小鼠與空白對(duì)照組相比,腸道菌群分布及多樣性都有明顯改變,每只小鼠個(gè)體略有差異但每組總體變化相同,其中服用保和丸與服用美沙拉嗪對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性均可產(chǎn)生一定的影響。
A.muciniphila 菌在腸道的外黏液層中定植,其分解黏蛋白并刺激杯狀細(xì)胞合成黏蛋白達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,從而維持黏液層的穩(wěn)定[13]。相關(guān)研究表明,在治療難治性慢性活動(dòng)性UC 時(shí),含有高豐富度的A.muciniphila 糞便樣本似乎有利于進(jìn)行糞便菌群移植療法[15]。本研究克隆測(cè)序結(jié)果顯示,目的基因檢測(cè)正確,結(jié)合半定量PCR 結(jié)果可以看出,保和丸組A.muciniphila 菌群豐度明顯升高,提示保和丸對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC 模型小鼠腸道A.muciniphila 菌有明顯促進(jìn)增殖的作用。
藥理研究表明,保和丸主要有助消化、調(diào)節(jié)腸胃功能、抗?jié)兒鸵志淖饔肹16],能促進(jìn)雙歧桿菌目菌群數(shù)量[17],還可促進(jìn)梭菌目、脫硫弧菌目、產(chǎn)氫細(xì)菌目菌群數(shù)量,同時(shí)減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢肝菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數(shù)量[18]。說(shuō)明保和丸有一定選擇性抑菌作用,但其對(duì)UC 菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不明確。
腸道菌群參與固有免疫和適應(yīng)性免疫,黏膜上皮組織的屏障作用是黏膜局部固有免疫的重要機(jī)制,如腸上皮細(xì)胞損傷可致使腸道內(nèi)大量抗原與腸道免疫細(xì)胞接觸并使之激活,產(chǎn)生大量炎性因子,造成腸道組織損傷[19]。從本研究各組小鼠結(jié)腸組織病理改變可以看出,除空白對(duì)照組外,其他組小鼠結(jié)腸組織都有潰瘍,且腸黏膜損傷程度不同。與模型組相比,保和丸組與美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸黏膜損傷恢復(fù)較好,炎性細(xì)胞數(shù)量和浸潤(rùn)深度減少。提示保和丸與美沙拉嗪能修復(fù)DSS 誘導(dǎo)的腸道黏膜損傷,控制炎癥的發(fā)生發(fā)展,保護(hù)腸道??傊?,本研究結(jié)果顯示,保和丸具有一定的促進(jìn)腸黏膜屏障損傷修復(fù)的作用。