豬GV/MⅡ期卵母細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜及Npm2基因相關(guān)miRNAs篩選

張 珂，嚴(yán)繼猛，劉耀文，李鴻輝，陳 強(qiáng)，李 卓，蘇艷華，普少瑕，王海臻，魏紅江，賈寶瑜*，成文敏*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201； 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省動(dòng)物基因編輯與體細(xì)胞克隆技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

體細(xì)胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer，SCNT)是將體細(xì)胞注入去核的體外成熟卵母細(xì)胞中以產(chǎn)生新個(gè)體的技術(shù)，可用于研究基因組重編程、生產(chǎn)基因編輯動(dòng)物和保護(hù)瀕危物種。自克隆羊“多莉”出生后的24年內(nèi)，盡管體細(xì)胞核移植技術(shù)在很多物種中均已獲得后代，但克隆胚胎能夠發(fā)育到成活個(gè)體的比例仍非常低，這極大程度限制了SCNT技術(shù)的應(yīng)用[1]。優(yōu)化SCNT技術(shù)參數(shù)并不能顯著提高克隆效率，只有從理論上闡明SCNT機(jī)制才可以克服克隆胚胎發(fā)育異常瓶頸[2]。其中，供體細(xì)胞核不完全重編程是導(dǎo)致克隆效率低、胚胎表型異常和克隆動(dòng)物成活率低的主要原因[3]，然而SCNT介導(dǎo)的核重編程機(jī)制尚不明確，影響克隆胚胎發(fā)育能力的關(guān)鍵因子也不清楚[4]。

核質(zhì)蛋白是一種組蛋白分子伴侶，其家族成員有3個(gè)同系物：NPM1、NPM2和NPM3[5]。其中，NPM2是卵母細(xì)胞和早期胚胎內(nèi)特異性表達(dá)的蛋白，在精子染色質(zhì)解聚[6]和體細(xì)胞重編程過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[7]。NPM2是小鼠核仁組織區(qū)的組成部分，單獨(dú)的NPM2可在體外使精子染色質(zhì)解聚[8]，Npm2缺失導(dǎo)致卵母細(xì)胞缺乏正常的核仁結(jié)構(gòu)，說(shuō)明以NPM2為基礎(chǔ)的卵母細(xì)胞核仁區(qū)對(duì)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中雄性染色體組裝至關(guān)重要[9]，發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)NPM2數(shù)量減少，會(huì)影響核組蛋白水平和染色體結(jié)構(gòu)[10]。在斑馬魚(yú)中發(fā)現(xiàn)，Npm2基因存在兩種形式:Npm2a和Npm2b，其中，Npm2a參與受精過(guò)程中精子染色質(zhì)解聚，Npm2b在受精后參與胚胎基因組激活[11]。體細(xì)胞核移植過(guò)程中將NPM注射入牛卵母細(xì)胞中可提高克隆胚胎的存活率和妊娠率[12]，使用爪蟾卵母細(xì)胞提取物處理豬成纖維細(xì)胞可提高細(xì)胞活率，促進(jìn)體細(xì)胞核移植胚胎的體外發(fā)育能力[13]。本課題組前期的研究結(jié)果也表明，通過(guò)原核表達(dá)載體獲得的重組核質(zhì)蛋白注射入去核的卵母細(xì)胞中，可提高版納微型豬近交系克隆胚胎的發(fā)育能力[14]。上述研究說(shuō)明，NPM2可促進(jìn)體細(xì)胞重編程，但NPM2的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

microRNAs (miRNAs) 是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 nt的短鏈非編碼RNAs，通過(guò)與靶基因序列互補(bǔ)的方式進(jìn)行翻譯后抑制或mRNA降解，以調(diào)控基因表達(dá)和翻譯[15]。miRNA參與調(diào)控繁殖過(guò)程的首例報(bào)道為小鼠減數(shù)分裂過(guò)程中miRNA調(diào)控雌性原始生殖[16]。之后，研究結(jié)果表明，卵子發(fā)生過(guò)程中miRNAs 表達(dá)會(huì)影響成熟卵母細(xì)胞的基因表達(dá)譜[17]，如miR-21通過(guò)影響下游基因SPRY2參與小鼠第一次減數(shù)分裂過(guò)程[18],抑制miR-21活性可改變PDCD4蛋白豐度，影響豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中脂肪酸代謝及脂肪酸生物合成[19]，miR-335-5p調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)[20]。通過(guò)深度測(cè)序技術(shù)分析水牛卵丘細(xì)胞(cumulus cells，CCs)[21]、人卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞miRNA表達(dá)[22]表明，miRNA可通過(guò)調(diào)控卵丘細(xì)胞以及卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞間的縫隙連接影響卵母細(xì)胞成熟，增加卵丘細(xì)胞中miR-224表達(dá)可通過(guò)PTX3表達(dá)變化降低卵母細(xì)胞成熟率和抑制胚胎發(fā)育[23]。let-7 和miR-106a可調(diào)控牛卵母細(xì)胞母源mRNAs表達(dá)[22]，miR-27b及其靶基因PPARγ通過(guò)調(diào)控脂肪代謝影響豬卵母細(xì)胞成熟[23]，過(guò)表達(dá)miR-148a可下調(diào)DNMT1 基因的表達(dá)，上調(diào)重編程相關(guān)基因表達(dá)，提高豬核移植胚胎早期發(fā)育能力[24]。盡管許多miRNAs 及其靶基因均已被識(shí)別，但miRNAs 調(diào)控Npm2表達(dá)的研究較少，僅有研究表明，miRNA-181a 可調(diào)控牛卵母細(xì)胞中Npm2表達(dá)[25]，豬卵母細(xì)胞中調(diào)控Npm2表達(dá)的miRNAs還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究目的在于構(gòu)建豬GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞中miRNAs表達(dá)譜，篩選出調(diào)控Npm2基因表達(dá)的miRNAs，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 卵母細(xì)胞采集培養(yǎng)

從昆明市呈貢區(qū)鴻騰屠宰場(chǎng)采集豬卵巢，放入盛有37 ℃生理鹽水(含100 IU·mL-1青霉素和鏈霉素)的保溫瓶中送回實(shí)驗(yàn)室。用37 ℃生理鹽水沖洗卵巢3遍，隨后用配有20 G針頭的10 mL注射器抽取卵巢表面3～6 mm卵泡中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complex，COCs)。置于體視顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻、有3層及3層以上卵丘細(xì)胞包裹的A、B級(jí)COCs作為GV期卵母細(xì)胞；挑出之后將其置于成熟培養(yǎng)液中并放入5% CO2、38.5 ℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42～44 h。成熟培養(yǎng)液為T(mén)CM-199，添加0.1 mg·mL-1丙酮酸鈉、0.1 mg·mL-1L-半胱氨酸、10%(v/v)豬卵泡液(porcine follicular fluid，pFF)、10 ng·mL-1表皮生長(zhǎng)因子(epidernal growth factor，EGF)、10 IU·mL-1hCG和10 IU·mL-1eCG。成熟培養(yǎng)后選出細(xì)胞膜完整、胞質(zhì)均勻且第一極體排出的卵母細(xì)胞作為MⅡ期卵母細(xì)胞。

1.2 GV和MⅡ期卵母細(xì)胞RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

收集的GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞用0.1 mg· mL-1的透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞，使用1%鏈霉蛋白酶去除透明帶，約130個(gè)卵母細(xì)胞加5～10 μL Trizol，經(jīng)液氮處理后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。樣品?jīng)解凍后加入1 mL MagzolTM Reagent進(jìn)行總RNA提取，由廣州銳博生物科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。具體步驟：提取純化的總RNA分別連接5′接頭和3′接頭，使用superscript Ⅱreverse transcriptase (Invitrogen)合成cDNA，PCR擴(kuò)增，用凝膠電泳法獲取插入片段在18～40 nt 的cDNA文庫(kù)，使用Illumina HiSeqTM2500進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3 GV和MⅡ期卵母細(xì)胞miRNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析

將Illumina HiSeqTM2500 測(cè)序所得 50 nt 原始序列(raw reads)集，通過(guò)去掉 reads 兩端的接頭、去掉低質(zhì)量reads、去污染等過(guò)程完成數(shù)據(jù)初步過(guò)濾，得到干凈序列(clean reads)，對(duì)其進(jìn)行序列長(zhǎng)度分布的統(tǒng)計(jì)及樣本間共有序列統(tǒng)計(jì)，對(duì)clean reads進(jìn)行分類(lèi)注釋?zhuān)梢垣@得樣本中各類(lèi)sRNA的組分及表達(dá)量信息，將所有sRNA片段注釋后，使用余下的未注釋片段進(jìn)行新miRNA的預(yù)測(cè)。

1.4 GV和MⅡ期卵母細(xì)胞差異表達(dá)miRNAs篩選及富集分析

對(duì)各樣本中已知和新miRNA進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行歸一化處理，采用DEGseq進(jìn)行差異分析，從差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)和校正后的顯著水平(qvalue<0.05)進(jìn)行評(píng)估，對(duì)差異miRNAs進(jìn)行篩選。對(duì)獲得的差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

對(duì)篩選的GV期和M Ⅱ期卵母細(xì)胞中差異表達(dá)的兩個(gè)miRNAs進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以U6為內(nèi)參基因。miRNA引物購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。所用的qPCR反應(yīng)體系為10 μL：cDNA 2 μL，2×SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，RNase-free H2O 2.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)；70～95 ℃每間隔0.5 ℃讀數(shù)一次，每個(gè)樣本重復(fù)試驗(yàn)3次。相對(duì)表達(dá)量結(jié)果采用2-ΔΔct法計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果描述為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”，運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，*P<0.05認(rèn)為差異顯著，**P<0.01認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾和sRNA參考序列的分布情況

經(jīng)過(guò)測(cè)序，去除兩端接頭、污染及低質(zhì)量序列后，GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞sRNA文庫(kù)測(cè)序分別獲得了14 782 574和15 589 900條Raw reads，大部分序列的長(zhǎng)度都集中在21～24 nt，均以24 nt長(zhǎng)度的比例最高。將經(jīng)長(zhǎng)度篩選的sRNA與豬基因組進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GV期卵母細(xì)胞特有序列占36.37%，MⅡ期卵母細(xì)胞特有序列占46.04%，GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞共有序列占17.60%。

2.2 GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞新miRNAs預(yù)測(cè)

GV期卵母細(xì)胞共預(yù)測(cè)到367個(gè)新miRNAs，MⅡ期卵母細(xì)胞共預(yù)測(cè)到408個(gè)新miRNAs。其中，GV911預(yù)測(cè)到95個(gè)新的miRNAs，GV913預(yù)測(cè)到152個(gè)新的miRNAs，GV918預(yù)測(cè)到103個(gè)新的miRNAs。MⅡ911預(yù)測(cè)到119個(gè)新的miRNAs，MⅡ913 預(yù)測(cè)到93個(gè)新的miRNAs，MⅡ918預(yù)測(cè)到152個(gè)新的miRNAs。

2.3 GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞差異表達(dá)miRNAs篩選

對(duì)GV期和MII期卵母細(xì)胞中表達(dá)的已知miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，以log2(fold change)≥1為閾值，qvalue<0.01表示極顯著差異，qvalue<0.05表示顯著差異。結(jié)果如圖1所示，log2(fold change)≥1的miRNA共計(jì)172個(gè)，差異表達(dá)的miRNA有95個(gè)，其中65個(gè)存在極顯著差異，30個(gè)存在顯著差異。相對(duì)于GV期卵母細(xì)胞，MⅡ期卵母細(xì)胞中37個(gè)miRNAs極顯著下調(diào)，25個(gè)顯著下調(diào)，28個(gè)極顯著上調(diào)，5個(gè)顯著上調(diào)。其中miR-676-5p和miR-493-5p為下調(diào)和上調(diào)表達(dá)中差異倍數(shù)最大的miRNAs。

2.4 GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞差異miRNA聚類(lèi)分析

為判斷GV期和M Ⅱ期卵母細(xì)胞中差異miRNA表達(dá)量的聚類(lèi)模式，以更好地理解已知miRNA的未知功能，對(duì)GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞中miRNAs做聚類(lèi)分析(圖2)。結(jié)果表明，具有相似表達(dá)模式的miRNAs聚在一起。如miR-363、miR-7138-5p、miR-142-3p和miR-126-5p等表達(dá)模式相似(在GV期卵母細(xì)胞中低表達(dá)，在MⅡ期卵母細(xì)胞中高表達(dá))且聚為一類(lèi)。因此推測(cè)，聚為一類(lèi)的miRNAs可能具有相似的生物學(xué)功能。

2.5 GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞差異表達(dá)miRNAs靶基因預(yù)測(cè)及功能注釋

對(duì)95個(gè)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共得到3 967個(gè)靶基因。其中，miR-423-5p涉及的靶基因有224個(gè)，miR-671-5p涉及的靶基因有206個(gè)，miR-296-3p涉及的靶基因有211個(gè)，miR-370涉及的靶基因有150個(gè)，miR-874涉及的靶基因有145個(gè)。 對(duì)靶基因進(jìn)行Gene Ontology富集，結(jié)果表明，這些靶基因被富集于472個(gè)細(xì)胞組分(cellular component，CC)、695個(gè)細(xì)胞功能(molecular function，MF)和4 027個(gè)生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)，共5 194個(gè)GO條目。每個(gè)GO分類(lèi)顯著富集的前20個(gè)條目見(jiàn)表1和圖3。從生物學(xué)過(guò)程看，這些靶基因主要參與細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)、代謝過(guò)程(metabolic process)、生物調(diào)控(biological regulation)、刺激應(yīng)答(stimulus response)、定位(localization)和發(fā)育(developmental process)等過(guò)程。從分子功能來(lái)看，多數(shù)靶基因與蛋白結(jié)合(protein binding)、催化活性(catalytic activity)、各類(lèi)離子結(jié)合(ion binding)和環(huán)狀化合物結(jié)合(cyclic compound binding)相關(guān)。其表達(dá)產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器和細(xì)胞膜(cytoplasm, organelle and membrane)區(qū)域。

表1 GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞差異miRNAs靶基因顯著富集的GO條目

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

2.6 差異表達(dá)miRNAs 靶基因KEGG富集分析

對(duì)95個(gè)差異表達(dá)miRNAs的靶基因基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集，共富集到212個(gè)信號(hào)通路，在富集程度最高的前20個(gè)KEGG通路中(表2和圖4)，這些靶基因主要參與代謝通路(metabolic pathways)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)和AMPK細(xì)胞通路(AMPK signaling pathway)、信號(hào)分子和相互作用的細(xì)胞黏附(cell adhesion molecules)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine-cytokine receptor interaction)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的胰島素信號(hào)通路(insulin signaling pathway)、細(xì)胞活力的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控(actin cytoskeleton regulation)等途徑。

表2 差異表達(dá)miRNAs靶基因富集程度前20的KEGG通路

其中，與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)的通路有2個(gè)，基因有CPEB、MAPK1、Rsk1/2、Cdk2、Cdc2、Cdc23、MAPK12等(圖5A)。孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路中涉及的基因有PIK3、MAPK1、CPEB、Cdk2、Cdc16、Mos等(圖5B)。

2.7 與Npm2基因表達(dá)相關(guān)的miRNAs的篩選

在差異表達(dá)的95個(gè)miRNA中，經(jīng)一個(gè)軟件預(yù)測(cè)與Npm2相關(guān)的miRNA有12個(gè)，分別是miR-21、miR-24-3p、miR-29a、miR-30e-3p、miR-133b、miR-151-3p、miR-219a、miR-323、miR-328、miR-421-3p、miR-1307、miR-2366。經(jīng)兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)與Npm2相關(guān)的miRNA有5個(gè)，分別是miR-32、miR-150、miR-296-3p、miR-423-3p、miR-7138-5p。其中，miR-150和miR-7138-5p極顯著上調(diào)，miR-423-3p和miR-296-3p極顯著下調(diào)，miR-32顯著下調(diào)。在5個(gè)miRNA中選擇miRNA測(cè)序結(jié)果中自體表達(dá)量高且存在極顯著下調(diào)的miR-423-3p和GV期完全不表達(dá)而MⅡ期卵母細(xì)胞極顯著上調(diào)的miR-7138-5p進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，miR-423-3p表達(dá)極顯著下調(diào)(圖6A)，miR-7138-5p表達(dá)上調(diào)(圖6B)，其表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致。

3 討 論

卵母細(xì)胞成熟是通過(guò)有序的減數(shù)分裂、染色質(zhì)重塑和細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器重組等在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)方面發(fā)生變化的過(guò)程[26-28]，體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞是進(jìn)行體細(xì)胞核移植研究所需受體卵母細(xì)胞的主要來(lái)源，其成熟質(zhì)量與體細(xì)胞核移植效率密切相關(guān)。卵母細(xì)胞中儲(chǔ)存的mRNA及蛋白質(zhì)調(diào)控卵子自身的成熟及受精后胚胎的早期發(fā)育，包括卵母細(xì)胞的極性、卵子的激活、早期細(xì)胞分裂、母源mRNA的清除、合子基因組轉(zhuǎn)錄激活及胚層的形成和分化等[29]。而在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，miRNA的表達(dá)豐度呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，影響卵母細(xì)胞成熟、早期胚胎發(fā)育、母源mRNA降解等過(guò)程。本研究分析了豬卵母細(xì)胞成熟前、后miRNAs表達(dá)譜，并篩選出了調(diào)控Npm2基因表達(dá)的miRNAs，結(jié)果為進(jìn)一步闡明豬卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中miRNA的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)對(duì)豬GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，GV期卵母細(xì)胞共預(yù)測(cè)到367個(gè)新miRNAs，MⅡ期卵母細(xì)胞共預(yù)測(cè)到408個(gè)新miRNAs。 篩選到差異表達(dá)的miRNAs共有95個(gè)，其中，37個(gè)極顯著下調(diào)，25個(gè)顯著下調(diào)，28個(gè)極顯著上調(diào)，5個(gè)顯著上調(diào)。宋春雷[30]研究發(fā)現(xiàn)，與豬GV期卵母細(xì)胞相比，有7個(gè)miRNAs在MⅡ期卵母細(xì)胞中的表達(dá)量下調(diào)超過(guò)2倍(P<0.001，fold change>2)，如miR-210、miR-202-5p、miR-676-3p、miR-15b、miR-27b-3p、miR-769-5p均下調(diào)，其中,4個(gè)miRNAs在GV期卵母細(xì)胞中特異表達(dá)，在MⅡ期卵母細(xì)胞中無(wú)表達(dá)；有16個(gè)miRNAs在MⅡ期卵母細(xì)胞中的表達(dá)量上調(diào)超過(guò)2倍(P<0.001，fold change>2)，這些顯著上調(diào)的miRNAs都只特異性表達(dá)于MⅡ期卵母細(xì)胞中，在GV期檢測(cè)不到表達(dá)，如miR-486、miR-342、miR-100、miR-10b、miR-10a-5p、miR-183、miR-21均上調(diào)。miR-21在牛體外成熟卵母細(xì)胞中也表達(dá)上調(diào)[31]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-21表達(dá)上調(diào)，與前人結(jié)果相一致，miR-21可下調(diào)金屬蛋白酶家族成員組織抑制物活性，增加金屬蛋白酶活性，促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散和卵母細(xì)胞成熟[32]。另外，miR-486表達(dá)水平上調(diào)，研究結(jié)果表明，miR-486可通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(the phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt)信號(hào)通路促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖，有利于卵母細(xì)胞成熟[33]。但miR-342、miR-100、miR-10b、miR-10a-5p、miR-183未發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)，在上調(diào)的miRNAs中miR-493-5p和miR-7138-5p只特異性表達(dá)于MⅡ期卵母細(xì)胞中，在GV期檢測(cè)不到表達(dá)。經(jīng)預(yù)測(cè)miR-493-5p的靶基因有11個(gè)，其中，SLC7A1是一種精氨酸/賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)者，參與哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞多能性Nanog信號(hào)通路，RIT1參與調(diào)控MAPK(mitogen-activated protein kinase)依賴(lài)的信號(hào)通路，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活和分化。目前，對(duì)于miR-493-5p的研究主要集中于腫瘤，可通過(guò)消除胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor 2，IGF2)過(guò)表達(dá)而發(fā)揮其腫瘤抑制活性[34]，還可以通過(guò)磷PI3K-Akt信號(hào)通路抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[35]，但miR-493-5p參與卵母細(xì)胞成熟的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。miR-7138-5p的靶基因有43個(gè)，其中，TBX21基因編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，可激活干擾素和趨化因子受體基因，招募包括KDM6B、SWI/SNF復(fù)合體和H3K4 me2甲基轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的染色體重組復(fù)合物，建立松散的染色質(zhì)狀態(tài)，有益于轉(zhuǎn)錄激活。PAQR8為孕激素和脂聯(lián)素Q受體家族成員，通過(guò)G蛋白信號(hào)通路參與卵母細(xì)胞成熟，在金魚(yú)卵母細(xì)胞中注射PAQR8的反義寡核苷酸抑制其表達(dá)，可抑制卵母細(xì)胞成熟誘導(dǎo)[36]，推測(cè)miR-7138-5p可能通過(guò)作用于上述靶基因參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟。

另外，本試驗(yàn)檢測(cè)到miR-210、miR-202-5p、miR-676-3p、miR-27b-3p、miR-769-5p、miR-574等均下調(diào)，miR-15b未發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)，在下調(diào)的miRNAs 中只有miR-676-5p在GV期卵母細(xì)胞中特異表達(dá)，在MⅡ期卵母細(xì)胞中無(wú)表達(dá)。miR-676-5p有8個(gè)靶基因，其中，CDKN1B編碼細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的激酶抑制劑，可以控制G1期細(xì)胞周期進(jìn)程，CDK依賴(lài)的磷酸化會(huì)導(dǎo)致CDKN1B蛋白降解，促進(jìn)細(xì)胞周期由沉默狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋碃顟B(tài)，但miR-676-5p參與卵母細(xì)胞成熟的研究未見(jiàn)報(bào)道。miR-574可通過(guò)靶向作用于透明質(zhì)酸合成酶2抑制卵母細(xì)胞成熟[37]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-574表達(dá)下調(diào)，與前人研究結(jié)果相一致，說(shuō)明miR-574下調(diào)參與卵母細(xì)胞成熟。上述結(jié)果表明，miRNAs可能作用于特定的靶基因進(jìn)而調(diào)控豬卵母細(xì)胞體外成熟。

對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果表明，靶基因顯著富集于代謝通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、AMPK細(xì)胞通路、信號(hào)分子和相互作用的細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體結(jié)合、胰島素信號(hào)通路、細(xì)胞活力的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控等途徑。豬卵母細(xì)胞中含有大量的脂肪顆粒，脂類(lèi)的合成和分解可以為卵母細(xì)胞成熟和隨后的胚胎發(fā)育提供必需的能量來(lái)源，因此，代謝途徑不僅影響卵母細(xì)胞質(zhì)成熟，還會(huì)控制卵母細(xì)胞核成熟。另外，PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、DNA修復(fù)和蛋白合成中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，參與原始卵泡募集、顆粒細(xì)胞增殖、黃體功能和卵母細(xì)胞成熟[38]。PI3K激活可以促進(jìn)Akt磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)卵泡生長(zhǎng)、促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟并發(fā)育到囊胚[39]，而Akt又是胰島素信號(hào)傳遞和葡萄糖代謝的主要調(diào)節(jié)分子，說(shuō)明PI3K-Akt信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路等在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。進(jìn)一步說(shuō)明，miRNA通過(guò)作用于PI3K-Akt、胰島素等信號(hào)通路的靶基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)卵母細(xì)胞的成熟調(diào)控。

NPM2是卵母細(xì)胞特異性的核因子，對(duì)促進(jìn)核重編程和早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。經(jīng)MicroInspector預(yù)測(cè)，miRNA與牛Npm2 mRNA的結(jié)合位點(diǎn)在3′UTR區(qū)，轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明，在Hela細(xì)胞中miR-181a降低NPM2蛋白表達(dá)，說(shuō)明miR-181a會(huì)抑制NPM2翻譯[27]。本試驗(yàn)在GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞中未檢測(cè)到miR-181a，而檢測(cè)到miR-181c表達(dá)，但差異不顯著。在差異表達(dá)的miRNAs中預(yù)測(cè)到與Npm2基因相關(guān)的miRNA有5個(gè)，其中，miR-150和miR-7138-5p極顯著上調(diào)，miR-423-3p和miR-296-3p極顯著下調(diào)，miR-32顯著下調(diào)。miR-150在牛卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中隨著成熟進(jìn)程的推進(jìn)其表達(dá)量降低，可能作用于CALML4基因而影響卵母細(xì)胞成熟[40]。但本試驗(yàn)預(yù)測(cè)CALML4并不是miR-150的靶基因，這可能是由于物種特異性所致。miR-296-3p、miR-423-3p、miR-32研究均集中于腫瘤方面，對(duì)卵母細(xì)胞成熟調(diào)控未見(jiàn)報(bào)道，僅Guo等[41]結(jié)果表明，miR-32為附植相關(guān)miRNAs，在體外受精失敗的人類(lèi)中miR-32會(huì)顯著下調(diào)，也未見(jiàn)關(guān)于miR-7138-5p的報(bào)道。本研究選擇自體表達(dá)量高且存在極顯著差異的下調(diào)miRNA-423-3p和GV期完全不表達(dá)而MⅡ期卵母細(xì)胞極顯著上調(diào)的miR-7138-5p進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，其表達(dá)水平變化趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果相一致，miR-423-3p在誘導(dǎo)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等方面可調(diào)控靶基因表達(dá)而發(fā)揮作用，經(jīng)預(yù)測(cè)后miR-423-3p的靶基因除Npm2外還包括ADM基因，該基因編碼的腎上腺髓質(zhì)素在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、胚胎附植和子宮發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮重要的作用。miR-7138-5p的靶基因除Npm2外還包括TBX21和PAQR8基因，推測(cè)miR-423-3p和miR-7138-5p可能通過(guò)作用于相應(yīng)的靶基因從而調(diào)控卵母細(xì)胞成熟，但具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了豬GV/MⅡ期卵母細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜，并篩選出了兩個(gè)時(shí)期卵母細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs；同時(shí)，結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)及GO、KEGG富集分析，推測(cè)出差異表達(dá)的miRNAs可能通過(guò)代謝途徑、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)的通路、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路等途徑在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中發(fā)揮作用；另外篩選出了調(diào)控Npm2基因表達(dá)的miRNAs。這些結(jié)果將為后續(xù)研究豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中miRNAs對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。