載鋅蒙脫石對肉雞生產性能、免疫功能及腸道組織形態(tài)的影響

王海波，周永明，王 靜，張 瑞，康 鵬，馬曉東，裴文剛，楊敏敏，史兆國，秦士貞

(甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

鋅(Zn)是動物必需微量元素之一，不僅參與動物機體酶和功能蛋白的組成，并與養(yǎng)分、遺傳物質代謝及激素的功能和活性相關，在穩(wěn)定生物膜，介導腸道離子轉運，增加消化酶活性，促進細胞増殖、分化和腸絨毛發(fā)育等方面發(fā)揮重要功能[1-2]。通常，家禽飼料常以ZnSO4作為飼料鋅源，ZnSO4易吸潮結塊從而破壞飼料中的維生素及其他活性營養(yǎng)物質，且吸收利用率低，過度排放到環(huán)境中易造成鋅污染[3]。然而，通過離子交換對沸石、蒙脫石等黏土礦物富集微量礦物元素，可使微量元素在動物腸道內合理釋放，持久被動物體吸收利用，提高微量元素的利用率，減少微量元素對環(huán)境的污染[4]。楊雪[5]的研究發(fā)現(xiàn)，載鋅沸石相比ZnSO4和抗生素能提高肉雞日增重、采食量；載鈣蒙脫石可緩解黃曲霉毒素B1(AFB1)誘發(fā)的肉鴨腸黏膜損傷，促進腸絨毛發(fā)育[6]；同時，載銅蒙脫石可顯著提高肉雞小腸絨毛高度[7]。羅有文[8]研究發(fā)現(xiàn)，載鋅凹土具有抑菌和調節(jié)免疫功能。但關于載鋅蒙脫石(zinc-montmorillonite, Zn-MMT)作為鋅源的研究鮮見報道，因此，本試驗旨在研究Zn-MMT對肉雞生產性能、免疫功能及腸道發(fā)育的影響，為Zn-MMT在肉雞生產中的應用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

載鋅蒙脫石(赤峰和明化工有限公司)經蘭州中檢科測試技術有限公司檢測，鋅含量為10 408.80 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

采用單因子完全隨機試驗設計，對照組飼喂玉米-豆粕型基礎日糧(CK)、正對照組飼喂基礎日糧添加40 mg·kg-1ZnSO4、試驗組分別在基礎日糧中添加20、40、60和80 mg·kg-1Zn-MMT(均以Zn含量計算)。

1.3 試驗動物及管理

選擇1日齡健康科寶公雛288只，按體重隨機分成6個處理組，每處理6個重復，每重復8只仔雞。試驗采用3層籠養(yǎng)，為期為42 d。飼養(yǎng)管理和常規(guī)免疫按照《科寶肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》進行。采用24 h恒定光照，雞只自由采食、飲水。

1.4 試驗日糧

基礎日糧參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)及NRC(1994)配制玉米-豆粕型日糧?；A日糧及營養(yǎng)水平見表1。

1.5 指標測定與方法

1.5.1 生長性能 分別于第21和42天，自由飲水下禁食12 h后，以重復籠為單元，空腹稱量體重，記錄體重(BW)及飼料消耗量。并計算ADFI、ADG、F/G。

1.5.2 屠宰性能 在第42天，各重復隨機選取1只 體重接近該重復平均值的肉仔雞，自由飲水，禁食12 h，稱重并屠宰，按《家禽生產性能名詞術語和度量統(tǒng)計方法》[9]規(guī)定方法對屠宰性能測定。

1.5.3 免疫器官指數(shù) 分別于第21和42天，每重復選1只接近平均體重的仔雞屠宰，去除表面結締組織和脂肪，稱重，計算免疫器官指數(shù)；免疫器官指數(shù)=器官重量(g)/體重(kg)。

1.5.4 小腸絨毛高度和隱窩深度的測定 在第42天， 各重復選1只接近平均體重的肉仔雞進行屠宰，分離十二指腸、空腸、回腸，選取1～2 cm， 中段腸道用生理鹽水清洗后迅速放入4%多聚甲醛中保存，送往武漢塞維爾生物科技有限公司制作切片，采用Motic-BA210Digital數(shù)碼顯微鏡對VH、CD進行測量，計算V/C。

1.5.5 脾基因(IL-2、TNF-α、IgG、IgA)表達檢測 在試驗42 d，從每個處理中選擇3只接近平均體重的肉雞，迅速屠宰取出脾，液氮速凍，在-80 ℃冰箱中保存直至分析。使用TRIzol(北京全式金生物技術有限公司)法提取脾組織總RNA，用微量紫外可見分光光度計(NanoDrop-2000)測定RNA濃度和純度，參照反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser)說明，對總RNA進行反轉錄合成cDNA，儲存在-20 ℃冰箱中備用。并利用Light Cycler?480ⅡSystems熒光定量基因擴增儀，采用SYBR?GreenⅠ染料法，以β-actin為內參，參照熒光定量試劑盒說明書(SYBR?Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒)進行實時熒光定量PCR擴增，用2-△△Ct法計算基因表達量。引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,詳見表2。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經Excel處理后，采用SPSS 26.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進行多重比較，試驗結果均以“平均值(Mean)±標準差(SD)”表示，P<0.05表示顯著水平。

2 結 果

2.1 Zn-MMT對肉雞生長性能的影響

Zn-MMT對肉雞生長性能的影響見表3。由表3 可見，Zn-MMT對1～21、22～42及1～42日齡肉仔雞的ADFI無顯著影響(P>0.05)，但顯著性影響ADG及1～42日齡的F/G(P<0.05)。與CK和ZnSO4組相比，添加60和80 mg·kg-1Zn-MMT 顯著降低了1～21日齡肉仔雞ADG(P<0.05)，且80 mg·kg-1Zn-MMT顯著降低22～42及1～42日齡的仔雞ADG(P<0.05)；Zn-MMT對1～21、22～42日齡肉仔雞的ADFI與F/G及1～42日齡肉仔雞的ADFI無顯著影響(P>0.05)，但40 mg·kg-1的Zn-MMT顯著降低了1～42日齡的F/G(P<0.05)。

表1 日糧組成及養(yǎng)分水平(風干基礎)

2.2 Zn-MMT對肉雞屠宰性能的影響

Zn-MMT對肉雞屠宰性能的影響見表4。由表4可見， Zn-MMT對胸肌率有顯著影響(P<0.05)，但對屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、腿比率、腿肌率無顯著影響(P>0.05)。相比CK組，添加 Zn-MMT對肉仔雞42日齡的胸肌率無顯著影響(P>0.05)，但與 ZnSO4組相比，添加40 mg·kg-1的 Zn-MMT顯著提高了42日齡肉仔雞的胸肌率(P<0.05)。

2.3 Zn-MMT對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

Zn-MMT對肉雞免疫器官指數(shù)的影響見表5。由表5可見，Zn-MMT對21日齡肉仔雞法氏囊指數(shù)和42日齡肉仔雞法氏囊指數(shù)和胸腺指數(shù)有顯著性影響(P<0.05)，對21日齡肉仔雞胸腺和脾臟指數(shù)以及對42日齡肉仔雞脾臟指數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)。與CK組相比， 60 mg·kg-1Zn-MMT顯著升高了21日齡 肉仔雞法氏囊指數(shù)(P<0.05)，但與ZnSO4組相無顯著差異(P>0.05)。與CK組相比， Zn-MMT對42日齡肉仔雞胸腺指數(shù)無顯著影響(P>0.05)； 但相比ZnSO4組， 40和80 mg·kg-1Zn-MMT顯著提高了42日齡肉仔雞胸腺指數(shù)(P<0.05)。與CK和ZnSO4組相比，60 mg·kg-1Zn-MMT顯著增加了42日齡 肉仔雞法氏囊指數(shù)(P<0.05)。

表2 目的基因及內參基因引物

表3 Zn-MMT對肉雞生長性能的影響

2.4 Zn-MMT對肉雞腸形態(tài)的影響

Zn-MMT對肉雞腸形態(tài)的影響見表6。由表6可知，添加Zn-MMT可以顯著影響十二指腸、空腸、回腸VH、CD及V/C(P<0.05)。相比CK與ZnSO4組，添加40 mg·kg-1的Zn-MMT可以顯著提高十二指腸、空腸的VH和V/C(P<0.05)，且顯著降低十二指腸的CD(P<0.05)，但對回腸的CD無顯著影響(P>0.05)。同時，相比CK，40 mg·kg-1的Zn-MMT顯著提高回腸的VH和V/C(P<0.05)，但與ZnSO4組無顯著差異(P>0.05)。同時，相比CK，添加ZnSO4對肉仔雞十二指腸、空腸VH、CD及V/C及回腸的VH、CD無顯著影響(P>0.05)，但能顯著提高回腸的V/C(P<0.05)。

2.5 Zn-MMT對肉雞脾基因(IL-2、TNF-α、IgG、IgA)表達的影響

Zn-MMT對肉雞脾IL-2、TNF-α、IgG、IgA基因表達的影響見表7。由表7可知，Zn-MMT顯著影響肉雞脾IL-2、TNF-α、IgG、IgA基因的表達(P<0.05)。 相比CK和ZnSO4組，20 mg·kg-1的Zn-MMT顯著提高脾TNF-α表達，且40、60和80 mg·kg-1的顯著提高脾IL-2的表達(P<0.05)，而ZnSO4組與CK差異不顯著(P>0.05)。同時，相比CK，添加ZnSO4和20與40 mg·kg-1的Zn-MMT 顯著提高脾IgG的表達(P<0.05)，相比CK和Zn-MMT組，ZnSO4顯著提高脾IgA的表達(P>0.05)。

表4 Zn-MMT對肉雞屠宰性能的影響

表5 Zn-MMT對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

表6 Zn-MMT對肉雞腸形態(tài)的影響

表7 Zn-MMT對肉雞脾IL-2、TNF-α、IgG、IgA mRNA表達水平的影響

3 討 論

3.1 Zn-MMT對肉雞生產性能的影響

天然硅酸鹽礦土具有無害、無污染的特性，常作飼料添加劑的載體或粘結劑應用在動物生產中，其品質易受種類、產地、等級和理化結構的影響[6,14]。國內外關于硅酸鹽黏土在反芻動物、家禽及魚飼料的研究中發(fā)現(xiàn)，其具有抗腹瀉、抗炎、促生長、提高飼料轉化率的優(yōu)點[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，Cu-MMT[18]可顯著降低肥育豬料重及全程料重比，且雙季銨鹽改性蒙脫石與Cu-MMT均能促進肉雞生產[19]。Ke等[20]在飼料中添加改性蒙脫石替代金霉素可顯著提高斷奶仔豬的生長性能；Hu等[21]在仔豬日糧中添加蒙脫石和ZnO，均能改善豬生長性能。本研究發(fā)現(xiàn)，40 mg·kg-1Zn-MMT可顯著降低肉雞的料重比，提高飼料轉化率，這與在肉雞日糧中添加ZnO-MMT[22]和Ca-MMT[23]降低料重比的結果一致。Zn-MMT提高飼料轉化率可能與硅酸鹽黏土載體富集鋅,使鋅在動物腸道內能合理釋放,減少日糧中植酸、纖維等成分對鋅的螯合,降低抗營養(yǎng)因子對鋅的干擾，降低腸道內食糜通過率，增加腸道消化酶活性，促進營養(yǎng)物質的消化吸收[24-25]及腸道發(fā)育有關。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，80 mg·kg-1Zn-MMT可降低肉雞ADG。這與羅有文[8]在肉雞飼糧中添加40或80 mg·kg-1載鋅凹凸棒石后顯著提高肉雞的增重結果不一致。這可能與載鋅蒙脫石特殊的結構和理化特性有關，且添加超過一定劑量時，可能在腸道中黏結聚合大型復合離子、在動物體內和其他動物體所需要的陽離子發(fā)生交換吸附, 影響其他礦物元素及有機分子的利用[19，26],且載鋅蒙脫石鋅的生物學活性受其鋅負載量、制備工藝影響。

3.2 Zn-MMT對肉雞屠宰性能的影響

相關研究顯示[27-28]，在飼料中添加斜發(fā)沸石對生長豬、育肥豬、肉雞的胴體品質和凈胴體重無顯著影響，但能夠增加肉的產量,提高其腿肌質量。王芳等[29]與Qin等[1]研究表明，天然和改性蒙脫石及不同濃度的ZnSO4對肉雞屠宰性能無顯著影響。也有研究發(fā)現(xiàn)，載鋅凹凸棒石可以提高肉雞全凈膛率、胸肌率和腿肌率,改善屠宰性能[30]，然而，本研究發(fā)現(xiàn)，相比CK，添加Zn-MMT與ZnSO4對肉雞屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、腿比率及腿肌率無顯著影響，這可能與試驗中所用載鋅蒙脫石的種類、載鋅蒙脫石的制備工藝、肉雞的飼養(yǎng)環(huán)境有關。此外，黏土礦物在動物生產中主要用來吸附霉菌毒素、重金屬、細菌、病毒，預防腹瀉和動物疾病產生，對胴體重的促進效果不顯著[27]。但相比ZnSO4與60和 80 mg·kg-1Zn-MMT組，添加40 mg·kg-1的Zn-MMT顯著提高了42日齡的胸肌率，與不同劑量的載鋅蒙脫石影響腸道發(fā)育，及ZnSO4與Zn-MMT吸收機制存在差異有關，有待進一步研究。

3.3 Zn-MMT對肉雞免疫器官指數(shù)的影響

鋅是動物必需微量元素之一，與動物的免疫功能密切相關，并直接影響胸腺、法氏囊的發(fā)育和成熟，缺鋅會引起免疫器官萎縮，補鋅后免疫器官的機能有所恢復[8,25,31]。免疫器官參與畜禽全身的細胞免疫和體液免疫[32]，脾是機體最大的免疫器官，并作為機體細胞免疫和體液免疫的中心[33]，在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要功能。硅酸鹽黏土通過吸附和清除干擾機體免疫系統(tǒng)功能的激素、毒素、病毒、酵母菌、真菌等，增加巨噬細胞的數(shù)量，增強機體免疫功能[15,34]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加60 mg·kg-1Zn-MMT可顯著提高肉雞法氏囊指數(shù)，這與羅有文[8]研究中日糧中添加載鋅凹土促進肉雞免疫器官發(fā)育，提高肉雞法氏囊指數(shù)的結果相一致。同時，本試驗還發(fā)現(xiàn)，40 mg·kg-1Zn-MMT相比ZnSO4顯著提高了42日齡肉雞胸腺指數(shù)。這可能與硅酸鹽黏土獨特的吸附性和解吸附性相關，載鋅蒙脫石中鋅離子的釋放受機體消化道中鋅離子濃度影響，當機體消化道中鋅離子濃度較高時釋放減緩，若鋅離子濃度降低，則鋅離子的釋放速度增快，從而提高胸腺激素發(fā)揮功能必需依賴鋅離子的利用率[8,35]，使Zn-MMT組中鋅利用率高于ZnSO4組，促進胸腺發(fā)育，改善肉雞免疫性能。

3.4 Zn-MMT對肉雞小腸形態(tài)的影響

腸道是動物的主要消化器官，腸道絨毛高度、隱窩深度及其二者比值是反映腸道結構完整性的重要指標[36-37]，當內源性與外源性細菌、病毒入侵時，腸道屏障會保護機體免受外界損傷。鋅參與多種酶的重要組成部分，與腸道發(fā)育密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，ZnSO4和甘氨酸鋅能顯著增加腸道絨毛高度[38]；Cu-MMT能顯著提高肉雞空腸VH及V/C；Ca-MMT可緩解AFB1誘發(fā)的肉鴨腸黏膜損傷，提高絨毛高度及V/C[6]。本試驗結果表明，添加40 mg·kg-1的Zn-MMT可以顯著提高十二指腸、空腸的VH和V/C，且顯著降低十二指腸的CD，這與Xia等[7]發(fā)現(xiàn)改性蒙脫石可提高空腸空腸的VH和V/C相一致。小腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度增大，降低隱窩深度，可增強絨毛上皮細胞再生能力，增加小腸與營養(yǎng)物質的接觸面積，促進營養(yǎng)物質的吸收，直接影響機體的生長發(fā)育與飼料轉化率[39-40]。同時，載鋅蒙脫石在肉雞腸道內持續(xù)釋放鋅及硅酸鹽黏土吸附或抑制腸道細菌、霉菌毒素等，緩解其對腸上皮細胞造成的損傷，增強腸黏膜上皮細胞的增殖及黏膜分泌，促進腸絨毛發(fā)育，維持腸道形態(tài)[16,25,41-42]。

3.5 Zn-MMT對肉雞脾基因表達的影響

動物機體的特異性免疫反應包括體液免疫和細胞免疫,體液免疫主要由B淋巴細胞產生特異性抗體來介導,細胞免疫主要由T淋巴細胞及其分泌的細胞因子來介導，包括白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子等細胞因子[43-44]；其中IL-2被認為是T細胞依賴的免疫反應的關鍵細胞因子，并由激活的T細胞分泌[45]；TNF-α是由單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等產生的單核因子，在炎癥反應與免疫調節(jié)中發(fā)揮作用[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，Zn-MMT能提高脾TNF-α、IL-2及IgG的表達，ZnSO4顯著提高脾IgA的表達。這可能與鋁硅酸鹽促進脾中負責免疫球蛋白合成的B淋巴細胞分化，提高免疫球蛋白的含量[47]，刺激細胞因子釋放，增強機體免疫力。

4 結 論

肉雞玉米-豆粕型基礎日糧中添加40 mg·kg-1的Zn-MMT促進脾IL-2、IgG基因的表達，并顯著提高十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度并降低十二指腸的隱窩深度，增強絨毛上皮細胞再生能力及營養(yǎng)接觸面積，促進營養(yǎng)物質的吸收，提高飼料轉化率。添加40 mg·kg-1ZnSO4可顯著改善十二指腸、空腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度并降低十二指腸的隱窩深度，能夠促進腸道發(fā)育。