我國部分地區(qū)羊芽囊原蟲流行病學(xué)調(diào)查

劉林科，王朋林，菅憶晨，李世杰，王占銘，王榮軍，張龍現(xiàn)，寧長申，菅復(fù)春*

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046；2. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004)

芽囊原蟲(Blastocystisspp.)是一種全球分布的原生生物，在人和動(dòng)物體內(nèi)都廣泛存在，可以通過糞口途徑、水、食物和直接接觸傳播[1]。芽囊原蟲是導(dǎo)致腹瀉、腹痛、肥胖、腸易激綜合征、炎性腸病、蕁麻疹的病原體之一[2-3]，但因人和動(dòng)物感染后多無癥狀，其致病性仍存在一定爭議[4-5]，另有研究表明，芽囊原蟲通過與腸道菌群的相互作用對機(jī)體產(chǎn)生一定的影響，如顫螺菌屬相對豐度的增加和梭菌屬的減少[6]。芽囊原蟲已被證明具有廣泛的遺傳多樣性，迄今為止，根據(jù)SSU rDNA 序列的多態(tài)性進(jìn)行基因亞型分類，已在人和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了22種不同亞型(subtypes，STs)，包括ST1～ST17、ST21和ST23～ST26[7]。ST1～ST9和ST12已在人類中被檢測到，ST3是人類中最常見的亞型。除ST9外，其他亞型在動(dòng)物中均有報(bào)道[8-9]。ST5主要來自家畜，而ST6和ST7是感染鳥類的主要亞型，ST8為非人靈長類(NHPs)的優(yōu)勢亞型。在人中偶然發(fā)現(xiàn)ST5至ST8亞型，這可能是人獸共患傳播的證據(jù)[10-12]。迄今為止，ST10、ST11、ST13～ST17、ST21和ST23～ST26只在非人類宿主中被檢測到[7,13]。

羊是重要的家畜之一，感染芽囊原蟲后不僅會使其生產(chǎn)性能降低，而且會對周圍環(huán)境和水源造成污染，對人們的健康有潛在威脅。為評估河南及其他省區(qū)的羊芽囊原蟲感染情況，本研究基于芽囊原蟲SSU rDNA位點(diǎn)進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查和遺傳特征分析，以期為我國人畜芽囊原蟲病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年4月—12月，從河南(洛陽、商丘、鄭州、開封、周口、南陽)、遼寧(朝陽)、青海、吉林(四平)、江蘇(海門、徐州)、海南(澄邁、三亞)和貴州(貴陽)7個(gè)省份，共采集了704份新鮮羊糞便樣本，每份樣品分成3份，分別用于顯微鏡檢測，DNA提取和長期保存(置于2.5%重鉻酸鉀溶液中4 ℃保存)。

1.2 DNA提取

使用糞便基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.A Stool DNA kit，OMEGA，America)進(jìn)行糞便樣品DNA的提取。取約200 mg糞便樣品至2 mL離心管中，之后嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作，最后將提取的樣品置于-20 ℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增與測序

基于芽囊原蟲SSU rDNA位點(diǎn)，參照Scicluna 等[14]的方法對樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參照Stensvold 等[13]建立的方法對ST3和ST4進(jìn)行 MLST(multilocus-sequence typing)多位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。所有陽性樣品PCR產(chǎn)物送至北京諾賽基因有限公司，用ABI PRISMTM3730 XL DNA測序儀進(jìn)行測序。

1.4 序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析

對測序結(jié)果進(jìn)行拼接校對后，在NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。使用MEGA 7.0 (http://www.megasoftware.net)軟件并采用鄰接算法 (Neighbor-Joining，NJ)、自展值為1 000、Kimura-2參數(shù)模型基于芽囊原蟲SSU rDNA序列構(gòu)建種系發(fā)育系統(tǒng)進(jìn)化樹。此外，通過芽囊原蟲序列分型數(shù)據(jù)庫(www.pubmlst.org/blastocystis)對ST3和ST4的等位基因進(jìn)行鑒定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(http://www.winwrap.com/)。采用 χ2檢驗(yàn)分析不同地區(qū)羊和不同品種羊之間芽囊原蟲感染率的差異，P<0.05 表明差異顯著，P<0.01表明差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 芽囊原蟲感染率

在704份羊糞便樣本中，芽囊原蟲陽性樣品為94份，總感染率為13.35%(94/704)。其中，河南、遼寧、青海、吉林、江蘇、海南和貴州省的總感染率分別為17.61%(53/301)、27.27%(12/44)、21.43%(9/42)、 17.54%(10/57)、2.5%(3/120)、8.05%(7/87)和0(0/53)。各地區(qū)之間感染率差異極顯著(P<0.01)，結(jié)果見表1。

表1 不同地區(qū)羊芽囊原蟲的感染情況和亞型分布

本研究中共涉及8個(gè)山羊品種，感染率為11.11%(39/351)，6個(gè)綿羊品種，感染率為15.58%(55/353)。發(fā)現(xiàn)兩品種之間感染率差異極顯著(P<0.01)。 山羊中感染率最高的為絨山羊66.67%(2/3)，但樣品量太少，不具代表性。其次為奶山羊和波爾山羊，感染率分別為16.67%(9/54)和16.48%(15/91)。努比亞山羊感染率為0，這是唯一沒有檢測到芽囊原蟲的品種。綿羊中涉及的主要品種為湖羊，感染率為12.5%(26/208)，這與總體感染水平相當(dāng)。

2.2 芽囊原蟲亞型分型與系統(tǒng)發(fā)育分析

基于SSU rDNA位點(diǎn)通過NCBI的BLAST工具對各個(gè)地區(qū)羊源芽囊原蟲序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，94份 芽囊原蟲陽性樣品中，共檢測到5個(gè)亞型。ST3(共2份)中2份與MN526781(GenBank序列號)100%相似，且與3個(gè)人源ST3分離株位于同一進(jìn)化支上。ST4(共9份)中4份與AY244621 100%相似，3份與MH127488 100%相似，2份與MH127500 100%相似，且與3個(gè)人源ST4分離株位于同一進(jìn)化支上。ST5(共7份)中3份與MK937752 100%相似，3份與MF186709 100%相似，1份與MK937752達(dá)到99%以上的相似，但發(fā)生了個(gè)別堿基的突變，且與1個(gè)人源ST5分離株位于同一進(jìn)化支上。ST10(共68份)中的40個(gè)樣品的序列與MN526919 100%相似，14份與MK930358 100%相似，9份與MK937750 100%相似，1份與MN338085 100%相似，其余4份分別與MK937750(2份)、MN526919(1份)、MT042814(1份)達(dá)到99%以上的相似，但發(fā)生了個(gè)別堿基的突變。ST14(共8份)中5份與MN526815 100%相似，2份與MH807188 100%相似，1份與MF186707達(dá)到99%以上的相似，但發(fā)生了個(gè)別堿基的突變。

在本研究中共檢測到5種亞型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中，ST10為優(yōu)勢亞型，占總陽性數(shù)的72.34%(68/94)，其次是ST4和ST14，分別占總陽性數(shù)的9.57%(9/94)和8.51%(8/94)。河南羊芽囊原蟲檢測到5種亞型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，是亞型種類最豐富的地區(qū)。在遼寧、青海、吉林、江蘇、海南樣品中分別檢測到2種(ST10和ST14)、2種(ST5和ST10)、2種(ST5和ST10)、3種(ST4、ST10和ST14)、3種(ST4、ST5和ST10)基因亞型。

2.3 芽囊原蟲ST3和ST4等位基因和MLST分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)ST3樣品均為Allele 38，且在位點(diǎn)Locus 2和Locus 4發(fā)生了堿基突變。9個(gè)ST4 樣品中有4個(gè)Allele 42，2個(gè)Allele 92，3個(gè)Allele 94。ST3的SSU rDNA位點(diǎn)序列與之前報(bào)道的序列(MN526781)完全匹配，但在多位點(diǎn)分析中發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)了突變，在Locus 2位點(diǎn)與Allele 23相比有2個(gè)堿基的突變(A240G和C246T)，在Locus 4位點(diǎn)與Allele 41相比有個(gè)7個(gè)堿基的突變(分別是G61A、G235T、T260A、A338G、G396T、T422G和T460C)。但由于芽囊原蟲MLST研究相關(guān)數(shù)據(jù)較少，暫無法進(jìn)一步分析。

表2 不同品種羊芽囊原蟲的感染情況和亞型分布

▲. 本研究的代表序列▲. The representative sequence of this study圖1 基于SSU rDNA基因位點(diǎn)的芽囊原蟲亞型系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Blastocystis subtypes based on SSU rDNA gene locus

表3 ST3不同基因位點(diǎn)序列分析結(jié)果

3 討 論

芽囊原蟲是一種分布廣泛的腸道原生生物，最近的基因組數(shù)據(jù)揭示了其潛在的毒力因子可能損害腸道屏障功能[15]。已經(jīng)從鳥類、豬、牛、羊、野生食肉動(dòng)物、非人靈長類、嚙齒類動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物和昆蟲等體內(nèi)檢測或分離到芽囊原蟲[16]。由于人類感染與各種哺乳動(dòng)物和鳥類接觸有關(guān)，芽囊原蟲被認(rèn)定為潛在的人畜共患病原[17]。已有報(bào)道顯示，我國人與動(dòng)物的芽囊原蟲感染普遍[18]。本次研究中芽囊原蟲總感染率為13.35%(94/704)，遠(yuǎn)低于2017年Song 等[19]報(bào)道陜西部分地區(qū)的58.05%(458/789)以及2020年謝世臣等[20]報(bào)道云南部分地區(qū)的41.35%(375/907)，高于2018年Li等[21]報(bào)道(安徽、江蘇、山東和河南)的3.22%(52/1 613)以及2018年Wang等[11]報(bào)道黑龍江地區(qū)的4.92%(6/122)，與2019年鄭玲[22]報(bào)道(河南、貴州、陜西、遼寧、內(nèi)蒙古和新疆)的11.98%(112/935)感染率相當(dāng)。目前，已有羊源芽囊原蟲感染報(bào)道共涉及11個(gè)省區(qū)(安徽、貴州、河南、黑龍江、江蘇、遼寧、內(nèi)蒙古、山東、陜西、新疆和云南)，感染率前3的為陜西54.03%(463/857)，云南41.35%(375/907)，內(nèi)蒙古39.13%(9/23)，但內(nèi)蒙古的樣本量較少。唯一沒有芽囊原蟲陽性的為新疆(共409份樣品)。本調(diào)查中共涉及7個(gè)省份，其中，青海、吉林、海南和貴州的羊源芽囊原蟲感染情況為首次報(bào)道。本次調(diào)查，來自貴陽的53份羊糞便樣品中均未發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲。

本研究中在不同地區(qū)共檢測到5種亞型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中，ST3、ST4和ST5為人獸共患亞型。ST10為感染羊的優(yōu)勢亞型，這與已知報(bào)道一致。從宿主的種屬特異性分析，羊?qū)儆谂？苿?dòng)物，而?？苿?dòng)物的優(yōu)勢亞型也為ST10，這也說明芽囊原蟲屬雖然具有廣泛的宿主適應(yīng)性，但在亞型水平上，也有明顯的宿主特異性。本次調(diào)查首次在國內(nèi)綿羊體內(nèi)檢測到ST3亞型。ST1～ST4是人類中普遍存在的亞型，這4個(gè)亞型占比超過90%[23]，尤其ST3，是人源芽囊原蟲最常見亞型。

MLST是一種相對較新的序列差異分析方法，芽囊原蟲的MLST研究有助于人們了解其表型和基因型之間的聯(lián)系，等位基因的不同可能會解釋芽囊原蟲不同分離株的致病性差異。在已知報(bào)道中人類最常見的ST3等位基因型為ST3-Allele 34，其占比在70%以上[24]。有報(bào)道顯示檢測到一種與蕁麻疹患者顯著相關(guān)的等位基因(ST3-Allele 34)，因此，該等位基因可能具有一定的臨床意義[25-26]。Pea等[27]報(bào)道在腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)患者中檢測到ST4-Allele 42，這也是最常見的ST4等位基因。Melo等[28]報(bào)道在蕁麻疹患者體內(nèi)檢測到ST1 (a4)、ST2 (a9和a12)、ST3 (a3、a36和a37)、ST4 (a42和a92)和ST6 (a122)。此外，Taghipour等[29]在結(jié)核患者中發(fā)現(xiàn)ST1-Allele 4。本研究為國內(nèi)第一個(gè)羊芽囊原蟲的MLST研究。本次調(diào)查所檢測到的2個(gè)ST3樣品均為Allele 38，9個(gè)ST4 樣品中有4個(gè)Allele 42、2個(gè)Allele 92和3個(gè)Allele 94?；蛐秃团R床癥狀之間的關(guān)系仍需要積累大量芽囊原蟲的MLST數(shù)據(jù)才能作出科學(xué)的判斷。Stensvold等[13]建立并應(yīng)用ST3和ST4 MLST多位點(diǎn)分析方法發(fā)現(xiàn)，ST3的人類分離株僅限于發(fā)育進(jìn)化樹四個(gè)分支中的一個(gè)(除了與非人靈長類密切接觸的飼養(yǎng)者等人群)，這表明ST3具有相對較高的宿主特異性，人ST3感染主要是由人傳人引起的，而人類分離株落入其他分支極大概率是人畜共患傳播的結(jié)果。本研究中ST4的MLST多位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果不理想，Ertug等[30]的報(bào)道中也提到過相同的問題，這可能與引物的擴(kuò)增效率有關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)的部分羊源人獸共患亞型可能存在同樣的情況，飼養(yǎng)者與羊長期密切接觸導(dǎo)致芽囊原蟲跨越人畜的隔離而適應(yīng)不同宿主。同時(shí)，有研究曾在處理過的廢水中發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲，顯示這種類型的灌溉水有向下游農(nóng)田傳播病原微生物的潛在作用[31]，這解釋了飲用非自來水人群的高感染率，對該病原的預(yù)防提出了警示，而羊場的糞污對周圍水源及環(huán)境的影響可能是潛在的風(fēng)險(xiǎn)因素。利用MLST對芽囊原蟲進(jìn)行分型將有助于人們更好地了解芽囊原蟲的多樣性，并評估MLST技術(shù)在臨床中鑒別病原重要變異的潛力。

雖然芽囊原蟲是導(dǎo)致腹瀉的病原之一，但本次調(diào)查中羊糞便樣本中腹瀉樣品占比極小，且腹瀉羊和未腹瀉羊在芽囊原蟲檢出率和基因型的分布上無顯著差異。從目前已有的報(bào)道來看芽囊原蟲分布廣泛，但感染動(dòng)物很少發(fā)病，提示芽囊原蟲為一個(gè)機(jī)會致病性原蟲，滕雪嬌[32]等報(bào)道HIV-RNA病毒載量>50 copies·mL-1(χ2=9.561,P<0.05)是HIV攜帶者感染人芽囊原蟲的危險(xiǎn)因素。雖然與隱孢子蟲、賈第蟲相比，芽囊原蟲致病性更弱，對動(dòng)物的危害很小，但在人病例報(bào)道中，芽囊原蟲與腹瀉、腹痛、腸易激綜合征、炎性腸病、蕁麻疹等有一定的關(guān)聯(lián)，所以其更重要的意義在于人獸共患風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，芽囊原蟲能改變宿主不同種腸道菌群的相對豐度，這對宿主間接產(chǎn)生何種影響還有待進(jìn)一步探究。

本次調(diào)查共鑒定出芽囊原蟲的5種亞型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中，人獸共患亞型3種(ST3、ST4和ST5)，提示了羊源芽囊原蟲潛在的人獸共患傳播風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)引起人們的足夠重視。本研究結(jié)果補(bǔ)充了羊源芽囊原蟲流行資料和我國不同地區(qū)芽囊原蟲感染分布的數(shù)據(jù)庫，為芽囊原蟲的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

調(diào)查的7個(gè)省芽囊原蟲總感染率為13.35%(94/704)，感染普遍，序列分析共發(fā)現(xiàn)5個(gè)亞型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中，ST3、ST4和ST5為人獸共患基因亞型，具有遺傳多樣性，應(yīng)給予足夠重視。